Summary
Здесь мы опишем новый тест для мониторинга поглощения прионов и торговли иммунными клетками сразу же после внутрибрюшинного прививки, очищая и флуоресцентно маркировки агрегированных стержней прионов из инфицированного материала мозг, то контроль за их поглощения и движение от места инъекции и характеризующие клетки посредническую этих событий.
Abstract
Наличие ненормальной форме хост в кодировке прионных белков (PrPC), которые устойчивы протеазы, патологических и инфекционных характеризует прионных заболеваний, таких как хроническая изнуряющая болезнь (УХО) в cervids и скрепи у овец. Прионы гипотеза утверждает, что это ненормальное конформера составляет большую часть или все инфекционных прионов. Роль иммунной системы в ранние события в периферийных патогенеза прионных было убедительно продемонстрировано УХО и скрепи 1-3. Трансгенные и фармакологические исследования на мышах показали важную роль системы комплемента в сохранении и репликация прионов в ранние сроки после инфекции 4-6. В пробирке и в естественных исследованиях также наблюдается прионных удержания дендритные клетки 7-10, хотя их роль в торговле остается неясно 11-16. Макрофаги подобным же образом были замешаны в начале патогенеза прионных, но эти исследования были сосредоточены на событиях, происходящих недель после заражения 3,11,17. Эти предыдущие исследования, также страдают от проблемы различия между эндогенными PrP C и инфекционные прионы. Здесь мы опишем полуколичественного, непредвзятый подход для оценки поглощения прионов и торговли от прививки сайт иммунными клетками работу там. Агрегированные стержней прионов были очищены от инфицированных гомогената мозга моющее средство солюбилизации неагрегированном белков и ультрацентрифугирования через сахарозы подушке. Полиакриламидном геле, Кумасси синим окрашиванием и западных промокательной подтвердил восстановления обогащенного прионных стержней в гранулированной фракции. Прионы стержни флуорохромом меченных затем вводили внутрибрюшинно мышам. Через два часа иммунных клеток из перитонеального лаважа жидкости, селезенки и средостения и брыжеечные лимфатические узлы были исследованы на прион удержания стержня и клеточных подмножеств, определенных многоцветной проточной цитометрии с использованием маркеров для моноцитов, нейтрофилов, дендритные клетки, макрофаги и В и Т-клеток. Этот анализ позволяет впервые прямой мониторинг иммунных клеток приобретения и торговли прионов в естественных условиях в течение нескольких часов после заражения. Этот анализ также четко различает инфекционных, агрегированные прионы из PrPC обычно выражается на клетки-хозяина, который может быть сложным и привести к интерпретации данных проблем в других системах анализа. Этот протокол может быть адаптирован для других маршрутов прививки (устный, внутривенно, intranervous и подкожно, например) и антигенов (сопряженных бусы, бактериальных, вирусных и паразитарных патогенов и белки, яйцо), а также.
Protocol
1. Очищающий и маркировки Прион стержни
Этот протокол адаптирован от одного ранее опубликованной 18
- Однородный 100 граммов прион-инфицированные ткани головного мозга в 900 мл ледяной гомогенизации буфера (HB, 1X PBS содержащей 320 мМ сахарозы, 150 мМ NaCl и 4 мм ЭДТА) 1 мин при максимальной скорости в коммерческих блендере, затем 2 мин на льду. Повторите три раза.
- Центрифуга гомогената в течение 10 мин при 3000 мкг и 4 ° C. Удалить супернатант и сохранить на льду. Повторное приостановить пеллет в 1л HB и повторите шаги с 1.1 и 1.2.
- Бассейн супернатанты и центрифуги в течение 60 мин при 100 000 мкг, 0 ° C. Удалите супернатант.
- Повторное приостановить гранул в 100 мл 1X Трис солевой буфер (10 мМ Трис-HCl, 0.1 мМ NaCl и 1 мМ ЭДТА), содержащий 2% Тритон Х-100 (TBST). Оценка концентрации белка в Брэдфорд или аналогичного анализа и настроить до 5 мг / мл в TBST. Холод на льду в течение 30 мин.
- Центрифуга течение 30 мин при 100 000 мкг, 0 ° C. Удалите супернатант и мыть гранул 50 мл TBST затем 100 мл TBS. Повторное приостановить гранул в 100 мл 1X PBS, содержащем 1% sarcosyl и коктейль ингибиторов протеаз и движение в течение 120 мин при 37 ° C.
- Слой образца на 900 мл 320 мМ сахарозы и центрифуги в течение 60 мин при 100 000 мкг, 10 ° C. Удалите супернатант и вновь приостановить гранул в 10 мл 2,3 M NaCl, 5% sarcosyl.
- Разрушать ультразвуком образца 5 х 40 секунд при 70% максимальной мощности при 1 мин интервалы на льду.
- Алиготе 1 мл образца в пробирки Эппендорф и центрифуги в течение пятнадцати минут при 13000 мкг, 4 °. Вымойте гранулы дважды TBS и хранить @ -70 ° C или сопряженных с флуорохромом в шаге 1.9.
- Сопряженных 1 тюбик очищенной прионных стержней с использованием 1 флакон DyLight 649 флуорохромом согласно протоколу производителя.
- Биржа DyLight маркировки буфер для PBS путем диализа или центрифугирования через фильтр столбцов. Хранить в 20 мкл аликвоты при -70 ° C вдали от света, пока готов к использованию.
2. Прививка Прион и восстановления клеток
Этот раздел включает в себя внутрибрюшинного прививки прионов и восстановления клеток от брюшины, средостения и брыжеечных лимфатических узлов и селезенки.
- Развести флуоресцентные стержней прионных 1:50 в ФСБ непосредственно перед использованием. Scruff мыши, спинной меха шеи с большим и указательным пальцами, осторожно поверните мышь к лицу вам и сдерживать хвост с мизинец. Супинировать мыши, поднимая задние туловище над головой и держали его чуть с ног на голову.
- Использование шприца 30G инсулина, вводят 100 мкл флуоресцентного стержней прионных 1 см латеральнее средней линии и 1-2 см впереди крестцово-подвздошных сочленений. Вставьте иглу 1 см через кожу направлено 45 ° медиально. Используйте 1:50 разбавление флуоресцентные шарики или PBS только в качестве контроля. Инкубируйте мышей для отведенное время перед проведением анализа.
- Усыпить мышей в соответствии с утвержденными по уходу за животными и использовать комитета протоколов. Inject 10 мл ФСБ в брюшную полость, используя 12 мл шприца и иглы 25G. Осторожно туши продольно в течение одной минуты. Восстановление клеточной суспензии из брюшины, используя тот же шприц и иглу 16G в 15 мл коническую трубку и резерв на льду при вскрытии туш продолжается.
- Влажные брюшной стороне каркаса тщательно с 70% этанола. Поднимите кожи на средней линии чуть ниже грудной клетки с щипцами и вырезать небольшой разрез через кожу с помощью ножниц. Начиная там, сделать 3-5 см в длину разрез через кожу в обоих направлениях, чтобы голова и хвост, затем два 2-см разрез от средней линии в сторону от каждого конца. Пил назад и контактный кожи выявить перитонеальные и грудной полостей. Аккуратно вырежьте через тонкие полупрозрачные мембраны, окружающие брюшины и отражают грудной клетки, чтобы выявить средостения.
- Найти и удалить 2-4 лимфоузлов средостения, слегка спинной и с боков, прилегающих к тимус, медиально, прилегающих к брахиоцефальных артерий, вблизи брюшной стороне трахеи. Найти и удалить до шести брыжеечных лимфатических узлов, встроенных в мягкой белой ткани брыжеечных, что якоря кишечника задней брюшной стенки. Найти и удалить селезенку, длинный, темно-красный орган, расположенный как раз латеральнее средней линии и спинной в кишечник на левой стороне живота. Резервный лимфатических узлов в 1 мл RPMI 1640, на льду до вскрытия завершена.
- Размочите и нажмите лимфатических узлов через 40 мкм сито петли на 3 мл RPMI в пластиковых чашках Петри, используя поршень в 1 мл шприца. Промойте фильтр с еще 2 мл RPMI и передачи 5 мл клеточной суспензии в 15 мл коническую трубку. Полоскание чашки Петри с дополнительным 5 мл RPMI и трансфер в той же трубе. Центрифуга 5 мин при 250 мкг, отбросить супернатант, вновь приостановить осадок клеток в 1 мл FACS буфером (1х PBS, 1% бычьего сывороточного альбумина и 10 мМ ЭДТА) и трансфер в 1,5 мл трубки Эппендорф.
Ниже приведен типичный протокол окрашивания для выявления иммунных подмножествах ячейку с помощью флуоресцентных антител против хорошо изученных иммунных маркеров на клеточной поверхности. Все антитела разводили в буфер FACS непосредственно перед употреблением.
- Граф клетки и аликвоты 10 6 клеток в пробирки Эппендорф. Центрифуга клеток (см. п. 2.7) и мыть гранул 2 раза с 1 мл буфера FACS.
- Инкубируйте клетки 20 минут на льду в 100 мкл 2 нг / мл крысы антимышиным CD16/32 блокировать эндогенных рецепторов Fc. Гранул и промыть клетки с буфером СУИМ.
- Добавить 100 мкл 1ng / мл соответствующие флуоресцентные antibod (у) х годов к каждому образцу и инкубировать на льду в течение одного часа. Добавить 100 мкл FACS буфера только для управления клетками. Гранул и промыть клетки дважды буфера FACS.
- Повторное приостановить клеток в 1 мл ACK буфера (150 мМ NH 4 Cl, 1 мМ KHCO 3 и 0,1 мМ ЭДТА) Инкубируйте на льду в течение 1 мин для лизиса эритроцитов. Гранул и промыть клетки с буфером СУИМ. Повторное приостановить клеток в 1 мл буфера FACS.
- Сбор данных из ячеек с помощью проточного цитометра способны многоцветной обнаружения и анализа, как правило, с 405, 488 и 633 нм возбуждения лазеров и 9:55 флуоресценции детекторов излучения.
4. Представитель Результаты:
Мы очищенной прионных стержней из сырой, прион-инфицированных гомогената головного мозга (рис. 1) растворение моющего средства и ультрацентрифугирования из Е2 лося гомогената мозга (дорожки 1 и 2) значительно обогатили для прионных стержней (сравните полосы 1 и 3), который также был протеазы К устойчивы (дорожка 4). Интересно, что непереваренные очищенные стержни прионных отображается glycoform профиля поразительно похожи на переваривается гомогената мозга Е2, что указывает на драматический обогащения для прионов. Одинаково обработанных нормальным гомогената мозга не дали PK-устойчивые PrP C (полосы 5 и 6).
Проточной цитометрии анализа конкретных популяций клеток показали, что антиген представляющих клеток домой брюшины на два часа и сохранить флуоресцентные бусы и прионных стержней, о чем свидетельствуют резко возросло флуоресценции по PBS вводят элементы управления (рис. 2). Нет клеток, полученных из брюшины ФСБ обработанных управления отображается флуоресценции выше фона (рис. 2A-G), тогда как клетки от борта (рис. 2H-N) и прионов (рис. 2 O-U)-прививку мышей отображается значительные флуоресценции, особенно на моноциты (рис. 2I и Р), дендритные клетки (рис. 2K и R) и макрофагов (рис. 2 л и S), а некоторые Нейтрофилы (рис. 2J и Q) и меньшее количество В-клеток (рис. 2Г). Бусы и прионных несущих моноциты, дендритные клетки и макрофаги были обнаружены и в лимфатические узлы средостения через два часа после прививки (рис. 2AD и АК, А. Ф. и А. М. и А. Г. и, соответственно), в то время мало или совсем нет PrP УХО несущих Нейтрофилы , В или Т-клетки были найдены (рис. 2AE и AL, AH и А. Г. и А. И. и П., соответственно). Мы не обнаружили бусы или прион стержней в селезенке или брыжеечных лимфатических узлов (данные не приведены). В целом, эти данные показывают, что иммунные клетки прионы движения очень похоже на другие антигены частиц.
| РЕАГЕНТ | Флюорохром | Лазерного возбуждения (нм) | Максимум излучения (нм) |
| Прионы стержней | DyLight 649 | 633 | 674 |
| 1 мкм бисером | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| Антитела | |||
| CD11b | eFluor 450 | 405 | 450 |
| Фикоэритрин-Cy7 | 488 | 760 | |
| CD11c | R-фикоэритрин | 488 | 575 |
| Фикоэритрин-Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | R-фикоэритрин | 488 | 575 |
| CD21 | DyLight 488 | 488 | 518 |
| B220 | Allophycocyanin-Cy7 | 633 | 785 |
| CD3 | R-фикоэритрин | 488 | 575 |
Рисунок 1. Очистка прионных стержней из зараженных гомогената мозга. Мы использовали 10% гомогената сырой мозг от УХО-инфицированных оленей (E2, дорожки 1 и 2) в качестве исходного материала, из которого мы очищенной агрегированных стержней прион (полосы 3 и 4). Оба сырой и очищенной материалов наблюдались характерные сопротивления протеазы К лечению (дорожки 1 - 4), в то время как нормальные гомогената мозга нет (полосы 5 и 6). Молекулярные маркеры веса приведены в Kd слева от пятна. BH, гомогената мозга.
Рисунок 2. Проточной цитометрии анализа иммунных клетках торговли прионы из брюшины в лимфатические узлы средостения через два часа после прививки. PBS (панели AG и V-AB), флуоресцентные шарики (HN и AC-AI) или Прион стержней (OU и AJ-AP) были вводится в брюшину мышей и клеток, полученных из перитонеального лаважа жидкости (АС) или лимфатические узлы средостения (V-AP), через два часа. Графики в первой колонке показывают клетки мышей, получавших PBS (панели и V), флуоресцентные шарики (панель H и переменного тока) и прионных стержней (панели вывода и AJ). Флуоресцентные клеток (красные или зеленые точки) и общего числа клеток (серых точек) приведены, чтобы показать относительный размер (вперед разброс), детализации (боковой разброс) и доля от общего числа живых клеток, которые светятся. Значительное число клеток, характерных гранулоцитов сохранена флуоресцентные бусы и стержней. Клетки также окрашивали антителами против иммунных клеток поверхностных маркеров и закрытого для LyG-Ly6C + моноцитов (панели В, I, P, W, А. Д. и А. К.), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + нейтрофилов (C, J, Q, X, А. Е. А. Л.), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + дендритных клеток (D, К, Р, У, Ф. и А. М.), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + макрофаги, (E, L, S, Z, А. Г. и), CD3 -B220 + CD21 + B-клеток (F, M, T, AA, AH и АО) и CD21-B220-CD3 + Т-клеток (G, N, U, А. Б., А. И. и П.). Моноциты, дендритные клетки и макрофаги сохранил флуоресцентные бусы и прионных стержней в брюшной полости (панели я и P, K и R и L и S, соответственно) и перевезли их в лимфатические узлы средостения (панели AD и АК, А. Ф. и А. М. и А. Г. и, соответственно), демонстрируя подобный поглощения и оборота этих двух частиц. Нейтрофилы сохранил значительное количество шариков (J) и меньшее количество стержней (Q), но не смогли доставить их в лимфатические узлы (А. Е. и А. Л.). В-клетки сохраняются и транспортируются некоторые стержни (Т и АО), но практически не бусин (М и АГ). Т-клетки торговли ни бисером, ни стержни (N, U, А. И. и П.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь показано, протокол для маркировки и отслеживания прионов в естественных условиях, что значительно облегчает мониторинг ранних событий в периферической инфекции прион. Этот протокол значительно повышает на прошлых попытках мониторинга поглощения прионов в пробирке 9 и в естественных условиях 3,12 по предварительной маркировке обогащенного прионных посевной однозначно отличить его от эндогенных PrP C. Потому что инфекционные прионы и PrP C одни и те же первичной аминокислотной последовательности, генерируя прион-специфических антител был проблематичным. Мы провели аналогичные эксперименты с использованием PrP нулевых мышей вводили PK-переваривается и метанола осажденный сырой гомогената мозга, которые мы отслеживаются с помощью Dylight 649-labelelled анти-PrP антителами (наши неопубликованные данные). Эти эксперименты дали почти идентичные результаты, как показано здесь, но PrP нулевых мышей не являются коммерчески доступными, не восприимчивы к прионных болезней 19 и отсутствие только добросовестных рецепторов прионных известно, PrP C. Этот протокол позволяет использование общих лабораторных мышей штаммами, которые выражают эндогенных PrP C, что исключает возможные проблемы на мышах PrP нулевой.
Данные, приведенные здесь, показывают, что иммунные клетки и захвата трафика прионы и люминесцентные бусины аналогично, хотя В-клетки были идентифицированы, как торговля первых, но не последним. Это подтверждает предыдущие исследования причастности В-клетки, как прионных торговцев 6. Тем не менее, наши высоко обогащенного прионных подготовки вероятно, содержит незначительное количество дополнительных меченых белков, поэтому мы не можем исключить возможность того, что иммунная трафика клетках эти белки тоже. Будь очень небольшое количество загрязняющих белков прионов изменить людьми или имитирует истинную биологическую сценарий еще предстоит определить.
Успешный контроль иммунной торговли клетки двух различных частиц также предлагает, чтобы этот протокол может быть адаптирован для широкого спектра антигенов, которые могут быть помечены и отслеживается, например, паразитов, бактерий, вирусов и белков.
При выполнении ультрацентрифугирования шаги в этом протоколе, большие объемы образца может быть аликвоты на более мелкие для удобного центрифугирования тех пор, пока отношения остаются неизменными. Например, вместо того, чтобы слои 100 мл образца более 900 мл сахарозы, можно было бы слой 10 мл по 90 мл в отдельных трубках, затем центрифуги.
Подъемные мышь сзади во время прививки движется вперед перитонеального органов, сводя к минимуму случайной травмы иглой к ним. Медленно и осторожно вставить иглы, когда прививки мышей и инъекционных и аспирационных PBS из брюшины, чтобы избежать разрыва этой тонкой мембраной.
При вскрытии мышей, позаботиться, чтобы сократить только через кожу в первоначальный разрез, оставив тонкие оболочки, покрывающей брюшины и средостения нетронутыми, чтобы избежать сокращения кровеносных сосудов и органов, которые могут помешать лимфатических узлов идентификации и поиска.
Лимфатических узлов может быть трудно определить на начальном этапе, часто похожий жировой ткани. Лимфатические узлы появляются почти круглые, от белого до кремового цвета и тверже, чем жировая ткань. Они становятся гораздо проще идентифицировать себя с практикой. Бассейн лимфатических узлов, по крайней мере две мыши, чтобы восстановить достаточно клеток для проточной цитометрии анализа.
Для одновременного определения нескольких маркеров клеточной поверхности, мы настоятельно рекомендуем использовать флуоресцентные антитела более немеченого антитела, которые требуют вторичного флуоресцентного анти-изотипа антител для обнаружения, так как последний опытно-конструкторских требует тщательного отбора антител генерируется из нескольких видов и многие другие дополнительные контрольные образцы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Стива McBryant и Джефф Хансен за помощь в ультрацентрифугирования и Патти Кайзер за помощью мыши обработки. Национального института неврологических заболеваний и инсульта в Национальном институте здоровья, грант 5R01NS056379-02 финансируемой этой работы.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
- Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
- Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
- Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
- Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
- Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
- Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
- Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
- Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
- Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
- Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
- Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
- Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
- Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
- Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
- Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
- Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
- Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
- Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
- Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).
