Summary
Hier zeigen wir ein Protokoll für die Durchführung Lebendzellfärbungen, die zur Geruchsrezeptoren auf der Oberfläche von Zellen HEK293T bequem nachgewiesen werden können. Darüber hinaus kann es auch zum Testen auf Oberflächenexpression von anderen Chemosensoren oder GPCRs verwendet werden.
Abstract
Die lebendige Welt der Gerüche ist durch den Sinn des Geruchssinns anerkannt. Der Geruchssinn Mäusen wird durch ein Repertoire von etwa 1200 G Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) 1, die postuliert, dass flüchtige Duftmoleküle binden und Umwandlung der extrazellulären Signals in ein intrazelluläres Signal durch Kopplung mit G-Protein Gαolf vermittelt. Die Bindung des Geruchsstoffen an die Rezeptoren wird angenommen, dass eine kombinatorische Regel, dass man Geruchsstoff kann mehrere Rezeptoren binden und einen Rezeptor können verschiedene Geruchsstoffe in unterschiedlichem Maße 2 zu binden folgen. Biochemische, Signal-und Ligandenbindung Studien wurden bequemerweise für die meisten GPCRs unter Verwendung heterologen Zellen. Doch der heterologen Zellen verwenden für das Studium der Geruchsrezeptoren war für eine lange Zeit ausgeschlossen, da auf die Transfektionseffizienz sie an die Oberfläche zu exportieren ist fehlgeschlagen. Saito et al haben Einzel-Membran passieren Rezeptor Transport Protein (RTP) Familie Chaperone zeigen erhöhte Expression in den Riechzellen und fungieren als Chaperone für den Verkehr Geruchsrezeptoren auf der Oberfläche in heterologen Zellen, wenn co zusammen transfiziert 3 gezeigt. Zur Durchführung biochemischer Assays für Rezeptoren mit heterologen Zellen, muss man zunächst ermitteln, ob der Rezeptor zeigt robuste Oberfläche Ausdruck in der Zell-Linie. Dies kann durch die Überexpression der Rezeptoren mit dem Chaperon RTP1S durch Lebendzellfärbungen zu Fluoreszenz-Label der extrazellulären Domäne oder einen Tag in der extrazellulären Domäne ausschließlich gefolgt getestet werden. Hier zeigen wir ein Protokoll für die Durchführung Lebendzellfärbungen, die zur Geruchsrezeptoren auf der Oberfläche von Zellen HEK293T bequem nachgewiesen werden können. Darüber hinaus kann es auch zum Testen auf Oberflächenexpression von anderen Chemosensoren oder GPCRs verwendet werden.
Protocol
1. Vorgehensweise:
Das Verfahren besteht aus drei Teilen über eine Gesamtzeit von 3 Tagen abgeschlossen: Übertragung von Zellen, Transfektion und Immunzytochemie, einen Schritt pro Tag durchgeführt. Transfer und Transfektion von Zellen in den ersten zwei Tagen muss unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Kammer durchgeführt werden.
Tag 1: Transfer von HEK293T Zellen für Oberflächen-Expression Assays.
- Übertragungsmedium (M10): Mix Minimum Essential Medium mit 10% (nach Volumen) fötalem Rinderserum in sterilem Zustand ergänzt.
- Wachsen Zellen, um eine gewünschte Konfluenz in einer 100mm Kulturschale, abhängig von der Anzahl der Platten für die Einrichtung. Es ist wichtig, den Anteil der Zellen zu übertragen überwucherte oder spärlich Zellen zu vermeiden bestimmen: zum Beispiel aus einer 100% konfluenten 100 mm Schale, kann man etwa 3% bis 35 mm Schale Transfer zu ca. 30% Konfluenz in den erhalten Letztere.
- Vor der Übertragung Zellen, in den sterilen Laminar-Flow-Kammer, Mantel 22 X 22 mm Glasdeckgläschen mit steriler Poly D Lysin (1 mg / mL) und Platz eins in jedem 35 mm Zellkulturschale, beschichteten Seite nach oben für die Beschichtung Zellen (Abbildung 1 ). Lassen Sie die Lösung für 5 dry - 10 Minuten. Während dieser Zeit kann die UV-Quelle in der laminaren Kammer eingeschaltet werden, um die Deckgläser zu sterilisieren, wenn gewünscht. Poly D Lysin hilft heterologen Zellen Stick an die Deckgläser.
- Zur Übertragung von Zellen, saugen aus den bestehenden Medien in der 100mm Schale, durch vorsichtige Zugabe von 8 ml sterilem PBS, PBS waschen und absaugen trypsinize die Zellen mit 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA; wenn Zellen aus der Schale lösen, Block weiteren enzymatischen Reaktion durch Zugabe von 5 mL M10. Man reibt die Zellen und Transfer erforderlichen Volumens in einen sterilen konischen Rohr; Zentrifuge bei 200g für 5 Minuten die Zellen zu pelletieren. Absaugen aus Überstand mit Trypsin-EDTA, so dass die Pellets von Zellen intakt. Zur Übertragung der Zellen auf 35 mm-Schalen, 1 mL M10 für jedes Gericht und verreiben, um die Zellen zu distanzieren. 1 ml der resuspendierten Zellen zu jedem Gericht. Inkubieren Zellen über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2.
Abbildung 1. Coat 22 X 22 mm Deckgläser mit Poly-D Lysin und legen Sie eine beschichtete Seite nach oben in je 35 mm Schale.
Tag 2: Transfektion von Zellen HEK293T.
- 18-24 Stunden nach der Übertragung werden die Zellen bereit für die Transfektion des Rezeptors an getestet werden. Verwenden Sie Rezeptor und RTP1S in Säugerexpressionsvektor PCI, aus Bakterienkulturen mit Qiagen Miniprep Kit nach Protokoll vor 4 beschrieben vorbereitet geklont. Verwenden Rezeptoren, N terminal mit 20 Aminosäuren langes Rhodopsin Epitop markiert, um Immunfärbung zu erleichtern.
- Verwenden Sie 1000ng von Rezeptor-Konstrukt, 250 ng RTP1S konstruieren und 50 ng der grünen Fluoreszenz-Protein jeder Transfektion. Führen Sie die Transfektion mit Lipofectamine 2000, als pro-Hersteller Handbuch.
Tag 3: Immunzytochemie auf der Zelloberfläche angefärbt Rezeptoren zu visualisieren.
- Vor Beginn der Vorbereitung Färbung und Waschlösungen und kühlen auf 4 ° C. Die Färbung Medium: Minimum Essential Medium, 45 ml; Fetal Bovine Serum, 5 ml; HEPES (1M), 500 ul (Endkonzentration 10 mM); Natriumazid (1,5 MB), 500 ul (Endkonzentration 15 mM). Waschlösung: HBSS, 500 mL; HEPES (1M), 5 ml (Endkonzentration 10 mM); Natriumazid (1,5 MB), 5 ml (Endkonzentration 15 mM). Beide Lösungen können bei 4 ° C zur Wiederverwendung gespeichert werden. Bereiten Antikörper werden durch Verdünnung benötigten Antikörper in der Färbung Medium 100-fach.
- Starten Immunchemie für Oberflächen-Färbung für Geruchsrezeptoren etwa 24 Stunden nach der Transfektion. Um Lebendzellfärbungen, der experimentelle Aufbau muss auf 4 gekühlt werden durchführen ° C: Füllen Sie einen großen enthielt mit Eis und pat die Oberfläche des Eis, um es so gleichmäßig wie möglich zu machen, statt ein Tablett auf dem Eis und sprühen Sie es mit 70% Ethanol. Schneiden Sie ein Stück Parafilm (kleiner als die Länge des Fachs) und bringt es auf den Ethanol besprüht Tablett, um eine glatte Oberfläche zu erhalten. Übertragen Sie die Glasdeckgläschen mit transfizierten Zellen auf dem Parafilm, ein zu einer Zeit, Zelle nach oben, mit einer Pinzette. Layer-decken jeweils mit 100 ul kaltem primären Färbelösung slip, Extrudieren sorgfältig von einer Ecke des Schlupf (Abbildung 2). Nach Schichtung all die Deckgläser mit Antikörper-Lösung, decken Sie das Fach zu verhindern Austrocknen der Lösung in der Luft. Führen Sie primäre Inkubation für 45-60 Minuten.
- Nach der Grundschule Inkubation schnell übertragen Deckgläser auf die ursprüngliche 35-mm-Kulturschalen, mit den Medien. Saugen Sie das Medien-und 2 mL gekühltes Waschlösung vorsichtig vom Rand des Tellers zu verhindern verlieren Zellen aus dem Deckglas. Absaugen der Waschlösung und wiederholen Sie zweimal auf drei Wäschen abzuschließen. Am Ende des dritten waschen, nicht saugen die Waschlösung aus.
- Bereiten sekundären Antikörper Löauf in der Färbung Medien und übertragen Sie die Deckgläser aus der Waschlösung in eine neu angebrachte Parafilm Schicht in der gleichen Schublade. Wieder leicht extrudieren 100 ul Antikörper-Lösung auf Layer jedes Deckglas, aus der Ecke, wie die primären Inkubation. Führen Sie sekundäre Inkubation für 30 bis 45 Minuten und Transfer zurück zum Waschlösung in den ursprünglichen 35 mm Gerichte. Einmal mehr, waschen Sie die Deckgläser dreimal so beschrieben.
- Saugen Sie Waschlösung aus dem letzten Wasch-und 2 mL 1% Paraformaldehyd gekühlt. Fix-Zellen in gekühltem 1% Paraformaldehyd-Lösung auf Eis für 15 Minuten.
- Montieren Sie den Deckel rutscht auf saubere Mikroskop Objektträger mit Montage-Reagenz Mowiol, mit der Zelle nach unten und vorsichtig schließen alle Luftblasen (Abbildung 3). Sobald Mowiol Luft trocknet, waschen Deckgläser vorsichtig durch Zugabe von destilliertem Wasser auf der Oberfläche und Absaugen sofort.
Abbildung 2. Schicht jedes Deckglas mit 100 ul kaltem primären Färbelösung.
Abbildung 3. Montieren Sie die Deckgläser mit der Zelle nach unten auf saubere Objektträger aus Glas mit Mowiol Montage-Reagenz.
2. Repräsentative Ergebnisse:
Lebendzellfärbungen ermöglicht einem, Proteine auf der Oberfläche von Zellen sichtbar zu machen, auf die Transfektion von Rezeptoren mit Chaperone (in diesem Fall Geruchsrezeptor Olfr62 mit Rezeptor-Transport Protein RTP1S) (Abbildung 4). Zelloberflächenfärbung der Rezeptoren wird durch punktförmige Muster der Färbung (4B, Einschub) gekennzeichnet. Die Färbung durchgeführt unangemessen zu höheren Geräuschentwicklung führen, wodurch es schwierig für den Betrachter auf die reale Oberfläche Färbung von Rauschen zu unterscheiden. 
Abbildung 4. Transfektion von Rezeptoren mit Chaperone ermöglicht die Visualisierung der Proteine auf der Oberfläche von Zellen mit Hilfe von lebenden Zellen Färbung. Transfektion der Geruchsrezeptor Olfr62 allein (A) und die Transfektion von Olfr62 mit RTP1S Chaperon (B). GFP Expression dienen als Transfektion Kontrolle (A 'und B').
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Discussion
Jeder Schritt muss sorgfältig mit einem auffälligen und markanten Oberflächenbeschmutzung sicher durchgeführt werden. Die gesamte Färbung muss in kaltem durchgeführt werden (auf Eis), und das Tablett, auf dem Deckgläschen gelegt werden muss vor gekühlt werden, um zu verwenden, um sicherzustellen, Zellen am Leben bleiben. Außerdem Fixierung am Ende der Oberfläche Färbung durchgeführt. Dies steht in krassem Gegensatz zu internen Färbung, wo Fixierung Färbung an der Zellmembran zu primären und sekundären Antikörper permeabilisieren vorausgeht. Die Zeit der Exposition der Deckgläschen an der Luft minimiert werden müssen, um die Zellen vor dem Austrocknen zu verhindern, deshalb Schichtung der Deckgläser mit Antikörper-Lösungen, die Übertragung Deckgläser zur Lösung zu waschen, muss den Austausch von Waschlösung zwischen wäscht schnell und eins zu einem Zeitpunkt durchgeführt werden wenn man mehrere Deckgläser.
Abhängig von der Epitop und Antikörper verwendet man, kann man haben, um Inkubationszeit, die Anzahl der Wäschen und Falte Antikörperverdünnung anzupassen. Hintergrundgeräusche können durch Verdünnen der Antikörper mehr oder Erhöhung der Anzahl der Wäschen oder Verkürzung Inkubationszeit vermieden werden.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern des Matsunami Labor für die kritische Durchsicht des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
