Summary
כאן אנו מתארים assay הרומן לניטור ספיגת הפריון וסחר על ידי תאים חיסוניים מיד לאחר חיסון intraperitoneal ידי מטהרים fluorescently תיוג מוטות הפריון מצטבר חומר במוח נגועים אז ניטור ספיגת שלהם תנועה מאתר ההזרקה ואפיון התאים לתווך את האירועים הללו.
Abstract
נוכחות של צורה חריגה חלבון מארח בקידוד Prion (PrPC) כי הוא פרוטאז עמידים, פתולוגיים ו זיהומיות המאפיינת מחלות Prion כגון מחלות כרוניות בזבוז (CWD) של cervids ו scrapie בכבשים. ההשערה Prion טוען כי זה לא נורמלי conformer מהווה רוב או את כל הפריון זיהומיות. תפקידה של המערכת החיסונית באירועים מוקדם בפתוגנזה הפריון היקפי הודגמה באופן משכנע עבור CWD ו scrapie 1-3. טראנסגנטי ו תרופתי מחקרים בעכברים גילה תפקיד חשוב של המערכת משלים שמירה פריונים משכפלים מוקדם לאחר ההדבקה 4-6. במבחנה במחקרים vivo הבחינו גם שימור הפריון על ידי תאים דנדריטים 7-10, למרות תפקידם בסחר נשאר ברור 11-16. המקרופאגים יש דומה היה מעורב בפתוגנזה הפריון מוקדם, אך מחקרים אלה התמקדו אירועים המתרחשים שבועות לאחר ההדבקה 3,11,17. אלה מחקרים קודמים גם סובלים מבעיה של הבחנה בין אנדוגני PRP C ו פריונים זיהומיות. כאן אנו מתארים גישה semiquantitative, משוחדת להערכת ספיגת הפריון וסחר מהאתר חיסון על ידי תאים חיסוניים גייסו שם. מוטות הפריון המצטברים היו מטוהרים מן homogenate המוח נגוע solubilization ניקוי שאינם מצטברים חלבונים ultracentrifugation באמצעות כרית סוכרוז. ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide, coomassie מכתים כחול המערבי התאוששות אישרו סופג מוטות הפריון מועשר בשבריר pelleted. מוטות Prion היו intraperitoneally מוזרק אז fluorochrome שכותרתו לעכברים. שעתיים אחר כך תאים חיסוניים מנוזל שטיפה פריטוניאלית טחול, ובלוטות לימפה mediastinal ו mesenteric היו assayed עבור החזקת הפריון מוט תת תא מזוהה על ידי זרימת cytometry ססגוניות באמצעות סמנים עבור מונוציטים, נויטרופילים, התאים הדנדריטים, מקרופאגים ו-B ותאי T. Assay זה מאפשר ניטור הפעם הראשונה הישירה של תאים חיסוניים רכישה פריונים סחר in vivo בתוך שעות לאחר ההדבקה. Assay זה גם ברור מבדיל זיהומיות, פריונים מצטבר של PrPC לידי ביטוי בדרך כלל על תאים המארח, אשר יכול להיות קשה להוביל לבעיות נתונים לפרשנות במערכות assay אחרים. פרוטוקול זה ניתן להתאים מסלולים חיסון אחר (דרך הפה, דרך הווריד, intranervous ואת תת עורי, למשל) ואת אנטיגנים (חרוזים מצומדות, פתוגנים חיידקיים, נגיפיים טפילי וחלבונים, ביצה) וכן.
Protocol
1. טיהור וסימון מוטות Prion
פרוטוקול זה מותאם מאחד 18 שפורסם בעבר
- Homogenize 100 גרם של רקמות נגועות הפריון המוח 900 מ"ל של חיץ קרים שמאחד (HB, 1X PBS סוכרוז המכיל 320 מ"מ, 150 מ"מ ו 4 מ"מ EDTA NaCl) 1 דקות במהירות המרבית בבלנדר מסחרי, ואז 2 דק 'על הקרח. חזור שלוש פעמים.
- צנטריפוגה homogenate דקות 10 XG ב 3000 ו 4 ° C. הסר ולשמור supernatant על הקרח. Re-להשעות גלולה ב 1 ליטר HB וחזור על שלבים 1.1 ו -1.2.
- בריכת supernatants ו צנטריפוגות במשך 60 דקות על 100,000 XG, 0 ° C. בטל supernatant.
- Re-להשעות גלולה ב 100 מ"ל של 1X טריס בופר סליין (10 mM טריס-HCl, 0.1 mM NaCl ו 1 mM EDTA) המכיל 2% Triton X-100 (TBST). חלבון הערכת הריכוז על ידי ברדפורד או assay דומה ולהתאים 5 מ"ג / מ"ל ב TBST. צ'יל על קרח למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה למשך 30 דקות ב 100.000 XG, 0 ° C. בטל supernatant ולשטוף עם גלולה TBST 50 מ"ל אז 100 מ"ל כפות. Re-להשעות גלולה של 100 מ"ל 1X PBS sarcosyl המכיל 1% ו מעכב פרוטאז קוקטייל ומערבבים 120 דקות ב 37 ° C.
- שכבה על מדגם של 900 מ"ל סוכרוז 320 מ"מ צנטריפוגות במשך 60 דקות על 100,000 XG, 10 ° C. בטל supernatant מחדש להשעות גלולה ב 10 מ"ל 2.3M NaCl, sarcosyl 5%.
- Sonicate 5 מדגם x 40 שניות בהספק המרבי 70% במרווחים של 1 דק 'על הקרח.
- 1 מ"ל של Aliquot מדגם לתוך צינורות Eppendorf ו צנטריפוגות במשך חמש עשרה דקות 13,000 XG, 4oC. שטפו פעמיים עם כדורי כפות ולאחסן @ -70 ° C או המצומד אל fluorochrome בשלב 1.9.
- המצומד 1 שפופרת של מטוהרים באמצעות מוטות הפריון 1 בקבוקון של 649 DyLight fluorochrome על פי פרוטוקול של היצרן.
- שערי DyLight חיץ תיוג עבור PBS על ידי דיאליזה או צנטריפוגה באמצעות עמודות לסנן. חנות ב 20 aliquots μL ב -70 ° C מן האור עד מוכן לשימוש.
2. Prion הרכבת חיסון ושחזור Cell
סעיף זה כולל בתוכו חיסון הפריון intraperitoneal והתאוששות של תאים הצפק, בלוטות הלימפה mediastinal ו mesenteric והטחול.
- מדולל מוטות הפריון פלורסנט 01:50 ב PBS מיד לפני השימוש. עכבר בעורפו על ידי הפרווה הצוואר הגב עם האגודל והאצבע המורה, להפוך את העכבר בעדינות אל פנים אותך ואת לרסן את הזנב עם אצבע הזרת. Supinate העכבר, הרמת פלג הגוף העליון האחוריות מעל הראש ומחזיקה אותו מעט כלפי מטה.
- באמצעות מזרק אינסולין 30G, להזריק 100 μL של מוטות הפריון פלורסנט 1 ס"מ לרוחב של קו האמצע ו 1-2 ס"מ קדמית למפרק הע"כ. הכנס את המחט 1 ס"מ דרך העור ביים 45 ° מדיאלית. השתמש 1:50 דילול של חרוזים פלורסנט או PBS לבד כפקדי. דגירה עכברים לזמן המוקצב לפני ניתוח.
- להרדים עכברים על פי טיפול בבעלי חיים מאושרים להשתמש בפרוטוקולים הוועדה. הזרק 10 מ"ל של PBS לתוך חלל הצפק באמצעות מזרק 12 מ"ל ו 25 גרם מחט. בעדינות רוק פגר longitudinally למשך דקה אחת. שחזור ההשעיה התא הצפק באמצעות מזרק אותה מחט 16G לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל ובמילואים על הקרח בזמן דיסקציה הפגר ממשיך.
- רטוב הצד הגחוני של הפגר ביסודיות עם אתנול 70%. הרם את העור על קו האמצע ממש מתחת בית החזה עם מלקחיים ולחתוך חתך קטן דרך העור עם מספריים. החל שם, לעשות חתך 3-5 ס"מ דרך העור מפני בשני הכיוונים ראש וזנב, ולאחר מכן שני 2 ס"מ חתכים של קו האמצע רוחבית מקצה אחד. פיל לאחור להצמיד את העור כדי לחשוף את הבטן ואת החזה חללים. בזהירות לחתוך את קרום שקוף דק המקיף את הצפק ומשקפים את בית החזה כדי לחשוף את חלל החזה.
- מצא ולהסיר 2-4 בלוטות הלימפה mediastinal, הגב מעט וסמוך רוחבית של התימוס, סמוך מדיאלית אל העורק brachiocephalic, ליד הצד הגחוני של קנה הנשימה. מצא ולהסיר עד שש בלוטות לימפה mesenteric, משובצות ברקמה רכה mesenteric הלבן עוגנים המעיים אל דופן הבטן האחורי. מצא ולהסיר את הטחול, איבר ארוך, אדום כהה ממוקם לרוחב רק של קו האמצע ועל הגב למעי בצד השמאלי של הבטן. בלוטות הלימפה ריזרב 1 בינוני מ"ל 1640 RPMI על הקרח עד לנתיחה תושלם.
- מרוכך ולחץ בלוטות הלימפה דרך מסננת רשת 40 מיקרומטר תוך 3 מ"ל של RPMI בצלחת פטרי מפלסטיק באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ"ל. לשטוף עם מסננת מ"ל 2 נוסף של RPMI ולהעביר את 5 תא ההשעיה מ"ל לצינור חרוטי 15 מ"ל. יש לשטוף את צלחת פטרי עם 5 מ"ל נוספים של RPMI והעברת צינור זהה. צנטריפוגה 5 דק 'ב 250 XG, להשליך supernatant, מחדש להשעות את התא גלולה ב 1 מ"ל FACS חיץ (1X PBS, 1% אלבומין בסרום שור ו 10 mM EDTA) ומעבירים צינור Eppendorf 1.5 מ"ל.
להלן פרוטוקול מכתים טיפוסי לזיהוי תת תא החיסון באמצעות נוגדנים נגד ניאון היטב מאופיין סמנים משטח החיסונית התא. הנוגדנים כולם היו בדילול למאגר FACS מיד לפני השימוש.
- ספירת תאים ו -10 aliquot 6 תאים לתוך צינורות Eppendorf. צנטריפוגה תאים (ראו 2.7) ולשטוף גלולה 2X עם חיץ 1 FACS מ"ל.
- דגירה תאים 20 דקות על קרח μL 100 של העכבר אנטי 2 ng / mL עכברוש CD16/32 לחסום קולטנים Fc אנדוגני. גלולה ותאי לשטוף עם חיץ FACS.
- הוספת 100 μL של 1ng / mL המתאים פלורסנט antibod (Y) ies לטעום כל לדגור על קרח למשך שעה אחת. הוספת 100 μL של חיץ FACS לבד לתאי הבקרה. גלולה ותאי לשטוף פעמיים עם חיץ FACS.
- Re-להשעות תאים חיץ 1 ACK מ"ל (150 מ"מ NH 4 Cl, 1 mM KHCO 3 ו - 0.1 mM EDTA) לדגור על קרח דק 1 עד lyse כדוריות דם אדומות. גלולה ותאי לשטוף עם חיץ FACS. Re-להשעות תאים חיץ 1 FACS מ"ל.
- איסוף נתונים מן התאים באמצעות זרם cytometer מסוגל זיהוי וניתוח ססגוניות, בדרך כלל עם 405, 488 ו - 633 עירור לייזרים ננומטר 09:55 גלאי פליטת הקרינה.
4. נציג תוצאות:
אנו מטוהרים מוטות הפריון מ גולמי, הפריון נגועים homogenate המוח (איור 1) solubilization דטרגנט ו ultracentrifugation של איילים E2 homogenate במוח (מסלולים 1 ו -2) העשירו מאוד עבור מוטות Prion (להשוות מסלולים 1 ו - 3), אשר היה גם פרוטאז K עמיד (מסלול 4). מעניין, לא מעוכל מוטות הפריון מטוהרים מוצג פרופיל glycoform דומה להדהים homogenate מתעכל במוח E2, המציין העשרה דרמטי עבור פריונים. זהים שטופלו homogenate מוח נורמלי לא הניבה שום קי עמיד PRP C (נתיבי 5 ו -6).
ניתוח תזרים cytometric של אוכלוסיות תאים ספציפיים להוכיח כי התאים המציגים אנטיגנים הביתה הצפק על ידי שעתיים לשמור חרוזים ומוטות ניאון Prion, כפי שמעידים הקרינה גדל באופן דרמטי על שולטת PBS מוזרק (איור 2). לא התאים שנקטפו מן הצפק של PBS שטופלו שולטת מוצגים פלואורסצנטי מעל הרקע (איורים 2A-G), ואילו התאים חרוז (איורים 2H-N) הפריון (איורים 2O-U)-מחוסן עכברים מוצג הקרינה משמעותית, בעיקר על מונוציטים (איורים 2i ו-P), תאים דנדריטים (איורים 2k ו R) ומקרופגים (איורים 2L ו-S), וכמה נויטרופילים (איור 2J ו-Q) ותאי B פחות (2T איור). חרוז Prion נושאות מונוציטים, תאים דנדריטיים ומקרופגים נמצאו גם את בלוטות הלימפה mediastinal שעתיים לאחר חיסון (איורים 2AD ו AK, AF ו - AM ו AG ו -, בהתאמה), בעוד מעט או לא PRP CWD נושאות נויטרופילים , בתאי B או T נמצאו שם (איורים 2AE ו AL, AH ו AG ו-AI ו AP, בהתאמה). גילינו שאין חרוזים או מוטות הפריון הטחול או בלוטות לימפה mesenteric (מידע לא מוצג). בשנת טוטו, נתונים אלו מראים כי תאים חיסוניים תנועה פריונים מאוד דומה אנטיגנים חלקיקים אחרים.
| מגיב | FLUOROCHROME | עירור לייזר (ננומטר) | שיא הפליטה (ננומטר) |
| Prion מוטות | DyLight 649 | 633 | 674 |
| 1 מיקרומטר חרוזים | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| נוגדנים | |||
| CD11b | eFluor 450 | 405 | 450 |
| Phycoerythrin-Cy7 | 488 | 760 | |
| CD11c | R-Phycoerythrin | 488 | 575 |
| Phycoerythrin-Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | R-Phycoerythrin | 488 | 575 |
| CD21 | DyLight 488 | 488 | 518 |
| B220 | Allophycocyanin-Cy7 | 633 | 785 |
| CD3 | R-Phycoerythrin | 488 | 575 |
באיור 1. טיהור של מוטות הפריון מ homogenate במוח נגועים. השתמשנו במוח של 10% homogenate גולמי צבי CWD נגועים (E2, נתיבי 1and 2) כמו התחלה החומר שממנו אנו מטוהרים מוטות הפריון מצטברים (מסלולים 3 ו -4). שני גולמי וחומרי מטוהרים הראה התנגדות מאפיין פרוטאז K הטיפול (נתיבי 1 - 4), ואילו homogenate מוח נורמלי לא (נתיבי 5 ו -6). סמנים משקל מולקולרי מוצגים Kd משמאל כתם. BH, homogenate המוח.
איור 2. ניתוח תזרים cytometric פריונים של תאים חיסוניים סחר מ הצפק לבלוטות הלימפה mediastinal שעתיים לאחר חיסון. PBS (לוחות AG ו-V-AB), חרוזי ניאון (ח"נ ו AC-AI) או מוטות Prion (OU ו AJ-AP) היו מוזרק הצפק של עכברים לתאים שנקטפו מן נוזל שטיפה פריטוניאלית (AU) או בלוטות הלימפה mediastinal (V-AP) כעבור שעתיים. גרפים במופע התאים הראשונים בטור מן העכברים שטופלו PBS (פאנלים ו-V), חרוזי ניאון (פאנל H ו-AC) ומוטות Prion (לוחות O ו AJ). תאים פלורסנט (נקודות אדומות או ירוקות) ותאי הכולל (נקודות אפורות) הם זממו להראות גודלו היחסי (פיזור קדימה), גרעיניות (פיזור צד) ואת חלקם של תאים חיים הכולל לזרוח. מספר רב של תאים אופייני גרנולוציטים שמר חרוזים ומוטות ניאון. תאים הוכתמו גם עם נוגדנים כנגד החיסון משטח סמנים התא מגודרת עבור LyG-Ly6C + מונוציטים (לוחות B, I, P, W, AD ו AK), Ly6c-CD11c-CD11b + Ly6G + נויטרופילים (C, J, Q, X, AE ואל), Ly6G-Ly6C-CD11b + CD11c + תאים דנדריטים (D, K, R, Y, AF ו - PM), Ly6G-Ly6C-CD11c-CD11b + מקרופאגים, (E, L, S, Z, AG ו), CD3 -B220 + CD21 + B-תאים (F, M, T, AA, AH ו AO) ו CD21-B220-CD3 + ותאי T (G, N, U, AB, ו-AI AP). מונוציטים, תאים דנדריטיים ומקרופגים שמר חרוזים ומוטות ניאון הפריון של חלל הצפק (פאנלים אני ו-P, K ו-R ו-L ו-S בהתאמה) והעבירו אותם לבלוטות הלימפה mediastinal (לוחות לספירה ו AK, AF ו - AM ו AG וכן, בהתאמה), הוכחת ספיגת סחר דומים של שני חלקיקים. נויטרופילים שמר כמות משמעותית של חרוזים (J) ומוטות פחות (Q), אך לא הצליחו לספק להם בלוטות הלימפה (AE ו AL). בתאי B שמרו והעבירו כמה מוטות (T ו-AO), אך כמעט ללא חרוזים (M ו-AH). בתאי T נסחרות לא חרוזים ולא מוטות (N, U, ו-AI AP).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאן אנו מדגימים פרוטוקול תיוג פריונים מעקב in vivo זה מאוד מקל על ניטור אירועים בתחילת זיהום הפריון היקפי. פרוטוקול זה משפר באופן משמעותי על ניסיונות העבר על ספיגת הפריון ניטור במבחנה 9 ו - in vivo על ידי 3,12 inoculum מראש תיוג הפריון מועשר באופן חד משמעי כדי להבדיל אותו מן אנדוגני PRP C. מכיוון פריונים זיהומיות PRP C לחלוק אותו רצף יסודי חומצת אמינו, יצירת נוגדנים ספציפיים הפריון כבר בעייתי. ביצענו ניסויים דומים באמצעות עכברים PRP null הזריקו PK-מתעכל מתנול זירז homogenate המוח גולמי שאנחנו מעקב באמצעות Dylight 649-labelelled אנטי PRP נוגדנים (נתונים שלא פורסמו שלנו). ניסויים אלה הניבו תוצאות כמעט זהה, כפי שמוצג כאן, אבל PRP עכברים null אינם זמינים מסחרית, לא רגישים מחלות הפריון 19 וחוסר הקולטן בתום הפריון רק בתום ידוע, PRP C. פרוטוקול זה מאפשר שימוש משותף עכבר מעבדה זנים המבטאים אנדוגני PRP C, obviating הבעיות הפוטנציאליות באמצעות עכברים PRP null.
הנתונים המוצגים כאן עולה כי ללכוד תאים חיסוניים פריונים תנועה חרוזי ניאון דומה, אם כי תאים B זוהו סחר לשעבר, אך לא האחרון. זה מאשש מחקרים קודמים תאים B כמו להפליל סוחרי הפריון 6. עם זאת, הכנה מועשר שלנו הפריון סביר מכיל כמויות זעירות של חלבונים שכותרתו נוספים, כך שאנחנו לא יכולים לשלול את האפשרות כי תאים חיסוניים אלו חלבונים תנועה מדי. אם כמויות קטנות מאוד של חלבונים מזהמים לשנות סחר הפריון או מחקה את התרחיש הביולוגי האמיתי עדיין לא נקבע.
ניטור מוצלח של מערכת החיסון שני תאים וחלקיקים סחר שונים עוד עולה כי בפרוטוקול זה ניתן להתאים למגוון רחב של אנטיגנים כי יכול להיות מתויג מסומנים, כמו טפילים, חיידקים, וירוסים וחלבונים.
בעת ביצוע צעדים ultracentrifugation בפרוטוקול זה, כרכים מדגם גדול יכול להיות aliquoted כדי קטנות עבור צנטריפוגה נוח כל עוד יחסי נשארים קבועים. לדוגמה, במקום שכבות 100 מ"ל של המדגם על פני 900 מ"ל סוכרוז, אפשר שכבה מעל 10 מ"ל 90 מ"ל ב צינורות נפרדים, אז צנטריפוגות.
הרמת עכבר בדיעבד במהלך החיסונים נעה איברים הצפק anteriorly, מזעור פגיעה מחט מקרית להם. לאט לאט ובזהירות להכניס מחטים כאשר inoculating עכברים הזרקת ו aspirating PBS מ הצפק כדי למנוע פקיעת הקרום העדין הזה.
כאשר מנתחים עכברים, לטפל לחתוך רק אם העור החתכים הראשונית, עוזב את קרום דק המכסה את הצפק ואת חלל החזה תקין, כלי הדם, כדי למנוע חיתוך איברים כי עלולים להפריע לזיהוי לימפה הצומת ואחזור.
בלוטות הלימפה יכול להיות קשה לזהות בתחילה, לעתים קרובות נראה כמו רקמה שומנית. בלוטות הלימפה להופיע כמעט עגול, מחוץ לבן בצבע קרם ו תקיף יותר מאשר רקמת שומן. אלה הופכים הרבה יותר קל להזדהות עם תרגול. בלוטות הלימפה בריכת מן לפחות שני עכברים להתאושש מספיק תאים עבור ניתוחים תזרים cytometric.
עבור זיהוי בו זמנית מספר רב של סמנים פני התא, אנו ממליצים בחום באמצעות נוגדנים ניאון מעל נוגדנים ללא תווית הדורשים נוגדנים משני ניאון אנטי אלוטיפ לגילוי, כמו עיצוב ניסיוני האחרון דורש בחירה זהירה של נוגדנים הנוצרים ממינים רבים רבים דגימות יותר שליטה נוספת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים סטיב McBryant וג'ף הנסן לעזרה עם ultracentrifugation ופאטי קייזר לעזרה בטיפול העכבר. המכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ במכון הלאומי לבריאות בארה"ב, להעניק 5R01NS056379-02 מימנה את העבודה הזאת.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
- Klein, M. A. A crucial role for B cells in neuroinvasive scrapie. Nature. 390, 687-687 (1997).
- Mabbott, N. A., Farquhar, C. F., Brown, K. L., Bruce, M. E. Involvement of the immune system in TSE pathogenesis. Immunol Today. 19, 201-201 (1998).
- Sigurdson, C. J. PrP(CWD) lymphoid cell targets in early and advanced chronic wasting disease of mule deer. J Gen Virol. 83, 2617-2617 (2002).
- Klein, M. A. Complement facilitates early prion pathogenesis. Nat Med. 7, 488-488 (2001).
- Mabbott, N. A. Temporary depletion of complement component C3 or genetic deficiency of C1q significantly delays onset of scrapie. Nat Med. 7, 485-485 (2001).
- Zabel, M. D. Stromal Complement Receptor CD21/35 Facilitates Lymphoid Prion Colonization and Pathogenesis. J Immunol. 179, 6144-6144 (2007).
- Cordier-Dirikoc, S., Chabry, J. Temporary depletion of CD11c+ dendritic cells delays lymphoinvasion after intraperitonal scrapie infection. J Virol. 82, 8933-8933 (2008).
- Dorban, G. Oral scrapie infection modifies the homeostasis of Peyer's patches' dendritic cells. Histochem Cell Biol. 128, 243-243 (2007).
- Flores-Langarica, A. Scrapie pathogenesis: the role of complement C1q in scrapie agent uptake by conventional dendritic cells. J Immunol. 182, 1305-1305 (2009).
- Huang, F. P., MacPherson, G. G. Dendritic cells and oral transmission of prion diseases. Adv Drug Deliv Rev. 56, 901-901 (2004).
- Ano, Y., Sakudo, A., Nakayama, H., Onodera, T. Uptake and dynamics of infectious prion protein in the intestine. Protein Pept Lett. 16, 247-247 (2009).
- Aucouturier, P. Infected splenic dendritic cells are sufficient for prion transmission to the CNS in mouse scrapie. J Clin Invest. 108, 703-703 (2001).
- Huang, F. P. Migrating intestinal dendritic cells transport PrP(Sc) from the gut. J Gen Virol. 83, 267-267 (2002).
- Jeffrey, M. Transportation of prion protein across the intestinal mucosa of scrapiesusceptible and scrapie-resistant sheep. J Pathol. 209, 4-4 (2006).
- Raymond, C. R., Mabbott, N. A. Assessing the involvement of migratory dendritic cells in the transfer of the scrapie agent from the immune to peripheral nervous systems. J Neuroimmunol. 187, 114-114 (2007).
- Mohan, J., Hopkins, J., Mabbott, N. A. Skin-derived dendritic cells acquire and degrade the scrapie agent following in vitro exposure. Immunology. 116, 122-122 (2005).
- Gilch, S. CpG and LPS can interfere negatively with prion clearance in macrophage and microglial cells. FEBS J. 274, 5834-5834 (2007).
- Safar, J. Molecular mass, biochemical composition, and physicochemical behavior of the infectious form of the scrapie precursor protein monomer. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 87, 6373-6373 (1990).
- Büeler, H. R. Mice devoid of PrP are resistant to scrapie. Cell. 73, 1339-1339 (1993).
