Summary
O Sistema de Fibra gigante é um circuito neuronal simples de adulto
Abstract
Quando assustou adulto D. melanogaster reagir pulando no ar e voar para longe. Em muitas espécies de invertebrados, incluindo D. melanogaster, a resposta do "escape" (ou "assustar") durante o estágio adulto é mediada pelo circuito multi-componente neuronal chamado Sistema Fibra Giant (GFS). O tamanho grande comparativa dos neurônios, sua morfologia distintiva e conectividade simples fazer o GFS um sistema modelo atraente para o estudo de circuitos neuronais. A via GFS é composta de dois gigantes bilateralmente simétricos de fibra (GF) interneurônios cujos axônios descem do cérebro ao longo da linha média para o gânglio torácico por meio do conectivo cervical. No neuromere mesothoracic (T2) dos gânglios ventral a forma FG electro-química sinapses com 1) os grandes dendrite medial do motorneuron ipsilateral (TTMn) que aciona o músculo tergotrochanteral (TTM), o principal extensor para o fêmur mesothoracic / perna e 2) a sinapse perifericamente interneurônio contralateral (PSI), que por sua vez em formas químicas (colinérgicos) sinapses com o motorneurons (DLMns) dos músculos dorsal longitudinal (DLMS), os depressores asa. A via neuronal (s) para os músculos dorsovental (DVMs), os elevadores asa, ainda não foi elaborada (o DLMS e DVMs são conhecidas conjuntamente como os músculos de vôo indiretos - não estão ligados diretamente para as asas, mas sim mover o asas indiretamente por cutícula distorcer a próxima torácica) (King e Wyman, 1980;. Allen et al, 2006). A ativação di-sináptica da DLMS (via PSI) causa um atraso pequeno, mas importante no momento da contração desses músculos em relação à ativação monossináptico de TTM (~ 0,5 ms) permitindo que o TTMs primeiro estender o fêmur e impulsionar o voar fora da terra. O TTMs simultaneamente esticar-ativar o DLMS que por sua vez mutuamente estiramento ativar o DVMs para a duração do voo. O caminho GF pode ser ativado ou indiretamente pela aplicação de um estímulo sensorial ("sopro de ar" ou "luzes", por exemplo), ou diretamente por um estímulo supra-limiar elétrico para o cérebro (descrito aqui). Em ambos os casos, um potencial de ação alcança o TTMs e DLMS unicamente através da FG, PSIs e TTM / DLM motoneurônios, embora o TTMns DLMns e têm outras, ainda não identificado, entradas sensoriais. Medição "resposta de latência" (o tempo entre o estímulo e despolarização do músculo) e "a seguir para a estimulação de alta freqüência" (o número de respostas de sucesso para um certo número de estímulos de alta freqüência) fornece uma maneira de reproduzível e quantitativamente avaliar o estado funcional dos componentes GFS, incluindo tanto as sinapses central (GF-TTMn, GF-PSI, PSI-DLMn) e química (glutamatérgico) junções neuromusculares (TTMn-TTM e DLMn-DLM). Ela tem sido usada para identificar genes envolvidos na formação de sinapses centrais e para avaliar a função do SNC.
Protocol
1. Equipamentos e Materiais
- Estas experiências usam uma configuração padrão de eletrofisiologia composto por um estimulador, uma unidade de isolamento de estímulo, dois amplificadores de microeletrodos, um sistema de aquisição de dados e um computador com software de coleta. Equipamento adicional inclui uma gaiola de Faraday, um estereomicroscópio em um suporte de boom, uma mesa de isolamento de vibração, uma fonte de luz, e uma plataforma de gravação.
- Cinco micromanipuladores são usados. Dois micromanipuladores exigem controles finos para posicionar os eletrodos de gravação, enquanto os outros três micromanipuladores só exigem controles bruta para posicionar os dois eletrodos de estimulação eo eletrodo terra. O micromanipulador para o eletrodo de registro DLM é colocado no fim da cauda da preparação (à esquerda do experimentador) eo micromanipulador para o eletrodo de registro TTM é colocado entre o pesquisador eo lado da preparação (um pouco à esquerda do experimentador). Os dois micromanipuladores que irá manter os eletrodos são colocados simulação na cabeça da preparação (direito de pesquisador). O micromanipulador para o eletrodo terra é colocado no lado mais distante da preparação
- Puxe microeletrodos de gravação de vidro com resistências de 40-60 mohms e armazenar apartamento em um prato apoiado por cera. Para a estimulação, dois eletrodos de tungstênio eletroliticamente (NaOH) afiadas são usadas. Um fio de tungstênio, ou um terceiro eletrodo eletroliticamente fabricada é usada como um terreno. Os eletrodos estimulantes e solo são preparados e anexado ao micromanipuladores antes do início da sessão experimental e não precisa ser substituído para a duração da sessão.
2. Preparando o D. melanogaster
- Uma vez que seu equipamento está configurado, é hora de preparar as moscas. Anestesiar as moscas de resfriamento de gelo sobre eles ou usando CO 2. Se o CO 2 é usado, então que haja tempo suficiente (cerca de 20 minutos) para os efeitos do gás a desgastar antes do início do experimento.
- Use uma pinça para transferir as moscas suavemente as pernas para um prato contendo uma plataforma de cera macia inclinada em um ângulo de aproximadamente 45 °. As próximas quatro etapas são feitas sob um microscópio de dissecação longe (mas perto), o equipamento de gravação.
- O próximo passo é garantir a voar em cera. Orientar o lado ventral voar baixo, com a sua anterior cima enfrentando na encosta. Usando uma pinça fina, estender para fora das pernas, em pares, e empurrá-los para a cera.
- Familiarize-se com a localização dos músculos para ser gravado a partir de: o músculo dorsal longitudinal, ou DLM, eo músculo tergotrochanteral, ou TTM. Os locais de fixação subcuticular da DLMS corresponder com a região entre a linha média dorsal do tórax e do anterior cerdas (ou cerdas). Os locais de fixação TTM estão localizados dorsalmente do posterior e anterior supra-alar cerdas. Certificando-se que as asas não obstrua o acesso ao DLM fibras ou TTM, mantenha as asas para fora e "cola"-los para a cera.
- Usando um belo par de fórceps, puxar a tromba para fora com cuidado, e segura-lo por imersão na cera. Este é um passo crítico que requer alguma prática desde a tromba é macio e é facilmente retirado do resto da cabeça. Se isso acontecer, descarte a voar e começar de novo. Incapacidade de proteger a cabeça desta forma leva a problemas ao inserir os eletrodos estimulando através dos olhos.
3. Colocação dos eletrodos
- Uma vez que o fly está ancorada a cera, a transferência do prato com a mosca anexado abaixo do estereomicroscópio que está localizado dentro da gaiola de Faraday. Orientar a voar para os lados com a cabeça da mosca para a direita do experimentador.
- O próximo passo é inserir os eletrodos. Eléctrodos de massa e estimulante pode ser inserido sem olhar através do microscópio. Boas gravações contam com empalamento precisas, por isso é uma boa idéia para a prática de manipulação do micromanipuladores. Traga os eletrodos perto dos locais de inserção com a ajuda de micromanipuladores para facilitar sua colocação adequada e gravações subseqüentes.
- Abaixe o eletrodo terra na extremidade posterior do abdome utilizando as rodas de ajuste no micromanipulador. Para colocar os eletrodos de tungstênio afiadas estimulante no cérebro, use o micromanipulador para posicionar a ponta de um dos eletrodos de modo que só toca um dos olhos de mosca. Faça o mesmo com o outro para que ambos os eletrodos são apenas tocar a parte externa de cada olho. Em seguida, empurre os eletrodos, por sua vez, através de cada olho para as pontas dos eletrodos chegar ao cérebro situada na parte de trás da cápsula cefálica (cerca de 2-3mm).
- Eletrodos colocados corretamente irá ativar o sistema de fibra Giant. Para testar se os eletrodos são colocados estimulando corretamente, aplique uma pequena (0,03 ms) Estímulo de 30-60 V entre os eletrodos estimulantes, e olhar para o movimento das asas e contrações do músculo do vôo / perna "
- O próximo passo é preencher o back-microeletrodos de vidro com 3M KCl usando um Hamilton ou calor puxados seringa de plástico e coloque-os na micromanipuladores fine-controle. Microeletrodos inserido corretamente pode ser usado para várias rodadas de experimentos.
- O eletrodo primeira gravação será inserido em uma fibra DLM. Há dois DLMS bilateralmente simétrica, cada um é composto de seis fibras musculares individuais. As gravações podem ser feitas a partir de qualquer uma das seis fibras, no entanto, os mais comumente utilizados são as fibras DLM 45a e 45b, devido à sua boa acessibilidade através do lado dorsal da cutícula torácica, eo fato de que ambas as fibras são inervadas pelo mesmo motorneuron .
- Usando o micromanipulador no lado mais distante de você, inserir um eletrodo de registro em DLM fibra 45a ou b. A inclinação da plataforma permite que o eletrodo de DLM para entrar na cutícula dorsal em um ângulo de ~ 60-90, o que ajuda a penetração. Usar o software em modo osciloscópio e olhar para o monitor do computador ao inserir eletrodos de registro no tórax. Quando o eletrodo entrou um músculo da linha de base vai cair para perto de zero ou um valor negativo. Teste com um único estímulo para ver se você pode observar a resposta muscular.
- Insira o eletrodo outra gravação para a TTM mais próximo de você. Este eletrodo é inserido lateralmente, na frente de você, devido à localização do local de ligação do músculo. Mais uma vez observar o monitor enquanto faz isso e teste com um único estímulo, uma vez o traço indica o eletrodo é no músculo.
4. Estimulação e gravação
- Agora você está pronto para começar a estimular o cérebro e as respostas de gravação da perna e músculos de vôo. Aplicar um estímulo (0,03 ms) curto através dos eletrodos estimulando a partir de 30 V e aumentando para 60 V até que você observe uma resposta (ou seja, uma contração muscular, e uma despolarização das células musculares como observado no monitor do computador). Para o restante do experimento, definir a tensão V 10/05 acima do limiar de resposta.
- Para medir a latência de resposta, dar pelo menos 5 estímulos único com um período de repouso de 5 segundos entre cada estímulo.
- Determinar a "freqüência de seguir", fornecendo trens de estímulos em diferentes taxas. Tipicamente de 10 trens de 10 estímulos são dados a 100Hz (10ms entre cada estímulo), 200Hz (5 ms entre cada estímulo) e 300Hz (3 ms entre cada estímulo). Permitir um período de descanso de 2 segundos entre cada trem de estímulos.
5. Resultados: As latências de resposta e de freqüência de seguir o Caminho de fibra gigante
- A latência de resposta é o tempo entre a estimulação do cérebro e despolarização do músculo. Este valor compara as latências de resposta para DLM e TTM a um único estímulo. Latências entre 0,7 e 1,2 ms para a via GF-TTM e entre 1,3 e 1,7 ms para a via GF-DLM indicam uma preparação saudável e adequada técnica de gravação. As latências podem variar com o genótipo, antecedentes genéticos, temperatura e idade.
Figura 1 (A e B). Representante traços mostrando as respostas registradas da TTMs e DLMS seguir um único estímulo aplicados ao cérebro. - Como mostrado aqui, as gravações da TTM mostram maior variabilidade em termos de amplitude e forma do potencial pós-sináptico (PSP) em relação aos das fibras DLM grande; esta variabilidade maior é devido ao pequeno tamanho das fibras musculares TTM. Esta variabilidade, entretanto, não afeta os valores de latência de resposta para a via Fiber-to-TTM Giant.
Traços figura 1 (C e D). Adicional 'latência de resposta "de 4 moscas individuais, tanto para a TTM e DLM. Nota TTM variabilidade exibem traços em forma PSP, mas latência de resposta não é afetada. Para DLM há menor variabilidade na forma PSP.
- Compare a "freqüência de seguir" a 100 Hz, 200 Hz e 300 Hz, calculando a proporção de respostas bem sucedidas (de 10) para ambos os DLM e vias TTM em cada freqüência de estimulação. A 100 Hz, tanto TTM e DLM siga as 01:01 estímulos. Em freqüências de estimulação acima de 100 Hz, as respostas DLM começar a mostrar falhas porque a sinapse química intermediária entre dois interneurônios não tem tempo suficiente para recuperar entre estímulos. As respostas TTM, no entanto, permanecem 1:1 com estímulos até mesmo além 300Hz.
Figura 2. Vestígios Representante mostrando a "freqüência de seguir" as gravações. A 100 Hz, tanto TTMs DLMS e responder a todos os 10 estímulos (esquerda). A 200Hz, as respostas DLM começam a falhar (asterisco).
6. Resultados representante
Tipo selvagem de latência curta-respostas (eletrodos estimulados são colocados nos olhos, ignorando receptores sensoriais e desencadeando o circuito GF diretamente) dependem do genótipo, antecedentes genéticos, temperatura e idade, e variam entre 0,7 e 1,2 ms para a via GF-TTM e 1,3 and1.7 ms para a via GF-DLM (Tanouye e Wyman, 1980; Thomas e Wyman, 1984; Engel e Wu, 1992; Allen e Murphey, 2007; Phelan et al, 2008;. Augustin et al, não publicado.) . Esta latência TTM é muito curto devido ao robusto GF-TTMn eletroquímica sinapse da via monossináptico ea latência mais DLM ocorre devido à natureza disynaptic da via, bem como a presença de uma sinapse química (PSI-DLMn). Intermediária e longa latência de respostas resultado (> 3 ms) a partir da ativação dos aferentes GF e são alcançados pelo uso de um estímulo menor intensidade ou o fornecimento de um sinal ("light-off") visual. A 100Hz tanto TTM e DLM deve seguir as 1:01 estímulos. Acima de 100 Hz respostas DLM vai começar a mostrar falhas como a sinapse química entre PSI eo DLMns não tem tempo suficiente para recuperar entre estímulos menos de 10ms separados. TTM respostas, no entanto, permanecerá 1:1 com estímulos até mesmo além 300Hz (Tanouye e Wyman, 1980; Engel e Wu, 1992;. Allen et al, 2007;. Martinez et al, 2007). Mutações no gene shakB, que codifica uma diferença Drosophila junção canal ("innexin"), aumentar significativamente a latência de resposta da via GF-TTM (~ 1,5 ms), enquanto o ramo GF-DLM não responde (Allen e Murphey, 2007; Phelan et al., 2008). A resposta mutante pode ser restaurado, estimulando diretamente gânglios torácicos, demonstrando que o efeito retardado não é devido a interrupção da transmissão neuromuscular. A capacidade de acompanhar a estimulação de alta freqüência também é prejudicada nestes mutantes em relação ao tipo selvagem voa onde os caminhos GF-DLM e GF-TTM são geralmente capaz de seguir 10 estímulos com relação 1:1 até 100 Hz e 300 Hz, respectivamente. É importante notar que essas freqüências estão consideravelmente acima freqüências de estimulação normais recebidos pelos músculos durante o vôo contratação sustentada (10/03 Hz) (Hummon e Costello, 1989).
Outro parâmetro utilizado para descrever a estabilidade das saídas GFS é o "período refratário", ou o tempo mínimo entre os pulsos de estímulo gêmeas que ainda produz duas respostas do músculo. O tempo refratário varia entre 1-4 ms para TTMs e 7-15 ms para DLMS. O período relativamente longo refratários para DLMS é devido ao relativamente lábil sinapses químicas na junção PSI-DLMn (Tanouye e Wyman, 1980; Gorczyca e Hall, 1984; Engel e Wu, 1992; Banerjee et al, 2004;. Allen e Godenschwege, 2010).
Discussion
Uma das coisas mais importantes que é preciso prestar atenção quando tentando obter gravações de alta qualidade é a orientação correta e de saúde da preparação. Idealmente, a mosca ainda deve estar vivo no final da sessão de gravação e responsivo aos estímulos elétricos. Para os eletrodos de gravação para penetrar de forma mais eficiente o exoesqueleto torácica, a mosca deve ser colado à superfície de modo a formar um ângulo reto com os eletrodos, se necessário, a inserção dos eletrodos pode ser facilitado através da remoção de uma parte da cutícula torácica dorsal com um bisturi de tungstênio expondo assim o músculo de vôo DLM (este passo oferece uma vantagem adicional de tornar mais difícil para as pontas dos eletrodos de vidro para quebrar). Além disso, o cuidado deve ser tomado para evitar empurrar os eletrodos através do DLMS subcuticularly localizado e TTMs. A cabeça da mosca devem ser bem protegidos para permitir a eletrodos estimulantes para ser devidamente inserido no cérebro e para impedi-los de que está sendo retirado durante a sessão de gravação.
Devido ao seu tamanho e bem descrita a morfologia, o GFS representa uma das vias mais acessíveis neuronal em Drosophila. A permeabilidade das sinapses elétricas a pequenas corantes marcador molecular de peso permite a visualização de neurônios eletricamente acopladas, e várias linhas disponíveis GAL4 torná-lo possível manipular os níveis de expressão de genes em um subconjunto de células ou grupos de células (Jacobs et al, 2000;. Allen et al., 2006) Além das vantagens acima mencionadas, ambos os componentes aferentes e torácica das propriedades do circuito de exibição, como recuperação de habituação, espontânea e dishabituation, tornando o GFS Drosophila um sistema modelo conveniente para o estudo da plasticidade neuronal (Engel e Wu, , 1996).
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Wellcome Trust uma subvenção para LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| S48 Square Pulse Stimulator | Grass Technologies | ||
| Stimulation unit | Grass Technologies | ||
| SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies | ||
| 5A two-channel intracellular Micr–lectrode Amplifier | Getting Instruments, Inc. | ||
| Digidata 1440A data acquisition system | Molecular Devices | ||
| Analogue-digital Digidata 1320 and Axoscope 9.0 software | Molecular Devices | ||
| Recording platform with manual micromanipulators | Narishige International | ||
| Light source | Fostec | ||
| Wild M5 stereomicroscope | Wild Heerbrugg | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| Borosilicate tubing for micr–lectrodes | Sutter Instrument Co. | ||
| P-95 Micropipette puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Microfil 34 gauge, 67 mm (electrode filler) | World Precision Instruments, Inc. | MF34G-5 | |
| Microdissection tools (forceps,…) | Fine Science Tools | ||
| Dissecting (stereo) microscope | Leica Microsystems | ||
| Faraday cage | Unknown | ||
| Other: plastic syringes, tungsten earth wire and NaOH-sharpened tungsten electrodes, KCl, wax platform, a PC with monitor... | |||
References
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