Summary
우리는 이기종 종양 microenvironments를 재현 마이크로 유체 장치의 제조 및 운영을위한 절차를 제시
Abstract
우리는 체외에서 이기종 입체 종양 조직에 대한 전달 및 약물의 전신 등급을 모방 마이크로 유체 장치를 개발했습니다. vasculature에 의해 전달 영양소가 가능한, 동작 및 괴사 세포 유형으로 구성된 이기종 microenvironments에 상승을주는, 종양의 모든 부분에 도달 실패합니다. 많은 암 약물은 효과적으로 세포의이 때문에 이질성의 모든 유형을 관통하고 치료하기 위해 실패합니다. 암 세포의 Monolayers는 어려운 체외 모델에 적합한 암 약물을 테스트하고,이 이질성을 모방하지 않습니다. 우리 마이크로 유체 장치는 소프트 리소그래피를 사용하여 PDMS에서 가공되었습니다. 매달려 드롭 방식에 의해 형성된 다세포 종양 spheroids은, 삽입 구속 장치에 직사각형 방에 한면에 연속 매체 재관류로 유지했다. 장치의 챔버의 사각형 형태는 조직 내에서 선형 그라디언트를 만들었습니다. 형광 얼룩은 일을 수량화하는 데 사용 된조직 내에서 apoptosis의 전자 다양성. 장치의 종양은 형광 chemotherapeutic 약물 doxorubicin, 시간 경과 현미경은 조직으로의 확산을 모니터링하는 데 사용하고, 효과적인 확산 계수가 추정되었다로 치료했다. 매달려 드롭 방법은 여러 암 세포 라인의 균일 한 spheroids의 빠른 형성을 허용했다. 이 장치는 최대 3 일에 spheroids의 성장을 활성화. 매체를 흐르는의 가까이에있는 세포 최소한 apoptotic이었고 그까지 채널에서이를 정확하게 혈관에 인접한 종양의 지역을 모방, 더 많은 apoptotic했다. doxorubicin 확산 계수의 추정 값은 인간의 유방암에서 이전에보고 된 값으로 동의했다. 고체 종양의 약물의 침투 및 유지가 효능에 영향을 미치는 때문에, 우리는이 장치가 약물의 행동을 이해하고, 새로운 암 치료학 개발에 중요한 도구입니다 있다고 생각합니다.
Protocol
1. 장치 제작
탄성 재료의 마이크로 유체 기능을 복제 더피 외에 기술 된 방법에 따라되었습니다. 1
- 믹스 엘라스토머 (polydimethylsiloxane, PDMS)과 9시 1분 무게 비율에 실리콘 엘라스토머 키트 (다우 코닝, 미들랜드, MI)에서 경화 에이전트와 4mm 두께의 층을 형성 할 수있는 마스터를 통해 부어. 가스를 제거하다 5 시간 동안 60 ° C에서 기포를 제거하고 혼합물을 치료합니다. 필은 탄성 중합체의 흐름 기능의 우표를 얻기 위해 금형에서 PDMS을 치료.
- 1.5 mm 생검 펀치 (Miltex, 뉴욕, PA)를 사용하여 유입구 및 유출구를위한 펀치 구멍은 드릴 프레스에 장착. 모든 파편을 빼낸다.
- 우표의 기능 측과 산소 플라즈마 식각 8 분 산소 플라즈마에 깨끗한 유리 슬라이드 될 수 있습니다. 그들 사이의 유대를 형성하기 위해 즉시 접촉 처리 표면을 가져와. 적어도 5 시간 동안 따뜻한 슬라이드 60 ° C에서 어셈블리를 유지s은 (는) 유대를 강화합니다.
- 가시 여성 luer 잠금 커넥터 (Qosina, Edgewood, NY)에 첨부 된 남성 luer 자물쇠의 인터페이스 커넥터를 사용하여 유입구와 콘센트에 0.032 "ID PTFE 관 (콜 Parmer, 버논 힐스, IL)를 연결합니다.
- 차단 밸브와 Y-커넥터 (, 그림 1 Upchurch 과학, 오크 하버, WA)를 사용하여 흐름 어셈블리를 설정합니다. 현미경에 장치를 장착합니다. 20G 1.5 "주사 바늘을 (Bioscience BD, 락빌, MD)를 사용하여 튜브에 주사기를 연결합니다.
2. 통일 Spheroids의 형성
Spheroids이 매달려 드롭 방법 2,3에 의해 형성되었다.
- 무균 세포 배양 후드 아래에 세포를 Trypsinize.
- 5 분 2000 rpm으로 trypsinized 세포를 원심 분리기 6 ML 신선한 매체에 resuspend. 원하는 최종 농도 (표 1)에 재고 솔루션을 희석.
- 48 잘 접시의 덮개를 제거하고 (STE)에 거꾸로 넣고후드를 rilized. 각도에 해당하는 원형 지역은 커버에 분명합니다. 습도를 유지하기 위해 소독 물 1 ML과 판의 각 우물을 입력합니다. micropipette를 사용하여 각 원형 지역의 희석 세포 솔루션의 20 μl 소적을 놔. 조심스럽게 커버를 반전하고 물방울이 우물의 가장자리를 만지지 않도록 보장, 잘 판 위에 놓으십시오.
- 일 지정 번호 (표 1)에 대해 37 ° C에서 잘 판을 품다. 회전 타원체는 각 매달려 드롭으로 구성됩니다.
3. 장치에 Spheroids 소개
해당 섹션에 대해 1 표 2 그림을 참조하십시오.
- 흐름 입구를 통해 소개 70 % 에탄올로 세정하여 장치를 검사. PBS는 세포 배양 매체를 버퍼 HEPES 다음과 후, 플러시. 튜브에 연결된 매체 주사기 S F 둡니다.
- 주사기 S P에 2-3 spheroids을 끌어 기포를 제거하는 주사기를 누르고, 그리고장치의 포장 유입구에 연결합니다.
- 오픈 유입 밸브 V 핀과 가까운 V 지느러미. 오픈 출구 밸브 V의 뿌루퉁과 가까이 V의 Fout. 아래 가리키는 바늘로 수직 포장 주사기를 잡고, spheroids는 바늘의 luer 잠금 커넥터에 주사기의 하단에 정착로 감상하세요. 포장 주사기와 감상 spheroids에 플런저를 밀어은 장치에 관 그리고 흐름을 입력합니다. 만 포장 출구 밸브가 열려 있기 때문에, 회전 타원체는 장치의 챔버를 입력하고 다시 (그림 2)에 게시하여 보관.
- 닫기 입구 밸브 V 핀 및 출구 밸브 V의 입술을 삐쭉 거리다. 주사기 펌프에 주사기 S F를 탑재합니다. 오픈 밸브 V 핀과 밸브 V Fout. 3 μl / 분에서 장치로 흐름 매체입니다.
4. Apoptosis 감지 에이전트의 소개 (CaspGLOW)
spheroids와 함께 방을 포장 한 후, U에 대한 평균을 허용검출 apoptosis 또는 치료 에이전트를 도입하기 전에, 영양 그라디언트 및 microenvironments를 구축 24 시간 P. 챔버의 조직은 상단과 하단의 뚫리지 벽과 접촉하기 때문에 조직의 두께를 따라 더 영양이 기울기 (0.15mm)가 없습니다. 부화 후 24 시간 후, 조직의 두께를 따라 모든 세포 레이어 따라서 동일하고 유일한 이질성까지는 흐름 채널의 방향에 있습니다.
- V 핀을 차단, 주사기 펌프를 중지 펌프에서 주사기 S F를 제거하고 0.25 μl / CaspGLOW 레드 활성 Caspase-3 마커 (적색 - DEVD-FMK의 ML을 포함하는 매체를 가진 주사기로 교체, Biovision, 마운틴 뷰, CA).
- 수동으로 이전 매체의 변위를 보장하기 위해 장치를 통해이 솔루션의 0.7 ML를 플러시. , 펌프에 주사기를 장착 흐름을 다시 시작하고, 열린 V 지느러미. 5-8시간 기간 동안 apoptosis는 t에 에이전트 diffuses을 감지그는 조직과 apoptotic 지역의 밝은 fluoresces. 이 농도에서 Apoptosis 감지 에이전트는 장치로 이후의 모든 흐름 솔루션에 유지됩니다.
참고 :
- 조직 이질성은 제 6 항에 설명 된대로 형광의 선형 강도 프로파일을 얻어 확인 할 수 있습니다. 프로필 조직이 셀 가능성에 대해 이기종 것을 확인, apoptosis에서 공간적 그라디언트를 표시합니다.
- CaspGLOW 그린 활성 Caspase-3 마커 (Fluorescein-DEVD-FMK, Biovision)도 apoptosis를 감지하는 데 사용할 수 있습니다. 이 아이콘 대신 붉은 색 형광을 rhodamine의 녹색 형광의 fluorescein이 포함되어 있습니다.
5. 치료 에이전트 소개
- 에이전트를 감지 apoptosis를 포함, 10 μM의 doxorubicin 히드로 클로라이드를 (시그마 - 알드리치, 세인트 루이스, MO Dox) 도입 단계 4.1-4.2에있는 절차를 따르십시오.
- therape의 흐름을 계속시간의 고정 기간 동안 utic 에이전트 솔루션입니다. 밸브 V의 핀을 종료하고 주사기 펌프를 끕니다. 에이전트를 감지 apoptosis가 포함 된 새로운 매체 주사기로 치료 주사기를 교체합니다. 지속적으로 현미경으로 조직을 모니터링하면서 24 -36 시간 동안 신선한 매체의 흐름을 허용합니다.
6. 약물 Diffusivity 계수의 시간 경과 현미경 및 추정
깨끗한 형광 데이터를 얻기 위해, 조직의 맨 아래 층에있는 현미경을 집중하여 모든 이미지를 획득. 수직 방향에 영양 기울기는 (제 4 참조)가 없기 때문에, 세포의 하단 레이어 위의 모든 다른 레이어의 좋은 대표입니다.
- 전체 수집 과정은 IPLab에 사용자 정의 스크립트를 (Bioscience BD, 락빌, MD)를 사용하여 자동화되었습니다. 10 배 배율의 포장 회전 타원체 매 30 분마다 (그림 3A)의 전송 빛과 형광 이미지를 취득. Acquir이전 Dox의 도입에 배경 형광의 전자 이미지입니다. 챔버의 대형 (1000 μm는 x 300 μm)를 수용 할 수 두 인접한 이미지와 함께 타일을 4 취득.
- 약물 diffusivity 계수의 수학 평가를 들어, 첫 번째 단계는 ImageJ를 사용하여 Dox 형광의 평균 선형 강도 프로파일을 생성하는 것입니다. 챔버의 조직을 포함한 관심있는 직사각형 영역 (ROI)를 선택합니다. 유동 채널에서 도보의 함수로 평균 농도의 프로파일을 생성하기 위해 플롯 프로필 명령을 사용하십시오. 3까지 다른 시간 지점에 대한 반복합니다.
- 조직에서 autofluorescence를 측정 할 수 Dox를 도입하기 전에 배경 형광 이미지를 얻을 수 있습니다. 획득 강도 프로필에서 평균 배경 형광 강도을 제거하고 얻기 위해 해당 최대 강도하여 각 프로파일을 정상화
(X, t) (도 3B). - 다음 단계는 종양 조직 내에서 Dox의 효과적인 확산 계수 D를 평가하는 것입니다. Dox 확산은 다음 방정식 (5)에 의해 표현 될 수있다
erfc는 보완 에러 함수이고, x는 채널에서 조직으로 거리이며, t는 Dox의 도입 (그림. 3 참조) 후 시간입니다. 고려 때마다 시점에서 다음과 같은 반복 구조를 사용하여- D에 대한 값을 추측
- 각 위치 X에있는 방정식의 오른쪽을 계산
- 양측 사이의 제곱 오류의 합을 (잔류) 계산
- 잔여을 최소화하기 위해 D를 수정
- 평균 조직의 Dox의 평균 유효 확산 계수를 추정하기 위해 각각의 시점에서 입수 D의 최적 값입니다.
(X, t) (도 3B). 
7. 대표 결과 :
<P 클래스 = "jove_content"> 마이크로 유체 장치는 1mm를 제공 X 0.3mm X 0.15mm 광학 입체 종양 조직의 성장에 대한 접근이 문화 챔버. 다세포 종양의 spheroids는이 방에 도착했는데, 다시 두 개의 필터 게시물에 의해 유지되었다. 매달려 드롭 방식은 일관 크기와 여러 세포 라인에서 모양의 spheroids의 빠른 형성을 허용했다. 최대 3 일에 Spheroids이 성공적으로 장치에 성장했다. 챔버의 성장은 spheroids 내 microenvironments의 재현 수정과 관련된되었습니다. Apoptosis는 유동 채널 및 조직에 높은 깊이의 가까이에 세포에 덜 발생했습니다. 장치는 종양 조직에서 doxorubicin의 확산 계수를 추정하는 데 사용되었습니다. 8.75 × 10 -7 cm 2의 -1의 획득 값은 9.1의 값에 동의 × 10 -7 cm 2의 -1은 인간의 유방암에 이전 6 전했다.| 셀 라인 | 필수 세포 농도 | 부화 시간 |
| LS174T | 300 세포 / μL | 2~3일 |
| T47D | 750 세포 / μL | 3-4일 |
| MDA-MB-231 | 150 세포 / μL | 5~6일 |
공중 드롭 Spheroids에 대한 표 1. 매개 변수
| 부분 | 기술 |
| S F | 흐름 주사기 |
| S P | 주사기를 포장 |
| V 핀 | 흐름 입구 밸브 |
| V 핀 | 입구 밸브를 포장 |
| V Fout | 유동 출구 밸브 |
| V의 입술을 삐쭉 거리다 | 출구 밸브를 포장 |
흐름 설정에 표 2. 주사기와 밸브
그림 1의 흐름 설정 V 핀과 V Fout의 도식 :. 흐름 입구와 출구 밸브, V 핀과 V의 입술을 삐쭉 거리다 : 포장 입구와 출구 밸브, S F와 S P : 흐름, 포장 주사기. 회전 타원체가 챔버 내로 비행 할 때 포장 주사기와 입구와 출구 밸브 패킹이 사용됩니다. 흐름 주사기와 흐름 입구와 출구 밸브는 이후 매체를 흘러하기 위해 사용됩니다.
그림 2. 장치의 챔버에 갇혀있는 회전 타원체의 개략적가. 회전 타원체는 장치의 챔버로 흘러되어 두 개의 필터 POS에 의해 차단되어챔버의 뒷면 TS.
그림 3. 장치의 종양 조직에서 Doxorubicin 확산. A.은 doxorubicin의 위치와 농도를 (빨간색) 표시, 조직의 전송 빛과 붉은 형광 이미지를 흡수 합병. 스케일 바는 250 μm를 나타냅니다. doxorubicin의 형광에서 B. 정규화 된 선형 강도 프로필.
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Discussion
종양의 vasculature은 희박한하고 병 7,8를 개발했다. vasculature 9 불구하고 공급 영양분과 약물에 액세스 할 수있는 혈관에서 (> 100 μm)까지 위치한 지역이 있습니다. 그 결과 이기종 microenvironment는 많은 chemotherapeutics (10)의 제한된 효과에 기여하고있다. 여기에 개발 된 마이크로 유체 장치는 체외에서, 동작 및 apoptotic 또는 괴사 세포를 proliferating 특징으로 이기종 종양의 microenvironment를 다시 만듭니다. 채널의 가까이에있는 세포 가능한하지만, 확산 제한 멀리 채널에서 영양 결핍 apoptotic 지역에 상승을 제공합니다. 유동 채널은 혈관을 상징하며 회전 타원체는 혈관에 인접한 종양 내 작은 지역을 나타냅니다.
장치에 spheroids을 도입하는 동안 방해가 조직의 흐름에 있기 때문에, 천공 입구 구멍 깨끗하고 파편은 무료입니다 있는지 확인챔버, 또는 깨진 회전 타원체를 채우기 위해 고장의 원인이됩니다. 포장 주사기는 spheroids을 소개 과정에서 수동으로 운영하고 있습니다. 유량은 챔버의 뒷면에있는 게시물을 회전 타원체를 밀어 방지하기 위해 가능한 한 낮은 유지해야합니다. 모든 마이크로 유체 장치와 마찬가지로, 특정 조치 주사기를 전환 특히, 시스템의 거품을 피하기 위해 이동해야합니다. 주사기이 전환 때마다 거품을 방지 도움이 될 것입니다 튜브의 작은 조각을 절단.
한 실험에서 여러 방 여러 트리트먼트 사용을 허용 할 수있는 장치에 수정 진행됩니다. 우리는이 장치가 고체 종양의 현재 암 치료학의 동작을 이해하는 데 사용될 수 있다고 생각합니다. 또한 새로운 암 치료를 개발하는 약물 검사 플랫폼을 만드는 데 쉽게 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 교부금의 국립 연구소 # 1R01CA120825-01A1, 매사추세츠 애 머스트 대학의 공동 바이오 메디컬 연구 (CBR) 프로그램, 그리고 Bhushan J. Toley에 대한 Isenberg 장학금에 의해 지원되었다. 우리는 굉장히 제임스 Schafer, 비디오 기사를 고용, 나레이터,이 비디오 편집기의 귀중한 공헌을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 184 Sil Elast Kit | |
| Miltex biopsy punch | MedexSupply | MTX-33-31AA | 1.5 mm |
| PTFE tubing | Cole-Parmer | EW-06417-31 | 0.032" ID |
| Male luer lock connector | Qosina | 65111 | |
| Barbed female luer lock connector | Qosina | 11556 | |
| Shut-off valve | Idex Health and Science | P-721 | |
| Y-connector | Idex Health and Science | P-513 | |
| 20G 1.5" needles | BD Biosciences | 305176 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| CaspGLOW Fluorescein | Biovision Inc. | K183-25 | |
| CaspGLOW Red | Biovision Inc. | K193-25 | |
| Doxorubicin Hydrochloride | Sigma-Aldrich | 44583 | |
| LS174T | ATCC | CCL-188 | Human Colon Carcinoma cell line |
| T47D | ATCC | HTB-133 | Human Ductal Carcinoma cell line |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | Human Mammary Adenocarcinoma cell line |
References
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