Summary
ここでは、すぐに精製することにより腹腔内接種に従い、蛍光して注射部位からの彼らの取り込みと動きを監視し、これらのイベントを媒介する細胞を特徴づける感染脳材料から集約されたプリオンロッドを標識する免疫細胞によるプリオンの取り込みと人身売買を監視するための新たなアッセイを説明します。
Abstract
異常な形態が存在するプロテアーゼ、抵抗性病態と感染しているホストでエンコードされたプリオン蛋白質（PRPC）は、羊のcervidsとスクレイピーの慢性消耗病（CWD）などのプリオン病を特徴付ける。プリオン仮説は、この異常なコンフォーマーは、ほとんどまたはすべての感染性プリオンのを構成すると主張する。周辺プリオン病因の早期イベントの免疫システムの役割は、説得力CWDとスクレイピー1-3実証されている。マウスのトランスジェニックおよび薬理学的研究は、感染4月6日後の早期にプリオンを保持し、複製における補体系の重要な役割を明らかにした。in vitroおよび in vivo研究における人身売買の彼らの役割は残っても、7-10樹状細胞によるプリオンの保持を観察している11月16日は不明。マクロファージは、同様に初期のプリオンの病因に関与している、しかしこれらの研究は、感染3,11,17後数週間に発生した事象に焦点を当てている。これらの先行研究はまた、内因性プリオンCと感染プリオン区別の問題に苦しんでいる。ここでは、そこに採用免疫細胞で接種部位からプリオンの取り込みと人身売買を評価するための半定量的、公平なアプローチを説明します。集約されたプリオンロッドは、非集約タンパク質と糖クッションを介して超遠心分離の界面活性剤可溶化により、感染した脳ホモジネートから精製した。ポリアクリルアミドゲル電気泳動、クマシーブルー染色とペレット画分に高濃縮プリオンロッドのウェスタンブロッティング確認回復。プリオンロッドは、蛍光色素で標識した後、マウスに腹腔内に注射した。二時間後に腹腔洗浄液、脾臓および縦隔および腸間膜リンパ節から免疫細胞は、プリオンロッドの保持および単球、好中球、樹状細胞、マクロファージやB細胞とT細胞のマーカーを使用して多色フローサイトメトリーで識別される細胞のサブセットを測定した。このアッセイは、感染後数時間以内に生体内で取得し、人身売買のプリオン免疫細胞の初めての直接モニタリングすることができます。このアッセイはまた、明らかに、通常は困難であると他のアッセイシステムでデータの解釈の問題が発生する可能性が宿主細胞に発現PRPCから感染、集約されたプリオンを区別します。このプロトコルは、他の接種経路（経口、静脈内、intranervousや皮下など）と同様に抗原（結合ビーズ、細菌、ウイルスおよび寄生虫病原体やタンパク質、卵）に適合させることができます。
Protocol
1。プリオンロッドを精製し、ラベル付け
このプロトコルは、1つの以前に発行された18から適応される
- コマーシャルブレンダーの最大速度で1分、その後、氷上で2分間氷冷均質化緩衝液900mLの中のプリオン感染脳組織の100グラム（HB、1X PBS、320 mMスクロース、150mMのNaClおよび4mm EDTAを含む）をホモジナイズする。 3回繰り返します。
- 10 3000 × gで分間、4℃でホモジネート遠心する氷の上で削除し、上清を保存する。 1L HBでペレットを再サスペンドし、手順1.1と1.2を繰り返します。
- 10万XG、0℃で60分間、プールの上清と遠心上清を捨てる。
- 再サスペンド1Xトリス100ml中のペレットは、2％トリトンX - 100を（TBST）を含む（10mMトリス- HCl、0.1 mM NaClおよび1mMのEDTA）緩衝生理食塩水。ブラッドフォードまたは類似のアッセイによる推定のタンパク質濃度とTBSTで5 mg / mLのために調整する。 30分間氷上で冷やします。
- 10万XG、0℃で30分間遠心上清を廃棄し、50 mLのTBSTで100mLのTBSのペレットを洗浄する。 100 mLの1X PBSでペレットが1％サルコシルとプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む再サスペンドし、37℃で120分間攪拌℃に
- 10万xgで60分間、320 mMスクロースと遠心900mLの上の層のサンプルを、10℃上清を捨て、10mLの2.3MのNaCl、5％サルコシルで再サスペンドペレット。
- 氷上で1分間の間隔で70％の最大パワーで試料5 × 40秒を超音波処理してください。
- 13000 × gで、4℃で15分間エッペンドルフチューブと遠心分離機への試料のアリコートを1mL。 TBSと店で二回ペレットを洗浄@ -70 ° Cまたはステップ1.9に蛍光色素にコンジュゲート。
- DyLight 649の1バイアルを使用して、プリオンロッドを精製の共役1チューブは、製造業者のプロトコールに従って蛍光色素。
- フィルタ列を介して透析や遠心分離によるPBSのための交換DyLightの標識バッファー。 -70℃で離れて使用する準備が整うまで、光から20μL分注しで保管してください。
2。プリオン接種と細胞回復
このセクションでは、腹腔内プリオン接種と腹膜、縦隔および腸間膜リンパ節および脾臓からの細胞の回復を包含する。
- 使用直前に蛍光プリオンロッドPBSで1:50に希釈する。親指と人差し指で背首の毛皮でクラフのマウスは、優しくあなたを直面し、小指でテールを抑制するためにマウスを回す。頭の上に後部胴体を昇降し、わずかに上下逆に彼を保持し、マウスを回外させる。
- 30Gのインシュリンの注射器を使用して、仙腸関節前方正中線および1-2 cmの1センチメートル横蛍光プリオンロッド100μLを注入する。皮膚を通して針1 cmの内側に45 °を指示挿入。コントロールとして蛍光ビーズまたはPBSのみの1:50希釈を使用してください。分析の前に割り当てられた時間のためのマウスをインキュベートする。
- 承認された動物の世話に応じてマウスを安楽死させると委員会のプロトコルを使用してください。 12mLのシリンジと25G針を用いて腹腔内にPBS 10 mLを注入する。ゆっくりと1分間のために縦方向に死体を揺らし。死体の解剖を継続しながら氷の上に15 mLコニカルチューブと予備に同じシリンジと16G針を用いて腹膜から細胞懸濁液を回復する。
- 70％エタノールで十分に死体の腹側を濡らす。ちょうどピンセットで胸郭下の正中線で皮膚を持ち上げて、はさみで皮膚を通して小さな切開をカット。そこからは、それぞれの端から横方向に正中線から2台の2センチ切開し、両方向でから頭と尾の皮膚を介して3〜5センチメートル長い切開を行います。バックピールと腹膜と胸部の空洞を明らかにするために肌をピン。慎重に腹膜を取り巻く薄い半透明の膜を通ってカットし、縦隔を明らかにするために胸部を反映している。
- 気管の腹側に近い腕頭動脈の内側に隣接してわずかに背側と胸腺への横方向に隣接する2から4縦隔リンパ節を、、、見つけて削除します。検索と後腹壁にアンカー腸をその柔らかな白い腸間膜の組織に埋め込まsix腸間膜リンパ節、最大取り外します。脾臓、ちょうど正中線の外側と腹部の左側の腸への背側に位置する、長い、暗い赤色の臓器を見つけて削除。氷上で1 mLのRPMI 1640培地で予備のリンパ節郭清が完了するまで。
- 温浸法と1 mLシリンジのプランジャーを使用してプラスチック製のペトリ皿にRPMI 3mlに40μmのメッシュのストレーナを介してリンパ節を押してください。 RPMIの追加2mLでストレーナーをすすぎ、15 mLコニカルチューブに5 mLの細胞懸濁液を移す。 RPMIのさらに5 mLでペトリ皿をすすぎ、同じチューブに移す。 250 × gで5分間遠心分離、上清を、1mLのFACSバッファー（1X PBS、1％ウシ血清アルブミン及び10mMのEDTA）に細胞ペレットを再サスペンドし、1.5mlのエッペンドルフチューブに移す捨てる。
以下は、よく特徴免疫細胞表面マーカーに対する蛍光抗体を用いた免疫細胞のサブセットを識別するための典型的な染色のプロトコルです。すべての抗体は使用直前にFACS緩衝液に希釈した。
- エッペンドルフチューブに細胞を、アリコート10 6個の細胞を数える。遠心細胞（2.7参照）と1mLのFACS緩衝液で洗浄ペレット2X。
- 内因性のFc受容体をブロックするには、2 ng / mLのラット抗マウスCD16/32の100μLで細胞を氷上で20分間インキュベート。ペレットとFACS緩衝液で細胞を洗浄する。
- 氷上で1時間ごとにサンプルとインキュベートする1ng / mLの適当な蛍光不格好なやつ（Y）IES 100μLを加える。細胞を制御するために単独でFACS緩衝液100μLを加える。ペレットとFACS緩衝液で細胞を2回洗浄する。
- 細胞を1 mLのACKバッファー（150mMのNH 4 Clを 、1mMのKHCO 3、0.1mMのEDTA）赤血球を溶解するために1分間氷上でインキュベートで再懸濁する。ペレットとFACS緩衝液で細胞を洗浄する。 1 mLのFACS緩衝液で細胞を再懸濁する。
- 通常、405、488および633nmの励起レーザーと五から十蛍光発光検出器で、多色検出や分析が可能なフローサイトメーターを使用してセルからデータを収集する。
4。代表的な結果：
我々は、原油、プリオン感染脳乳剤（ 図1）また、プロテアーゼKだったE2ヘラジカ脳ホモジネート（ レーン1および2）大きく（ レーン1と3を比較する ）プリオンの棒の濃縮、の界面活性剤可溶化および超遠心分離からプリオンロッドを精製抵抗性（レーン4）。興味深いことに、未消化の精製プリオンロッドは、プリオンのための劇的な濃縮を示す、消化E2の脳ホモジネートと非常に類似グリコフォームプロファイルを表示。同じ処理された正常な脳ホモジェネートはPK耐性PrP Cを （ レーン5および6）産生しなかった。
特定の細胞集団のフローサイトメトリー分析は、その抗原は二時間で腹膜に細胞のホームを提示し、蛍光ビーズとプリオンロッド、などのPBSを注入コントロール上に劇的に増大した蛍光（ 図2）によって証明さを保持示す。重要な蛍光を表示ビーズから細胞（ 図2H - N）とプリオン（ 図2O - U）接種マウス中にバックグラウンド（ 図2A - G）の上に蛍光表示を制御するPBS処置の腹膜から採取さない細胞なし、、特に単球上に（ 図2IおよびP）、樹状細胞（ 図2KおよびR）とマクロファージ（ 図2LとS）、およびいくつかの好中球（ 図2JとQ）と少ないB細胞（ 図の2T）。ビーズとプリオン有利子単球、樹状細胞やマクロファージは、2つの時間接種（ 図2ADとAK、AFおよびAMとAGと 、それぞれ）、一方、ほとんどまたは全くのPrP CWD有利子好中球の後縦隔リンパ節に認められた、BまたはT細胞は、（それぞれ、 図2AEとAL、AHとAGとAI及びAP、）そこに発見された。我々は、脾臓や腸間膜リンパ節（データは示していない）にはビーズやプリオンのロッドを検出されませんでした。トトでは、これらのデータは、他の粒子状抗原と非常によく似たその免疫細胞のトラフィックのプリオンを示しています。
| 試薬 | 蛍光色素 | 励起レーザー（波長） | ピーク発光（nm）の |
| プリオンロッド | DyLight 649 | 633 | 674 |
| 1μmのビーズ | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| 抗体 | |||
| CD11b | eFluor 450 | 405 | 450 |
| フィコエリトリン- Cy7 | 488 | 760 | |
| CD11cは | R -フィコエリスリン | 488 | 575 |
| フィコエリトリン- Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | R -フィコエリスリン | 488 | 575 |
| CD21 | DyLight 488 | 488 | 518 |
| B220 | アロフィコシアニン- Cy7 | 633 | 785 |
| CD3 | R -フィコエリスリン | 488 | 575 |
図1。感染した脳ホモジネートからプリオンロッドの精製は、我 々は我々が集約されたプリオンロッド（レーン3および4）、精製、そこから出発材料としてCWDに感染したシカ（E2、レーン1と2）から10％の原油の脳ホモジネートを使用。正常な脳のホモジェネートていないのに対し（レーン5および6）、 - 原油と精製材料の両方は、プロテアーゼK処理（4レーン1）に特徴的な抵抗性を示した。分子量マーカーは、ブロットの左側にKdがで表示されます。 BH、脳のホモジネート。
図2。二時間接種。PBS（パネルAGとV - AB）、蛍光ビーズ（HNおよびAC - AI）またはプリオンロッドの後腹膜からの縦隔リンパ節への免疫細胞の人身売買のプリオンのフローサイトメトリー分析 （OUとAJ - AP）があった二時間後に腹腔洗浄液（AU）や縦隔リンパ節（V - AP）から収穫マウスと細胞の腹膜内に注入。最初の列のグラフは、PBS（パネルとV）、蛍光ビーズ（パネルHおよびAC）とプリオンロッド（パネルOとAJ）で処理したマウスからの細胞を示す。蛍光細胞（赤または緑の点）と総細胞（グレードット）の相対的な大きさ（前方散乱）、粒度（側方散乱光）と蛍光を発する総生細胞の割合を示すためにプロットされます。顆粒球の特徴的な細胞の重要な数字は、蛍光ビーズやロッドを保持。細胞はまた、免疫細胞表面マーカーとLYG - Ly6C +単球のためのゲート（パネルB、I、P、W、ADとAK）、Ly6c - CD11cは、CD11b + Ly6G +好中球（C、J、Q、X、AEに対する抗体で染色したとAL）、Ly6G - Ly6C - CD11b + CD11cは+樹状細胞（D、K、R、Y、AFおよびAM）、Ly6G - Ly6C - CD11cは、CD11b +マクロファージ、（E、L、S、Z、AGと）、CD3 - B220 + CD21 + B細胞（F、M、T、AA、AHおよびAO）とCD21 - B220 - CD3 + T細胞（G、N、U、AB、AIおよびAP）。単球、樹状細胞やマクロファージは腹腔（パネルIとP、KとRとLとS、それぞれ）で蛍光ビーズとプリオンロッドを保持し、縦隔リンパ節（パネルADとAK、AFおよびAMとAGにそれらを輸送そして、それぞれ）、同様の取り込みとこれら二つの粒子の人身売買を実証。好中球は、ビーズのかなりの量（J）と少ないロッド（Q）を保持されますが、リンパ節（AEおよびAL）に配信するために失敗しました。 B細胞は、いくつかの棒（TとAO）が事実上ないビーズを（MおよびAH）が保持して輸送。 T細胞はビーズもロッド（N、U、AIおよびAP）のいずれも人身売買。
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Discussion
ここでは、大幅に周辺プリオンの感染の初期段階でイベントを監視して容易にin vivoでのタグ付けと追跡プリオンのためのプロトコルを示す。このプロトコルは非常に明確に内因性のPrP Cからそれを区別するために事前にラベルの高濃縮プリオンの接種による in vitro 9 および in vivo 3,12 におけるモニタリングのプリオンの摂取で過去の試みを向上させます。感染プリオンとプリオンCは、同じ一次アミノ酸配列を共有しているため、生成プリオン特異的抗体は、問題となっている。我々は、PK消化とメタノールは我々がDylight 649 - labelelled抗PrP抗体を（私達の未発表データ）を使用して追跡された原油の脳ホモジネートを沈殿を注入されたプリオン欠損マウスを用いて同様の実験を実施した。ここに示すように、これらの実験はほぼ同一の結果を作り出したが、プリオン欠損マウスは、プリオン病19〜影響を受け市販されていないものではなく、知られている唯一の善意のプリオンの受容体は、PrP Cが不足している 。このプロトコルは、プリオン欠損マウスを用いて潜在的な問題を取り除いて、内因性プリオンCを表す一般的な実験用マウス系統を使用することができます。
B細胞は後者の前者ではなく、人身売買として同定されたものの、ここに示したデータは、同様にその免疫細胞の捕獲とトラフィックのプリオンと蛍光ビーズを示している。これは、プリオンの密売6とB細胞をimplicating以前の研究を確証している。しかし、私たちの高濃縮プリオンの準備は、おそらく追加の標識されたタンパク質の微量が含まれていますので、その免疫細胞のトラフィックこれらのタンパク質はあまりにも可能性を排除することはできません。タンパク質の混入の非常に少量のプリオンの人身売買を変更したり、真の生物学的なシナリオが決定されていない模倣しているかどうか。
免疫細胞の人身売買の二つの異なる微粒子の成功の監視は、さらにこのプロトコルはそのような寄生虫、細菌、ウイルスやタンパク質などのタグ付けと追跡することができる抗原、多種多様に適応できることを示唆している。
このプロトコルでの超遠心の手順を実行するときに、大量の試料は、長い間の比率を一定に保つように便利な遠心分離のためのより小さい物に分注しすることができます。たとえば、代わりに階層化900mLのショ糖以上のサンプルを100mLの一つ、別のチューブに90 mLの上に層を10mL、遠心分離できた。
接種時に後方に、マウスを持ち上げると、それらに誤って針のけがを最小限に抑え、前方腹膜臓器を移動します。マウスに接種し、この繊細な膜を破裂を避けるために腹膜からPBSを注入し、吸引時にゆっくりと慎重に針を挿入する。
マウスを解剖するときに、リンパ節の識別および検索の妨げになる可能性がある最先端の血管や臓器を避けるために、腹膜および縦隔そのままを覆う薄い膜を残して、かかわらず、唯一の最初の切開で皮膚をカットするように注意してください。
リンパ節は、多くの場合、脂肪組織のように見える、最初は識別が困難になる可能性があります。リンパ節は、ほぼクリーム色のオフホワイト、円形および脂肪組織よりも硬く見える。これらは、実際に識別するために、より簡単になります。フローサイトメトリー分析のための十分な細胞を回収するには、少なくとも2つのマウスからプールのリンパ節。
後者の実験計画は複数の生物種と、より多くの追加のコントロールサンプルから生成された抗体の注意深い選択が必要なので、同時に複数の細胞表面マーカーを同定するために、我々は強く、検出のための二次蛍光抗アイソタイプ抗体を必要とする未標識抗体を介して蛍光抗体を使用することをお勧めします。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、マウス操作のヘルプについては超遠心分離し、パティカイザーのヘルプはスティーブMcBryantとジェフハンセンに感謝。国立衛生研究所の神経疾患と脳卒中の国立研究所、助成金5R01NS056379 - 02は、この作業に資金を供給した。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
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