Summary
Qui mostriamo un protocollo di effettuare colorazione delle cellule vive, che può essere utilizzato per rilevare recettori olfattivi sulla superficie delle cellule HEK293T conveniente. Inoltre, può anche essere usata per test per l'espressione superficiale di altri recettori chemosensoriali o GPCR.
Abstract
Il mondo vivido degli odori è riconosciuto dal senso dell'olfatto. Olfatto nei topi è mediata da un repertorio di circa 1200 recettori delle proteine G accoppiate (GPCR) 1 che sono postulate di legare molecole odoranti volatili e convertendo il segnale extracellulare in un segnale intracellulare mediante accoppiamento con proteine G Gαolf. Legame del odoranti ai recettori si pensa di seguire una regola combinatoria, cioè, un odorizzante può legare i recettori diversi e un recettore può legare odori diversi a vari livelli 2. Biochimiche, di segnalazione e studi di binding ligando sono stati opportunamente eseguiti per la maggior parte GPCR utilizzando cellule eterologhe. Tuttavia l'uso di cellule eterologhe per lo studio dei recettori olfattivi, è stato precluso per molto tempo da quando il transfezione non sono riusciti ad esportare verso la superficie. Saito et al hanno dimostrato singolo passaggio del recettore di membrana Il trasporto delle proteine (RTP) accompagnatori famiglia mostrano maggiore espressione nei neuroni olfattivi e sensoriali agiscono come accompagnatori di recettori olfattivi traffico in superficie in cellule eterologhe, quando co transfettate insieme 3. Per effettuare test biochimici per i recettori utilizzando cellule eterologhe, si deve prima determinare se il recettore mostra espressione robusta superficie nella linea cellulare. Questo può essere dosati con iperespressione del recettore con i RTP1S chaperone seguita da cellule vive colorazione fluorescente di etichettare il dominio extracellulare o di un tag nel dominio extracellulare in esclusiva. Qui mostriamo un protocollo di effettuare colorazione delle cellule vive, che può essere utilizzato per rilevare recettori olfattivi sulla superficie delle cellule HEK293T conveniente. Inoltre, può anche essere usata per test per l'espressione superficiale di altri recettori chemosensoriali o GPCR.
Protocol
1. Procedimento:
La procedura si compone di tre parti completato in un tempo totale di 3 giorni: il trasferimento di cellule, trasfezione e immunocitochimica, un passo effettuato al giorno. Trasferimento e trasfezione delle cellule nei primi due giorni deve essere effettuato in condizioni sterili in una camera a flusso laminare.
1 ° giorno: Trasferimento di cellule HEK293T per test espressione sulla superficie.
- Trasferimento medio (M10): Mix minimo mezzo fondamentale integrato con il 10% (in volume) siero fetale bovino in confezione sterile.
- Crescere le cellule ad una confluenza desiderata in una piastra di coltura 100mm, a seconda del numero di piatti necessari per impostare. E 'importante per determinare la frazione di cellule da trasferire per evitare cellule sparse o invasi: per esempio, da un 100% confluenti piatto 100 mm, si può trasferire circa il 3% a un piatto da 35 mm di ottenere circa il 30% confluenza nel quest'ultimo.
- Prima di trasferire le cellule, nella camera sterile a flusso laminare, cappotto 22 x 22 mm coperchio scivola in vetro con sterili poli D lisina (1 mg / ml) e inserire una in ogni piatto 35 colture cellulari mm, lato patinato per le cellule placcatura (Figura 1 ). Lasciare che la soluzione a secco per 5 - 10 minuti. Durante questo intervallo, la sorgente UV nella camera di laminare può essere attivata per sterilizzare il copri-oggetto, se lo si desidera. Poli D lisina aiuta le cellule eterologhe aderire al coprioggetto.
- Per trasferire le cellule, aspirare la media esistenti nel piatto 100 mm, lavare con cura aggiungendo 8 ml PBS sterile, aspirare PBS e trypsinize le cellule in 3 mL 0,05% tripsina-EDTA, quando le cellule si staccano dal piatto, blocco di reazione enzimatica ulteriormente da M10 aggiungendo 5 ml. Triturare le cellule e il trasferimento di volume necessari in una provetta sterile conica; centrifugare a 200g per 5 minuti per far sedimentare le cellule. Aspirare fuori supernatante contenente tripsina-EDTA, lasciando il pellet di cellule intatte. Per trasferire le cellule a 35 piatti mm, aggiungere 1 mL M10 per ogni piatto e triturare dissociare le cellule. Aggiungere 1 ml di cellule risospese ad ogni piatto. Cellule incubare una notte a 37 ° C, 5% di CO 2.
Figura 1. Coat 22 x 22 millimetri coprioggetto di vetro con poli D lisina e luogo da un lato rivestito in ogni piatto 35 mm.
Giorno 2: Transfection delle cellule HEK293T.
- 18-24 ore dopo il trasferimento, le cellule sono pronte per la trasfezione del recettore da dosare. Usa recettore e RTP1S clonato nel vettore di espressione mammifero PCI, preparati da colture batteriche con Qiagen Miniprep seguente protocollo Kit descritto prima 4. Utilizzare i recettori che sono N terminali taggati con 20 aminoacidi lungo acido rodopsina epitopo per facilitare immunocolorazione.
- L'uso 1000ng di costruire recettore, 250 ng di RTP1S costruire e 50 ng di proteina verde fluorescente ogni trasfezione. Eseguire la trasfezione con Lipofectamine 2000, come da manuale produttori.
3 ° giorno: Immunocitochimica per visualizzare i recettori delle cellule macchiato di superficie.
- Prima di iniziare, preparare colorazione e soluzioni di lavaggio e raffreddare a 4 ° C. Colorazione medio: Medium minimo, 45 mL; siero fetale bovino, 5 ml; HEPES (1M), 500 microlitri (concentrazione finale 10 mM); azide di sodio (1,5 M), 500 microlitri (concentrazione finale 15 mm). Soluzione di lavaggio: HBSS, 500 ml; HEPES (1M), 5 mL (concentrazione finale 10 mM); azide di sodio (1,5 M), 5 mL (concentrazione finale 15 mm). Entrambe le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C per il riutilizzo. Preparare le soluzioni di anticorpi diluendo gli anticorpi necessari alla colorazione media 100 volte.
- Inizio immunochimica per la colorazione della superficie per circa 24 recettori olfattivi dopo trasfezione ore. Per eseguire la colorazione delle cellule vive, il set up sperimentale deve essere raffreddato a 4 ° C: riempire un grande contenuto di ghiaccio e tamponare la superficie di ghiaccio per renderlo il più uniforme possibile, posto un vassoio sul ghiaccio e spruzzare con il 70% etanolo. Tagliare un pezzo di parafilm (inferiore alla lunghezza del vassoio) e apporre sul vassoio etanolo spruzzato, per ottenere una superficie liscia. Trasferire il coperchio in vetro contenenti cellule transfettate scivola sul parafilm, uno alla volta, lato cella in alto, utilizzando una pinzetta. Ogni strato di copertura antiscivolo con 100 ul soluzione fredda colorazione primaria, estrusione con cura da un angolo della ricevuta (Figura 2). Dopo stratificazione tutte le polizze di copertura con soluzione di anticorpi, coprire il vassoio per evitare prosciugamento della soluzione in aria. Effettuare incubazione primaria per 45-60 minuti.
- Dopo l'incubazione primaria, trasferire rapidamente scivola coprire la cultura piatti originali 35mm, contenente il supporto. Aspirare i media e aggiungere 2 mL di soluzione di lavaggio refrigerato delicatamente dal bordo del piatto per evitare di perdere le cellule dal vetrino. Aspirare la soluzione di lavaggio e ripetere due volte per completare tre lavaggi. Alla fine del terzo lavaggio, non aspirare la soluzione di wash out.
- Preparare secondaria anticorpi SOLUZIOsui media colorazione e trasferire il coprioggetto dalla soluzione di lavaggio in un livello di parafilm nuova apposta nello stesso cassetto. Anche in questo caso delicatamente estrudere 100 l di soluzione di anticorpi a ogni strato antiscivolo copertina, da un angolo, come l'incubazione primario. Effettuare incubazione secondaria per 30 - 45 minuti e trasferimento al soluzione di lavaggio in originale 35 piatti mm. Ancora una volta, lavare il coperchio scivola tre volte come descritto.
- Aspirare soluzione di lavaggio da ultimo lavaggio e aggiungere 2 mL di paraformaldeide 1% refrigerata. Fissare le cellule in refrigerata soluzione paraformaldeide 1%, in ghiaccio per 15 minuti.
- Montare il coperchio scivola sul vetro microscopio pulito diapositive usando Mowiol reagente di montaggio, con il lato cellula verso il basso e cautela escludere tutte le bolle d'aria (Figura 3). Una volta che si asciuga all'aria Mowiol, lavare scivola coprire delicatamente con l'aggiunta di acqua distillata sulla superficie ed aspirando immediatamente.
Figura 2. Layer ogni coprioggetto con 100 ul soluzione fredda colorazione primaria.
Figura 3. Montare il copri con la parte delle cellule verso il basso microscopio vetro pulito diapositive usando Mowiol reagente di montaggio.
2. Rappresentante dei risultati:
Colorazione delle cellule vive permette di visualizzare le proteine sulla superficie delle cellule, sulla trasfezione di recettori con accompagnatori (in questo caso Olfr62 recettore olfattivo, con RTP1S proteina recettore trasporto) (Figura 4). Colorazione della superficie delle cellule dei recettori è caratterizzata da modello puntata della colorazione (Figura 4B, nel riquadro). Colorazione effettuata inappropriato può determinare un aumento del rumore, rendendo difficile per l'osservatore di distinguere la colorazione reale superficie da rumore. 
Transfection Figura 4. Dei recettori con accompagnatori consente la visualizzazione delle proteine sulla superficie delle cellule mediante colorazione delle cellule vive. Trasfezione del recettore odorizzante Olfr62 solo (A) e la transfezione di Olfr62 con chaperone RTP1S (B). Livelli di espressione GFP Come controllo della trasfezione (A 'e B').
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Discussion
Ogni passo deve essere effettuata con cura per garantire la colorazione della superficie prominente e distintivo. L'intero processo di colorazione deve essere eseguita a freddo (su ghiaccio), e il vassoio su cui sono previsti slittamenti di copertura deve essere raffreddato prima dell'uso per assicurare cellule rimanere in vita. Inoltre la fissazione avviene al termine del processo di colorazione della superficie. Ciò è in netto contrasto con la colorazione interna in cui la fissazione precede colorazione a permeabilize la membrana cellulare di anticorpi primari e secondari. Tempo di esposizione di scivola copertura di aria deve essere ridotto al minimo per evitare che le cellule di prosciugamento, e quindi la stratificazione delle polizze di copertura con soluzioni di anticorpi, trasferendo coprioggetto per lavare soluzione, lo scambio di soluzione di lavaggio tra un lavaggio e deve essere fatta rapidamente e uno alla volta quando si maneggia coprioggetto multipli.
A seconda del tag epitopo e gli anticorpi si usa, si può avere per regolare il tempo di incubazione, il numero di lavaggi, e piega di diluizione degli anticorpi. Il rumore di fondo può essere evitato diluendo gli anticorpi più o aumentando il numero di lavaggi, o accorciando il tempo di incubazione.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Ringraziamo i membri della Matsunami laboratorio per la lettura critica di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
