Summary
ここでは、便利なHEK293T細胞の表面上の嗅覚受容体を検出するために使用することができる生細胞の染色を実施するためのプロトコルを示しています。さらに、それはまた他の化学感覚受容体やGPCRの表面発現のためのアッセイに使用することができます。
Abstract
悪臭の鮮やかな世界は、嗅覚の感覚によって認識されています。マウスでの嗅覚は、Gタンパク質Gαolfと結合することによって揮発性の匂い分子を結合し、細胞内の信号に細胞外シグナルに変換するために仮定されている約1200のGタンパク質共役受容体（GPCR）1のレパートリーによって媒介される。受容体への臭気物質の結合を組み合わせルールに従うと考えられている、つまり、1つの嗅覚は、いくつかの受容体に結合する可能性があり、つの受容体は、程度の差は2に、複数の匂い物質を結合することができる。生化学、シグナリングおよびリガンド結合研究は、便利な異種細胞を使用するほとんどのGPCRのために行われている。トランスフェクションに彼らは表面にエクスポートに失敗したので、しかし、嗅覚受容体の研究のために異種細胞の使用は長い間排除されました。齋藤らは、家族のシャペロンを共が一緒に3をトランスフェクトされた異種細胞の表面へのトラフィックの嗅覚受容体へのシャペロンとしての嗅覚ニューロンと行為で強化された発現を示すタンパク質を輸送する単一の細胞膜の通過の受容体（RTP）を示している。受容体は細胞株における堅牢な表面発現を示す場合に異種細胞を使用し受容するための生化学的アッセイを行うには、最初に決定する必要があります。これは、生細胞の染色に続いてシャペロンのRTP1Sと受容体は、蛍光細胞外ドメインまたは排他的に細胞外ドメイン内のタグにラベルを付けるために過剰発現によってアッセイすることができます。ここでは、便利なHEK293T細胞の表面上の嗅覚受容体を検出するために使用することができる生細胞の染色を実施するためのプロトコルを示しています。さらに、それはまた他の化学感覚受容体やGPCRの表面発現のためのアッセイに使用することができます。
Protocol
1。手順：
転送細胞、トランスフェクションおよび免疫細胞化学、日ごとに行わつのステップ：プロシージャでは、3日間の合計時間をかけて完成した三つの部分から構成されています。最初の二日間での転送と細胞のトランスフェクションは、層流室内の無菌状態で実施する必要があります。
1日目：表面発現アッセイのためのHEK293T細胞の譲渡。
- 伝送媒体（M10）：ミックス10％（体積）無菌状態のウシ胎児血清を添加した最小必須培地。
- セットアップに必要なプレートの数に応じて100mmの培養プレート内の目的のコンフルエントに細胞を成長させる。それは草に覆わまたは疎セルを避けるために転送されるセルの割合を決定することが重要である：例えば、100％コンフルエントな100 mmディッシュから、一つでコンフルエントに約30％を取得するために35mm皿に約3％を譲渡することができます。後者。
- 前に無菌層流室、コート22に、セルを転送する滅菌ポリDリジン（1mgの/ mL）と各35 mmの細胞培養皿で片足、メッキの細胞のためのコーティング面を上X 22 mmのガラスカバースリップ（図1 ）。 10分 - 5のために乾燥してソリューションを許可する。必要に応じてこの間隔の間に、層流室内のUV光源は、カバースリップを滅菌するためにオンにすることができます。ポリDリジンは、異種細胞がカバーガラスに付着することができます。
- 100mmディッシュ内の既存のメディアアウト吸引、細胞を転送するには、慎重に8 mLの滅菌PBSを添加し洗浄、吸引PBS、3 mLの0.05％トリプシン- EDTAを用いて細胞をトリプシン処理、細胞が培養皿からデタッチするときに、によって、さらに酵素反応をブロックする5 mLのM10を追加。細胞をひいて粉にすると無菌コニカルチューブに必要なボリュームを移転すること、細胞をペレットに5分間200グラムで遠心。無傷の細胞のペレットを残し、トリプシン- EDTAを含有する上清を吸引除去する。 35mmの皿に細胞を転送するには、それぞれの料理のために1 mLのM10を追加し、細胞を解離する粉薬。各ディッシュに再懸濁した細胞を1 mLを追加。 37℃で一晩培養する° C、5％CO 2。
図1コート22ポリDリジンでX 22 mmのガラス製カバースリップと各35 mmのシャーレに1コーティング面を上に置きます。
2日目：HEK293T細胞のトランスフェクション。
- 18-24時間転送した後、細胞は、アッセイする受容体のトランスフェクションのための準備が整いました。 4の前に説明したキアゲンミニプレップキット以下のプロトコルを使用して細菌培養液から調製した哺乳動物発現ベクターpCI、でクローニングされた受容体とRTP1Sを使用してください。 N末端に免疫染色を容易にするために20アミノ酸の長ロドプシンエピトープでタグ付けされた受容体を使用してください。
- 受容体構造、RTP1S構造と緑色蛍光タンパク質それぞれのトランスフェクションの50 ngの250 ngの1000ngを使用してください。メーカーのマニュアルに従ってリポフェクタミン2000を、使用してトランスフェクションを実行します。
3日目：細胞表面の染色された受容体を可視化する免疫細胞。
- 開始する前に、染色やソリューションを洗濯を準備し、4℃に冷却する。培地染色：最小必須培地、45mlの、ウシ胎児血清、5 mLを、HEPES（1M）、500μL（最終濃度10mMの）、アジ化ナトリウム（1.5M）、500μL（最終濃度15MM）。 、HEPES（1M）、5mLの（最終濃度10mMの）、アジ化ナトリウム（1.5M）、5mLの（最終濃度15mm）をHBSS、500mLの：ソリューションを洗ってください。どちらのソリューションは、再利用のために4℃で保存することができます。染色媒体100倍で、必要な抗体を希釈することにより抗体の溶液を調製。
- 24時間後にトランスフェクションについての嗅覚受容体のための表面染色のための免疫化学を開始します。生細胞の染色を実行するには、実験的なセットアップが4に冷却しなければならない° C：氷とパットのようにもできる限りそれを作るために氷の表面に含まれる大を埋める、氷の上にトレイを置き、70％でそれを吹きかけエタノール。滑らかな表面を得るために、パラフィルムの部分（トレイの長さよりも小さい）とエタノールスプレートレイ上に貼ってカット。ピンセットを使用して、パラフィルム上にトランスフェクトされた細胞、一度、セル側を含むガラスカバースリップを転送します。層ごとにカバーはスリップ（図2）のコーナーから慎重に押し出し、100μLコールド主染色液でスリップ。階層化抗体溶液を持つすべてのカバースリップの後、空気中のソリューションの枯渇を防ぐためにトレイをカバーしています。 45〜60分間一次インキュベーションを行う。
- 主なインキュベーションの後、すぐにメディアを含む、オリジナルの35mm培養皿にカバースリップを転送する。培地を吸引除去し、カバースリップから細胞を失うことを防ぐために皿の縁から静かに2 mLの冷却した洗浄溶液を加える。洗浄液を吸引除去し、3回の洗浄を完了するために二度繰り返す。第三洗浄の終了時に、洗浄液を吸引しないでください。
- 二次抗体solutiを準備染色のメディアで上と同じトレイに新しく貼らパラフィルム層に洗浄溶液からカバースリップを転送する。再び静かに一次インキュベーションなどのコーナーから、層ごとにカバースリップをに抗体溶液100μLを押し出します。 30の二次インキュベーションを行う - 45分とオリジナルの35mmの皿の洗浄溶液に戻って転送する。もう一度、カバーが説明されているように三回伝票は洗浄。
- 最後の洗浄からソリューションを洗浄し、2 mLの1パーセントチルドパラホルムアルデヒドを追加吸引する。 15分間氷上で、チルド1％パラホルムアルデヒド溶液で細胞を固定する。
- きれいな顕微鏡のガラスのカバースリップがダウンしてセルの側で、マウント試薬のMowiolを使用してスライドし、慎重にすべての気泡を（図3）除外マウントします。かつてMowiol空気が乾燥する、表面に蒸留水を加えるとすぐに吸引し、静かにカバースリップを洗う。
図2。レイヤ100μLの冷主要な染色液でそれぞれカバー。
図3。Mowiolマウンティング試薬を使用してスライドするきれいなガラスの顕微鏡で下のセル側にカバースリップをマウントします。
2。代表的な結果：
生細胞の染色は1つがシャペロン（プロテインRTP1Sを輸送受容体とこのケースの嗅覚受容体Olfr62、の）（図4）と受容体のトランスフェクションで、細胞の表面上のタンパク質を可視化することができます。受容体の細胞表面の染色は、染色の点状のパターン（図4B、挿入図）によって特徴付けられる。不適切に行わ染色することが困難オブザーバーは、ノイズから実際の表面染色を区別するためになり、より高いノイズにつながる可能性があります。 
図4。シャペロンと受容体のトランスフェクションは、生細胞の染色を用いて細胞の表面上のタンパク質の可視化が可能になります。嗅覚だけでは受容体Olfr62（）とRTP1Sシャペロン（B）とOlfr62のトランスフェクションのトランスフェクション。 GFPの発現レベルは、トランスフェクションのコントロール（A'とB'）として機能します。
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Discussion
各ステップは、著名な、独特の表面の汚れを確実にするために慎重に実施しなければならない。全体の染色工程は、（氷上で）寒さで実施しなければならない、とカバースリップが配置されているトレイは、細胞が生き続けることを確認するために使用する前に冷却する必要があります。また固定は表面染色のプロセスの最後に実行されます。これは固定では一次および二次抗体に細胞膜を透過性に染色の前に内部の染色とは対照的です。空気にカバースリップの暴露時間は、最大乾燥から細胞を防止するために最小化されている必要がありますので抗体溶液とカバースリップの階層化、ソリューションを洗浄するためにカバースリップを転送する、洗浄の間に洗浄溶液の交換は一度に素早く一に行う必要があります複数のカバースリップを処理するとき。
エピトープタグと抗体目のものに応じて、一つはインキュベーション時間、洗浄回数、および抗体の希釈の倍を調整する必要があります。バックグラウンドノイズは、より多くの抗体を希釈または洗浄の回数を増やす、またはインキュベーション時間を短縮することで回避できます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、この原稿の重要な読書のために松浪研究室のメンバーに感謝。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
