Summary
نحن هنا تصف الرواية مقايسة لرصد امتصاص بريون والاتجار بها من قبل خلايا المناعة فورا بعد التلقيح داخل الصفاق عن طريق تنقية والتوسيم fluorescently قضبان بريون مجمعة من المواد في المخ المصابة ثم رصد واستيعاب الحركة من موقع الحقن وتتميز الخلايا التوسط في هذه الأحداث.
Abstract
شكل وجود بروتين بريون الشاذ المضيف ترميز (PrPC) التي يتم البروتيني مقاومة ، ومرضية معدية يميز الأمراض البريونية مثل مرض الهزال المزمن (CWD) من cervids وسكرابي في الأغنام. فرضية بريون تؤكد أن هذا غير طبيعي الملتزم يشكل معظم أو كل من بريون المعدية. لقد كان دور جهاز المناعة في الأحداث في وقت مبكر المرضية بريون الطرفية مقنع لCWD و 1-3 سكرابي. وكشفت الصيدلانية المعدلة وراثيا والدراسات على الفئران دورا هاما في نظام المتممة في الاحتفاظ بها وتكرارها البريونات في وقت مبكر بعد الإصابة 4-6. في التجارب المختبرية والدراسات المجراة وقد لاحظ أيضا الاحتفاظ بريون بواسطة الخلايا الجذعية 7-10 ، على الرغم من أن دورها في الاتجار غير المشروع لا يزال يتضح 11-16. الضامة وبالمثل تورطت في بريون المرضية في وقت مبكر ، ولكن هذه الدراسات ركزت على الأحداث التي وقعت بعد اسابيع من العدوى 3،11،17. هذه الدراسات السابقة تعاني أيضا من مشكلة التمييز بين الذاتية وبي ار بي سي البريونات المعدية. نحن هنا وصف نصف كمي ، ونهج غير متحيز لتقييم امتصاص بريون والاتجار بها من موقع التطعيم من قبل خلايا المناعة المعينين هناك. وتنقية قضبان بريون مجمعة من الدماغ جناسة المصابين solubilization المنظفات غير مجمعة البروتينات وتنبيذ فائق من خلال وسادة السكروز. بولي أكريلاميد الكهربائي للهلام ، coomassie الزرقاء تلطيخ والغربية النشاف الانتعاش مؤكدة قضبان بريون عالي التخصيب في كسر مكعبات. وكانت قضبان بريون ملون تألقي المسمى intraperitoneally ثم حقنه في الفئران. بعد ساعتين كان يعاير الخلايا المناعية من السوائل غسيل البريتوني والطحال والغدد الليمفاوية والمنصف للاحتفاظ المساريقي قضيب بريون وفرعية الخلية التي حددتها التدفق الخلوي متعدد الألوان باستخدام علامات لحيدات ، العدلات ، والخلايا الجذعية ، والضامة وباء ، والخلايا التائية. يسمح هذا الاختبار لرصد أول مرة مباشرة من الحصول على الخلايا المناعية والبريونات الاتجار في الجسم الحي في غضون ساعات بعد الإصابة. هذا الاختبار أيضا يفرق بوضوح المعدية ، والبريونات مجمعة من PrPC أعرب عن عادة على الخلايا المضيفة ، والتي يمكن أن يكون صعبا ويؤدي إلى مشاكل تفسير البيانات في أنظمة الفحص الأخرى. ويمكن تكييف هذا البروتوكول إلى طرق التلقيح الأخرى (في الوريد عن طريق الفم ، وintranervous تحت الجلد ، على سبيل المثال) والمستضدات (الخرز مترافق ، ومسببات الأمراض البكتيرية والفيروسية والطفيلية والبروتينات ، والبيض) كذلك.
Protocol
1. تنقية وصفها قضبان بريون
ويتم تكييف هذا البروتوكول من 18 نشرت سابقا
- 100 غرام من التجانس بريون المصابين أنسجة المخ في 900 مل من الجليد الباردة العازلة المجانسة (HB ، 1X PBS تحتوي على 320 السكروز مم ، 150 مم وكلوريد الصوديوم EDTA 4mM) 1 دقيقة في السرعة القصوى في خلاط التجارية ، ثم 2 دقيقة على الجليد. كرر ثلاث مرات.
- جناسة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 3000 XG و 4 درجات مئوية. إزالة وحفظ طاف على الجليد. اعادة تعليق بيليه في HB 1L وكرر الخطوات من 1.1 و 1.2.
- supernatants سباحة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في XG 100000 ، 0 درجة مئوية. تجاهل طاف.
- اعادة تعليق بيليه مخزنة في 100 مل من تريس 1X المالحة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، كلوريد الصوديوم 0.1 ملم و 1 ملي EDTA) التي تحتوي على 2 ٪ تريتون X - 100 (TBST). ويقدر تركيز البروتين من برادفورد أو فحص وضبط مماثلة إلى 5 ملغ / مل في TBST. البرد على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في XG 100000 ، 0 درجة مئوية. تجاهل طاف مع بيليه وغسل TBST مل 100 مل (50) ثم TBS. اعادة تعليق بيليه في برنامج تلفزيوني 1X 100 مل تحتوي على 1 ٪ و sarcosyl كوكتيل مثبط البروتياز ويقلب لمدة 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- طبقة العينة على 900 مل من السكروز ملي 320 والطرد المركزي لمدة 60 دقيقة في XG 100000 ، و 10 درجة مئوية. تجاهل طاف واعادة تعليق بيليه في 10 مل كلوريد الصوديوم 2.3M ، sarcosyl 5 ٪.
- يصوتن عينة 5 × 40 ثانية في القوة القصوى 70 ٪ في فترات دقيقة 1 على الجليد.
- قسامة 1 مل من العينة في أنابيب الطرد المركزي وإيبندورف لمدة خمس عشرة دقيقة في XG 13000 ، 4oC. غسل الكريات مرتين مع TBS وتخزين @ -70 درجة مئوية أو المتقارن لملون تألقي في الخطوة 1.9.
- ملون تألقي المتقارن 1 أنبوب تنقية بريون باستخدام قضبان من 1 فيال DyLight 649 وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
- تبادل العازلة العلامات DyLight لبرنامج تلفزيوني عن طريق الغسيل الكلوي أو عن طريق الطرد المركزي تصفية الأعمدة. متجر في 20 ميكرولتر aliquots في -70 درجة مئوية بعيدا عن الضوء حتى جاهزة للاستخدام.
2. التلقيح بريون والاسترداد الخليوي
هذا القسم يشمل التلقيح داخل الصفاق بريون واسترداد خلايا من الغشاء البريتوني ، والعقد اللمفاوية ومنصفي المساريقي والطحال.
- تمييع قضبان بريون الفلورسنت 01:50 في برنامج تلفزيوني مباشرة قبل الاستعمال. الماوس القفا من الرقبة الفراء الظهرية مع الإبهام والسبابة ، بدوره الماوس برفق لمواجهة بينك وكبح جماح الاصبع الخنصر مع الذيل. يبسط الماوس ، رفع الجذع الخلفية فوق رأسه ، وعقد معه قليلا رأسا على عقب.
- استخدام حقنة الانسولين 30G ، وضخ 100 ميكرولتر من قضبان بريون الفلورسنت 1 سم من خط الوسط الجانبي والأمامي إلى 1-2 سم المشتركة العجزي الحرقفي. تضاف 1 سم الإبرة من خلال الجلد 45 درجة توجيه إعلامي. استخدام 1:50 التخفيف من الخرز الفلورسنت وحدها أو في برنامج تلفزيوني كما الضوابط. احتضان الفئران عن الوقت المخصص له قبل التحليل.
- الموت ببطء الفئران وفقا لرعاية الحيوان وافقت لجنة استخدام البروتوكولات. ضخ 10 مل من برنامج تلفزيوني في التجويف البريتوني باستخدام حقنة مل 12 و 25G إبرة. صخرة الذبيحة طوليا برفق لمدة دقيقة واحدة. استرداد تعليق خلية من البريتوني باستخدام الحقنة نفسها و16G إبرة في أنبوب 15 مل المخروطية والاحتياطي على الجليد بينما تشريح الجثة لا يزال مستمرا.
- الرطب الجانب البطنية من الذبيحة تماما مع الايثانول 70 ٪. رفع الجلد في خط الوسط أسفل القفص الصدري مع ملقط وقطع صغيرة من خلال شق الجلد مع المقص. بدءا هناك ، وجعل شق الطول 3-5 طويلة عبر الجلد من في كلا الاتجاهين على الرأس والذيل ، ثم اثنين 2 سم ، والشقوق من خط الوسط أفقيا من كل طرف. قشر الظهر ودبوس للجلد للكشف عن تجاويف البريتوني والقفص الصدري. قطع بعناية من خلال أغشية رقيقة شفافة المحيطة الصفاق وتعكس الصدر للكشف عن المنصف.
- العثور على وإزالة العقد اللمفية المنصفية 2-4 ، الظهرية قليلا أفقيا والمناطق المتاخمة لالغدة الصعترية ، المتاخمة للإعلامي الشريان العضدي الرأسي ، بالقرب من الجانب البطنية من القصبة الهوائية. العثور على وإزالة ما يصل إلى ستة الغدد الليمفاوية المساريقي ، جزءا لا يتجزأ من النسيج المساريقي البيضاء الناعمة التي المراسي الأمعاء لجدار البطن الخلفي. العثور على وإزالة الطحال ، ومظلمة طويلة الجهاز الأحمر الموجود الوحشي فقط من خط الوسط وظهري إلى الأمعاء على الجانب الأيمن من البطن. الغدد الليمفاوية الاحتياطي في 1 مل المتوسط 1640 RPMI على الجليد حتى اكتمال التشريح.
- أضعف الصحافة والعقد الليمفاوية من خلال مصفاة شبكة 40 ميكرومتر إلى 3 مل من RPMI في طبق بتري بلاستيكية باستخدام المكبس من حقنة 1 مل. شطف المصفاة مع مل 2 إضافية من RPMI ونقل الخلية 5 مل تعليق لأنبوب مخروطي 15 مل. شطف طبق بيتري مع 5 مل من RPMI إضافية ونقل في أنبوب واحد. الطرد المركزي 5 دقائق عند 250 XG ، تجاهل طاف ، وإعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل العازلة FACS (1X PBS ، 1 ٪ ألبومين المصل البقري و 10 ملي EDTA) ونقل الى أنبوب 1.5 مل إيبندورف.
ما يلي هو بروتوكول نموذجي لتحديد تلطيخ فرعية الخلايا المناعية باستخدام أجسام مضادة ضد الفلورسنت جيدة تتميز المناعة علامات سطح الخلية. وكانت مخففة عن الأجسام المضادة في FACS العازلة مباشرة قبل الاستعمال.
- عدد الخلايا والخلايا قسامة 10 6 إيبندورف في أنابيب. خلايا جهاز الطرد المركزي (انظر 2.7) ، ويغسل بيليه 2X مع 1 مل FACS العازلة.
- احتضان خلايا 20 دقيقة على الجليد في 100 ميليلتر من 2 نانوغرام / مل الفئران الفأر CD16/32 المضادة لمستقبلات القطعة Fc كتلة الذاتية. بيليه وغسل خلايا العازلة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- إضافة 100 ميكرولتر من 1ng / مل المناسبة الفلورسنت المنشأ (ذ) antibod لكل عينة واحتضان على الثلج لمدة ساعة واحدة. إضافة 100 ميكرولتر من FACS العازلة للخلايا وحده السيطرة. بيليه والخلايا يغسل مرتين مع العازلة FACS.
- اعادة تعليق الخلايا في ACK العازلة 1 مل (150 ملي NH 4 CL ، 1 ملم KHCO 3 و 0.1 ملي EDTA) احتضان على الجليد لمدة 1 دقيقة إلى ليز خلايا الدم الحمراء. بيليه وغسل خلايا العازلة مع نظام مراقبة الأصول الميدانية. اعادة تعليق الخلايا في 1 مل FACS العازلة.
- جمع البيانات من الخلايا باستخدام عداد الكريات تدفق قادرة على الكشف والتحليل متعدد الألوان ، وعادة مع الليزر 405 ، 488 و 633 نانومتر ، والإثارة 09:55 كشف الانبعاثات مضان.
4. ممثل النتائج :
نحن تنقية قضبان بريون من الخام ، وبريون المصابين جناسة الدماغ (الشكل 1) ومنظفات solubilization تنبيذ فائق من الدماغ جناسة E2 الأيائل (حارات 1 و 2) المخصب بدرجة كبيرة لقضبان بريون (قارن الممرات 1 و 3) ، والذي كان أيضا بروتياز K مقاومة (حارة 4). ومن المثير للاهتمام ، عسر الهضم عرض قضبان بريون المنقى التشكيل glycoform مماثلة لافت للنظر لهضم E2 جناسة الدماغ ، مما يشير لتخصيب اليورانيوم المثيرة البريونات. أنتجت مماثل لمعاملة جناسة الدماغ العادي لا PK المقاوم بي ار بي سي (حارات 5 و 6).
تحليل تدفق السكان cytometric خلية معينة تثبت أن مستضد تقديم الخلايا موطنا لالبريتوني ساعتين والاحتفاظ الخرز الفلورسنت وقضبان بريون ، كما يتضح من مضان زادت بشكل كبير خلال الضوابط PBS حقن (الشكل 2). لم تحصد من الخلايا في الغشاء البريتوني في برنامج تلفزيوني عرض ضوابط المعالجة أعلاه مضان الخلفية (الشكلان 2A - G) ، بينما الخلايا من حبة (الشكلان 2H - N) وبريون (الشكلان 2O - U) - تلقيح الفئران مضان عرض كبيرة ، خصوصا على حيدات (الشكلان 2I و ف) ، والخلايا الجذعية (الشكلان 2k و R) والضامة (الشكلان 2L و S) ، وبعض العدلات (2J الشكل وس) والخلايا أقل B (2T الشكل). كما عثر على حبة وبريون الحاملة للحيدات ، الخلايا الجذعية والضامة في العقد اللمفية المنصفية ساعتين بعد التلقيح (الشكلان 2AD وبنادق ، وصباحا وAF AG وAN التوالي) ، بينما عدد قليل أو أي بي ار بي CWD الحاملة العدلات ، تم العثور على خلايا T باء أو هناك (الشكلان 2AE و آل ، ه وAG ومنظمة العفو الدولية وأب ، على التوالي). اكتشاف أننا لم الخرز أو قضبان بريون في الطحال أو الغدد الليمفاوية المساريقي (لا تظهر البيانات). جملة وتفصيلا ، وهذه البيانات تظهر أن الخلايا المناعية حركة البريونات مشابه جدا لمستضدات الجسيمات الأخرى.
| الكاشف | ملون تألقي | LASER الإثارة (نانومتر) | PEAK الانبعاثات (نانومتر) |
| بريون قضبان | DyLight 649 | 633 | 674 |
| 1 ميكرون الخرز | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| الأضداد | |||
| CD11b | eFluor 450 | 405 | 450 |
| فيكوإيريترين - Cy7 | 488 | 760 | |
| CD11c | R - فيكوإيريترين | 488 | 575 |
| فيكوإيريترين - Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | R - فيكوإيريترين | 488 | 575 |
| CD21 | DyLight 488 | 488 | 518 |
| B220 | Allophycocyanin - Cy7 | 633 | 785 |
| CD3 | R - فيكوإيريترين | 488 | 575 |
الشكل 1. تنقية بريون من قضبان جناسة الدماغ المصابة. استخدمنا الدماغ الخام 10 ٪ من الغزلان جناسة CWD المصابة (E2 ، الممرات 1and 2) وبدءا من المواد التي نحن تنقية قضبان بريون مجمع (حارات 3 و 4). وأظهرت كل من المواد الخام وتنقيته المقاومة المميزة للبروتياز K العلاج (حارات 1 -- 4) ، في حين العادي جناسة الدماغ لا (حارات 5 و 6). وتظهر علامات الوزن الجزيئي بالدينار إلى اليسار من وصمة عار. BH ، جناسة الدماغ.
الشكل 2. تحليل تدفق cytometric من البريونات الاتجار المناعي خلايا من الصفاق إلى الغدد الليمفاوية المنصفية ساعتين بعد التلقيح. PBS (لوحات وAG AB - V) ، والخرز فلوري (HN وAC - AI) أو قضبان بريون (OU وAJ AP -) كانت حقنها في الصفاق من الفئران والخلايا المأخوذة من السائل غسيل البريتوني (الاتحاد الافريقي) أو الغدد الليمفاوية المنصفية (V - AP) بعد ساعتين. الرسوم البيانية في خلايا العمود العرض الاول من الفئران التي عولجت مع برنامج تلفزيوني (الألواح ألف والخامس) ، والخرز الفلورسنت (لوحة (H) و AC) وقضبان بريون (لوحات وAJ O). يتم رسم الخلايا فلوري (بقع حمراء أو خضراء) ، ومجموع الخلايا (النقاط الرمادية) لإظهار الحجم النسبي (مبعثر إلى الأمام) ، تحبب (مبعثر الجانب) ، ونسبة الخلايا الحية الإجمالي الذي يتألق. الاحتفاظ بأعداد كبيرة من الخلايا المحببة حبات من سمات الفلورسنت وقضبان. وكانت ملطخة أيضا الخلايا مع أجسام مضادة ضد المناعي علامات سطح الخلية وبوابات للLYG - Ly6C + حيدات (لوحات B ، I ، P ، W ، AD والعدالة والتنمية) ، Ly6c - CD11c - CD11b + Ly6G + العدلات (C ، J ، Q ، X ، AE و آل) ، Ly6G - Ly6C - CD11b + CD11c + الخلايا الجذعية (D ، K ، R ، Y ، AF وAM) ، Ly6G - Ly6C - CD11c - CD11b + الضامة ، (E ، L ، S ، Z AG ، وAN) ، CD3 B220 - CD21 + + الخلايا البائية (F ، M ، T ، AA ، ه وAO) و CD21 - B220 - CD3 + الخلايا التائية (G ، N ، U ، AB ، منظمة العفو الدولية وCNN). احتفظ حيدات ، الضامة ، والخلايا الجذعية الخرز الفلورسنت وقضبان بريون في التجويف البريتوني (لوحات وأنا P ، K و L و R و S على التوالي) ونقلهم إلى العقد اللمفية المنصفية (لوحات ميلادي وبنادق ، وصباحا وAF AG وAN ، على التوالي) ، مما يدل على امتصاص مماثلة والاتجار بها هذه الجسيمات اثنين. احتفظ العدلات كمية كبيرة من الخرز (J) وعدد أقل من قضبان (س) ، لكنه فشل في إيصالها إلى الغدد الليمفاوية (AE و آل). احتفظت خلايا باء ونقل بعض قضبان (تي وAO) ، ولكن عمليا لا الخرز (M وه). الخلايا التائية المتجر لا حبات ولا قضبان (N ، U ، منظمة العفو الدولية وCNN).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا يبرهن على وجود علامات وبروتوكول للالبريونات تتبع في الجسم الحي الذي يسهل كثيرا رصد الأحداث في وقت مبكر من العدوى بريون الطرفية. هذا البروتوكول يحسن إلى حد كبير على المحاولات السابقة في امتصاص بريون الرصد في المختبر 9 و 3،12 في الجسم الحي ما قبل وضع العلامات قيحة بريون عالي التخصيب للتمييز نحو لا لبس فيه من بي ار بي سي المحلية. لأن البريونات المعدية وجيم بي ار بي تشترك في نفس تسلسل الأحماض الأمينية الأساسية ، وقد تم توليد أجسام مضادة محددة بريون إشكالية. وقد أجرينا تجارب مماثلة باستخدام الفئران الخالية بي ار بي حقنوا PK - هضمها والميثانول الخام عجلت الدماغ جناسة أننا تتبعها باستخدام Dylight 649 - labelelled مكافحة بي ار بي الأضداد (البيانات المتوفرة لدينا غير منشورة). أنتجت هذه التجارب نتائج متطابقة تقريبا كما هو موضح هنا ، ولكن الفئران بي ار بي فارغة ليست متاحة تجاريا ، وليس عرضة للمرض بريون 19 و تفتقر إلى حسن النية فقط مستقبلات البريونية المعروفة ، بي ار بي سي. هذا البروتوكول يسمح للاستخدام المشترك سلالات الفأر المختبرات التي تعبر عن الذاتية بي ار بي سي ، تفادي المشاكل المحتملة باستخدام الفئران الخالية بي ار بي.
البيانات التي تظهر هنا يشير إلى أن القبض على الخلايا المناعية والبريونات المرور والخرز الفلورسنت وبالمثل ، على الرغم من تحديد الخلايا البائية والاتجار في السابق ولكن ليس هذا الأخير. هذا يعزز دراسات سابقة تورط خلايا B والمتاجرين بريون 6. ومع ذلك ، وإعداد لدينا بريون عالي التخصيب يحتوي على كميات ضئيلة من المرجح إضافية المسمى البروتينات ، لذلك لا نستطيع أن نستبعد احتمال أن الخلايا المناعية حركة هذه البروتينات أيضا. إذا كانت كميات صغيرة جدا من البروتينات تلويث أو تغيير الاتجار بريون يحاكي السيناريو الحقيقي البيولوجي لا يزال يتعين تحديدها.
رصد خلايا مناعية الناجح الجسيمات two الاتجار مختلفة تقترح التي يمكن تكييفها لهذا البروتوكول مجموعة واسعة من مولدات المضادات التي يمكن أن تكون موسومة وتتبعها ، مثل الطفيليات والبكتيريا والفيروسات والبروتينات.
عند تنفيذ الخطوات تنبيذ فائق في هذا البروتوكول ، يمكن aliquoted حجم عينة كبيرة إلى أصغر الطرد المركزي لمناسبة ما دام النسب تظل ثابتة. على سبيل المثال ، بدلا من الطبقات 100 مل من العينة على السكروز مل 900 ، يمكن للمرء أن طبقة 10 مل أكثر من 90 مل في أنابيب منفصل ، ثم الطرد المركزي.
رفع الماوس الخلف خلال التطعيمات التحركات الأمامية أجهزة البريتوني ، والتقليل من الإصابات العرضية إبرة لهم. ببطء وبحذر عند ادخال الإبر بتلقيح الفئران عن طريق الحقن والشفط وPBS من البريتوني لتجنب تمزق هذا الغشاء الحساس.
عند تشريح الفئران ، والحرص على خفض فقط على الرغم من أن الجلد في شقوق الأولية ، وترك غشاء رقيق يغطي الصفاق والمنصف على حالها ، لتجنب قطع الأوعية الدموية والأجهزة التي قد تتداخل مع تحديد العقدة الليمفاوية واسترجاعها.
الغدد الليمفاوية يمكن أن يكون من الصعب تحديد البداية ، وتبحث في كثير من الأحيان مثل الأنسجة الدهنية. الغدد الليمفاوية تظهر الجولة تقريبا ، من البيض إلى كريم ملون وأكثر ثباتا من الأنسجة الدهنية. هذه أصبحت أسهل بكثير لتحديد مع الممارسة. الغدد الليمفاوية تجمع من اثنين على الأقل من الفئران لاسترداد خلايا كافية لإجراء تحليلات تدفق cytometric.
لتحديد علامات متعددة في وقت واحد سطح الخلية ، ونحن نوصي بشدة باستخدام الأجسام المضادة الفلورسنت أكثر من الأجسام المضادة غير المسماة التي تتطلب الثانوية الفلورية مكافحة isotype الأجسام المضادة للكشف ، والتصميم التجريبي الأخير يتطلب الاختيار الدقيق للأضداد المتولدة من أنواع متعددة والعديد من عينات مراقبة إضافية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر McBryant ستيف وجيف هانسن للحصول على مساعدة تنبيذ فائق وكايزر باتي للمساعدة في التعامل مع الفأرة. المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية في المعاهد الوطنية للصحة ، ومنحة 5R01NS056379 - 02 تمول هذا العمل.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
- Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
- Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
- Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
- Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
- Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
- Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
- Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
- Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
- Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
- Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
- Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
- Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
- Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
- Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
- Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
- Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
- Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
- Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
- Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).
