Summary
呼吸計測の酸化的リン酸化の解析と組み合わせてサポニン透過処理繊維の調製物は、ミトコンドリアの機能の統合的な評価を提供します。生理的および病的状態におけるミトコンドリア呼吸はミトコンドリアの相互作用、形態および生化学を含む様々な規制の影響を反映することができます。
Abstract
ミトコンドリアはエネルギー代謝、酸化ストレス、アポトーシス、老化、ミトコンドリアencephalomyopathiesおよび薬物毒性に関与しているとして、ミトコンドリアの機能の調査は、心臓生理学の重要なパラメータを表します。これを考えると、心臓のミトコンドリアの機能を測定する技術が求められています。ミトコンドリアの機能を測定するための統合的アプローチを採用して一つの技術は呼吸計測の酸化的リン酸化（OXPHOS）分析です。
呼吸計測OXPHOSアセスメントの原則は、クラーク電極を利用して酸素濃度を測定することを中心としています。透過処理繊維束は、酸素、密閉チャンバーの低下で酸素濃度を消費するように。選択された基質阻害剤 - 脱共役剤の滴定のプロトコルを使用して、電子は、ミトコンドリアの機能の評価を可能にする、電子伝達鎖の特定部位に用意されています。ミトコンドリアの機能の呼吸計測分析に先立ち、機械的および化学的準備のテクニックは、筋線維の筋鞘を透過するために利用されています。化学物質の透過性は、細胞構造を維持しながら選択的に細胞膜に穴をサポニン採用しています。
本論文では、徹底的にミトコンドリアOXPHOSを評価するために酸素消費量測定用のサポニン肌の心臓の繊維を準備するために必要な手順を説明します。また、アドバイスだけでなく、特定の基質のトラブルシューティングを、電子輸送チェーンの特定の部位でミトコンドリアの機能を決定するために使用されることがあります阻害剤とuncouplersが提供されています。重要なのは、記述されているプロトコルは、簡単に様々な動物モデルおよびヒト試料の心臓および骨格組織に適用されることがあります。
Protocol
1。試薬の調製
- 以前にマイナーな修正1で説明したように緩和し、保存溶液（RPソリューション）を準備する。簡単に言えば、RPのソリューションは、調整2.77mM CAK 2 EGTA、7.23mM K 2 EGTA、20mMのイミダゾール、0.5mmのジチオスレイトール、20mMのタウリン、50mmのK - MES、6.56のMgCl 2、5.7mM ATP、14.3mMクレアチンリン酸、pHは7.1、で構成されています室温（RT）。滅菌に0.45μmのフィルターを通してソリューションをフィルタリングします。 -20〜15 mLの部分（ファルコンポリプロピレンのチューブ）とストアに分割° Cレシピの説明を参照してください。
- ミトコンドリア呼吸計測ソリューション（MiR05）は、以前2記載のように調製し、60mmのカリウム-ラクトビオン酸、110mmの0.5mmのEGTA、3MMのMgCl 2 · 6H 2 O、20mMのタウリン、10mMのKH 2 PO 4、20mMのHEPES、1グラム/ L BSAが、含まれています30℃に調整ショ糖、pHを7.1℃に滅菌に0.45μmのフィルターを通してソリューションをフィルタリングします。 -20℃で50 mLの部分（ファルコンポリプロピレンのチューブ）と店に分けるレシピの説明を参照してください。 30℃MiR05のための酸素の溶解度係数は、° Cと37 ° Cは0.92 3です。
2。組織の準備
A.心臓の繊維機械の準備
- 手順は、カルガリー動物ケアの大学および使用委員会によって承認され、実験用の実験動物科学のガイドラインについては、カナダの協会を遵守した。
- マウスを固定するために頸椎脱臼は、推奨される方法です。また、ペントバルビタールナトリウムのintraperotinealケタミンとキシラジンの（IP）注射（それぞれ80及び10mg/kgより少ない、）または0.5mg/kgを投与することができる。注：ペントバルビタールナトリウムは、NADH脱水素酵素（複合体I）4の可逆的阻害剤です。
- 心臓を取り出して、氷（図1A）にRPの溶液の入ったシャーレに入れてください。慎重に解剖顕微鏡を使用して、任意の結合組織および/または脂肪を取り除く。
- 中隔に沿って半分に心をカット。左心室の心内膜の表面（図1B）から切断することによって組織の物品税は10 - 25mgの湿重量（WW）。切開は、心筋への機械的損傷を最小限にするために繊維の向きに沿っていることを確認します。
- 氷上でRPの溶液の入ったシャーレ別々に組織の切開、サブサンプルを置きます。解剖顕微鏡を使用すると、1〜1.5ミリメートルの直径と繊維配向に沿って長手方向の短冊状に心をカット。
- 2〜4ミリメートルの長さ（図1C）のメスでストリップを短くしてください。
- 細心の注意と鋭いピンセット機械的に独立した繊維束を使用する。最終的な繊維の束は、5mgのWWよりも多くの重量を量るない、接点の小さな領域で接続された6月8日繊維の最大値を、含まれている必要があります。 1ミリグラムWWの心臓の繊維が推奨されます。視覚的に、心臓組織は、元の赤から淡いピンクのカラーリング（図1D）に変更する必要があります。
B.心臓繊維束の化学準備
- 氷上で12ウェルプレートを置きます。
- カルシウム汚染5を最小限に抑えるために、RPのソリューションと同様（複数可）をすすいでください。
- 50ug / mLのサポニンとよく含む3mlの氷冷RPソリューションに機械的に作成した繊維束を転送します。注：サポニンの濃度は、溶液中の心筋の存在量に依存しない。
- 氷の上で穏やかな攪拌しながら20分インキュベートする。
C.心臓の繊維束の洗浄
- カルシウム汚染5を最小限に抑えるためにMiR05と新しい井戸をすすいでください。
- 新しいも含む10mLの氷冷MiR05に心臓のバンドルを転送する。氷の上で穏やかな攪拌しながら10分間インキュベートする。
- 新鮮なMiR05と（1-2）2-3回繰り返します。反復的な洗浄手順は、取り外しまたはサポニンを確保するためにATP、ADPおよび繊維束から残りの基質である。
D.湿重量の測定
- 呼吸器系解析への直接前に、湿重量は、鉗子を用いて吸着表面（ろ紙）上の個々の繊維の束（1ミリグラムWW）をブロットし、5秒間表面に光ファイバを保持するか、またはすべての水分が離れて邪悪なるまで取得されます。
- 別の吸収面を使用して、鉗子から余分な液体を取り除く。
- 風袋規模とプラスチックの繊維束を配置するには、質量測定のために船の重量を量る。
- 氷冷MiR05と新しいウェルに心臓の繊維束を転送します。繊維束は、酸素消費量の評価のための準備ができています。
3。呼吸計測OXPHOS分析
A.呼吸計測装置
- 研究室には2つのチャンバーの滴注入oxygraph（Oroboros Oxygraph2 - K、Oroborosインスツルメンツ）を利用し、推奨しています。に寄与する楽器の背景を最小限に抑えるOxygraph 2 - kの楽器のハードウェアとソフトウェアを利用することにより、大部分の高解像度の呼吸を提供しています（DatLab）酸素消費量のアーティファクト。
- oxygraphのキャリブレーションは、インストゥルメンタルの酸素消費量の交絡の影響を最小限に抑えるために不可欠なステップです。キャリブレーションは、多少oxygraphによって異なります。特定の手順についてはoxygraphのユーザマニュアルを参照してください。
B.描写品質管理/技術検証プロトコル
- MiR05がポーラログラフ酸素センサ（POS）および37℃MiR05の空気の飽和と平衡に十分な時間を与えることが° Cの前oxygraph室にネズミの心臓の繊維を置くことにoxygraphチャンバーハウジングに追加されていることを確認します。
- 心臓の繊維サンプルはoxygraph室の攪拌MiR05に配置されます。注意：スターラーバーはPVDF -またはPEEKコーティングされたスターラーバー（直径6mm）であることを確認。
- 酸素を充填したシリンジを用いて、250 550uMにoxygraph室の酸素濃度を増加させる。これは、酸素濃度が空気飽和6上記にも50％の透過処理fiberの準備のために制限されることに留意すべきである。酸素濃度の安定化のために5 - 10分を許可する。
- 25μlのハミルトンマイクロシリンジを用いて、それぞれ、10mmと2mmの最終濃度を得るために800mmのリンゴの2Mグルタミン酸と5μLの10μLを加える。これらの滴定は、基底の複雑なI -サポートされている呼吸（; ADPの不在状態2）の測定を可能にする。酸素フラックスは、滴定の約5分内に安定します。適切な準備は非常に再現性のある状態2個の酸素消費量を提供する必要があります。
- 安定した酸素消費量の2 - 5分続いて、複雑なI.いくつかの研究が集中のこの高を利用して最大の（状態3）ミトコンドリア呼吸のために、25μlのハミルトンマイクロシリンジを用いて、5mMの（飽和）の最終濃度のために500mmのADPの20μLを追加するADPの、しかし、90％以上の飽和はわずか5mm 7以上の濃度で到達することに注意することが重要です。
- 安定した酸素消費量の2 - 5分続いて、ミトコンドリア外膜（OMM）整合性の品質管理分析のために、10μLのハミルトンマイクロシリンジを使用して、10μMの最終濃度を得るために4mmのシトクロムcの5μLを加える。
- 安定した酸素消費量の2 - 5分続いて、ATP合成酵素を阻害するために、10μLのハミルトンマイクロシリンジを使用して、4mgの/ mLのオリゴマイシンの1μLを追加します。この滴定のステップでは、内側のミトコンドリア膜の無傷の検証を提供します。
- 呼吸計測OXPHOSアセスメント以下。試料は乾燥重量またはミトコンドリアのマーカーの測定のために保持されます。
- oxygraphのガラス室からMiR05を削除します。蒸留水（のddH 2 O）とチャンバーの少なくとも3回洗浄する。
- そのようなオリゴマイシンのようなエタノールに可溶阻害物質を除去するために100％エタノール（EtOH）でチャンバーを少なくとも3回洗浄する。
- oxygraph室を消毒するために永続的な30分を洗浄する最後の70パーセントエタノールと70％エタノールで3回のチャンバーを洗浄する。
- 新しい実験的な滴定のプロトコルのためのMiR05を添加する前にPOSを含むチャンバーがのddH 2 Oで少なくとも5回洗浄されていることを確認
- 検証の滴定は、呼吸の研究の実験的および診断目的に応じて適切に計画された滴定のプロトコルに含まれる可能性のある個々のプロトコル（図2）または滴定のように実行されることがあります。
4。代表的な結果：
図2に示すように、きちんと準備をマウス心臓線維の酸素消費量は、品質管理のプロトコルによって評価されます。図3-5は、間違って作成した心臓の繊維の一般的に遭遇する例を示します。呼吸調節率（RCR）は、呼吸で重要なインデックスを表します。このパラメータは、酸素消費量と酸化的リン酸化との間の結合を示している。透過処理繊維の調製では、RCRは状態4以上の状態2あるいは状態3から状態3に相対的な（オリゴマイシンおよび/またはアトラクチロシドによって誘発される、ATR）の呼吸の速度です。また、RCRは、品質保証のマーカーとして使用することができ、実験的または病理学的介入から5を生じる結合の変化を識別することができます。よく結合透過処理マウスの心の準備は1を利用したインキュベーション溶液、8、9日に応じて、3月6日の間にRCRをもたらす。
シトクロムcの滴定は、適切な組織の準備の検証として使用されます。シトクロムcはミトコンドリア内膜10で膜間腔に位置するタンパク質です。ミトコンドリアの外膜が損なわれていないときは、内因性のシトクロムcは膜間腔に残っており、外因性のシトクロムcの滴定は、呼吸（図2）にはほとんど影響を与えません。ミトコンドリアの外膜が損傷している場合は、内因性のシトクロムcは膜間腔から放出させることができると外因性のシトクロムまで呼吸を阻害するCに加え（図3）。適切な準備は、5〜15％範囲5のシトクロムcの添加後の酸素フラックスのわずかな上昇を経験してください。さらに、この実験的な滴定は、ミトコンドリア外膜の無傷での病理学的または実験的なストレッサーの影響評価が可能になります。シトクロムcの効果が発生した場合、組織および/またはサポニン濃度を減少させるの機械的な調製中のケアを確保する。
オリゴマイシンおよび/ またはATRの加算は、リーク呼吸の変化を評価するために使用され、酸素消費量は、ADPのリン酸化11に寄与しない。さらに、この滴定のステップは、適切なサンプル調製の検証として使用することができます。コントロールまたは野生型繊維は、このほかに敏感であると酸素フラックスの有意な減少を経験してください。比較的上昇酸素の流束で得られた低RCRおよびオリゴマイシンに対する感度が低下して/またはATRが準備中のミトコンドリア内膜（図4）への損傷を示している。ミトコンドリア内膜はミトコンドリア外膜にサポニン相対的で侮辱することの影響を受けにくいようにダメージはおそらく心臓の繊維の機械的分離の間に誘導される。しかし、両方の機械的および化学的調製物は、不適切に準備した心臓の繊維5、12を避けるために、それに応じて調整する必要があります。
マウス由来のサポニンスキンドファイバーの束は、以上の6時間のためのRPのソリューションまたは2時間以上の間MiR05溶液中に放置しないでください。図5に示すように基質阻害剤 - 脱共役剤の滴定への応答の欠如は、長期にわたる潜伏期間があることを示しています。その後の努力は、動物の犠牲と酸素消費の測定値との間の期間を最小限にする必要があります。
図1マウスの心臓の繊維束の機械的準備。 A.心臓全体直後に解剖。 B.前方左心室の10 - 25mgをサンプル。 C.心臓の組織は、直径1mmと2〜4ミリメートルの長さのストリップに分割。サポニンとの化学的透過処理の準備ができてD.最終的な心臓の繊維束。
図2。ポーラログラフアセスメントを活用した適切な組織調製の代表的な結果が。状態2個の酸素フラックスは、複雑な私基質グルタミン酸とリンゴ酸（M / G）によってサポートされており、大幅にADPの添加（状態3）に続く刺激される。外因性のシトクロムcの加算のない刺激効果は、ミトコンドリア外膜が無傷であることを示していない。オリゴマイシンの酸素消費量の感受性は、ミトコンドリア内膜の完全性はそのままであることを示唆している。 2 mLの密閉チャンバー内の酸素濃度は、青い線で識別されます。 2 mLの密閉チャンバー内の心臓組織のサンプルの酸素消費量は、赤色の線で表されます。リンゴ酸とグルタミン酸、M / G、アデノシン二リン酸、ADP、シトクロムc、シトクロムC、オリゴマイシン、O.
ポーラログラフアセスメントを活用した図3。シトクロムcの効果の検証テスト。状態2個の酸素フラックスは、複雑な私基質グルタミン酸とリンゴ酸（M / G）によってサポートされており、大幅にADPの添加（状態3）に続く刺激される。外因性のシトクロムcの加算の刺激効果は、ミトコンドリア外膜の完全性が損なわれることを示します。 2 mLの密閉チャンバー内の酸素濃度は、青い線で識別されます。 2 mLの密閉チャンバー内の心臓組織のサンプルの酸素消費量は、赤色の線で表されます。リンゴ酸とグルタミン酸、M / G、アデノシン二リン酸、ADP、シトクロムc、シトクロムCの
図4。ポーラログラフアセスメントを活用したミトコンドリア内膜の完全性の検証テスト。状態2個の酸素フラックスは、複雑な私基質グルタミン酸とリンゴ酸（M / G）とADPの添加（状態3）以下の酸素の消費量の比較的弱い刺激によってサポートされています。オリゴマイシンの酸素消費量の乏しい感度は、ミトコンドリア内膜が破損しているを示唆している。 2 mLの密閉チャンバー内の酸素濃度は、青い線で識別されます。 2 mLの密閉チャンバー内の心臓組織のサンプルの酸素消費量は、赤色の線で表されます。リンゴ酸とグルタミン酸、M / G、アデノシン二リン酸、ADPオリゴマイシン、O.
図5。MiR05の長期インキュベーション後のポーラログラフ的評価。酸素消費量は、（ADPの添加後、外因性グルタミン酸とリンゴ酸の添加（M / G）と酸素消費量に影響されないです。状態3）削減されます。外因性のシトクロムcの加算とオリゴマイシンの酸素消費量の非感受性のない刺激効果がないが低下している。ミトコンドリア外のインキュベーション溶液への追加に対する応答の欠如は、ミトコンドリアの機能的な安定性が損なわれているを示唆している。 2 mLの密閉チャンバー内の酸素濃度は、青い線で識別されます。 2 mLの密閉チャンバー内の心臓組織のサンプルの酸素消費量は、赤色の線で表されます。リンゴ酸とグルタミン酸、M / G、アデノシン二リン酸、ADP、シトクロムc、シトクロムCの
1。ノート：試薬の調製
K 2 EGTA 100mMのストック溶液の調製
| 試薬の名前 | 最終濃度（mM）を | g/100 mLのH 2 O |
| エチレングリコール-ビス- （2 - aminoethylether） - N、N、N'、N' -四酢酸（EGTA） | 100 | 3.805 |
| 水酸化カリウム（KOH） | 200 | 1.15 |
注意：室温で7.4にpHを調整する。
のCa 2 EGTA 100mMのストック溶液の調製
| 試薬の名前 | 最終濃度（mM）を | g/100 mLのH 2 O | コメント（省略可能） |
| エチレングリコール-ビス- （2 - aminoethylether） - N、N、N'、N' -四酢酸（EGTA） | 100 | 3.805 | 80〜熱° Cとやや炒め。 |
| 炭酸カルシウム（CaCO 3） | 100 | 1.001 | カルシウムは、ミトコンドリアを含む様々な細胞小器官の機能を調節するようにカルシウムの濃度が正確でなければなりません。すべてのCaCO 3の完全な可溶化を確認してください。最終的な解決策は完全に透明でなければなりません。 CaCO 3は最初に炭酸とCO 2蒸発の形成を活性化するためにEGTAおよびいくつかの水と混合される。この反応を80にまで加熱することによって加速され得る℃の |
| 水酸化カリウム（KOH） | 200 | 1.15 | CO 2の蒸 発が完了した後、KOHで中和する。 |
注意：室温で7.4にpHを調整する。
リラクゼーションと保存液の調製（RPソリューション）1
| 試薬 | 最終濃度（mM）を | リットル当たりの | コメント |
| K 2 EGTA | 7.23 | 72.3 mLの | |
| CAK 2 EGTA | 2.77 | 27.7 mLの | |
| イミダゾール | 20 | 1.36グラム | |
| ジチオスレイトール | 0.5 | ||
| タウリン | 20 | 2.52グラム | |
| アデノシン5' -三リン酸二ナトリウム塩水和物（ATP） | 5.7 | 3.14グラム | |
| クレアチンリン酸（PCR） | 14.3 | 4.0グラム | |
| 塩化マグネシウム（MgCl 2の ） | 6.56 | 0.624グラム | |
| K - MES | 50 | 14.0グラム |
注意：室温で7.1にpHを調整する
ミトコンドリア呼吸溶液の調製（MiR05ソリューション）2
| 試薬 | 最終濃度（mM）を | リットル当たりの | コメント（省略可能） |
| エチレングリコール-ビス- （2 - aminoethylether） - N、N、N'、N' -四酢酸（EGTA） | 0.5 | 0.190グラム | カルシウムのキレート剤として使用 |
| 塩化マグネシウム六水和物（MgCl 2の 6H 2 O） | 3.0 | 0.610グラム | 繊維の準備の品質は、Mg 2を使わずにテストすることはできません+。 |
| タウリン | 20.0 | 2.502グラム | タウリンは、細胞膜の安定化と抗酸化物質です。 20mMの心臓の細胞内濃度の存在です。 |
| リン酸二水素カリウム（KH 2 PO 4） | 10.0 | 1.361グラム | |
| 20.0 | 4.77グラム | ||
| カリウム、ラクトビオン | 60.0 | 0.5 Mの120 mLの K -ラクトビオン 在庫切れ | 0.5M K -ラクトビオン在庫：100mlのH 2 O、室温で7.0〜pHに35.83グラムラクトビオン酸を追加する。のddH 2 Oで200mLにボリュームを調整高い細胞内K +濃度をレプリケートするために使用。以前のKClが使用された、しかし、高いミトコンドリアクレアチンキナーゼの機能のCl -抑制する。 |
| スクロース | 110.0 | 37.65グラム | ROSのスカベンジャーとして使用。 |
| ウシ血清アルブミン（BSA） | 1グラム/ L | 1グラム | 膜安定化剤、抗酸化剤、そしてカルシウムと遊離脂肪酸のキレート剤として使用される。 |
注意：30℃で7.1にpHを調整する
3。ノート：呼吸計測OXPHOS解析
B.選択基板、uncouplersと阻害剤
ミトコンドリア呼吸の分析のための選択された基板のリスト
| 基材 | [株式] | 準備 | 2 mLのあたりのボリューム | [決勝] | コメント |
| アデノシン5' -二リン酸カリウム塩二水和物（ADP） | 500mmの | 246mg / mLののddH 2 O室温で7.1にpHを調整する。 -80℃で保存250μLのアリコートでC。 | 20ul | 5mMの | 維持するために一定のMg 2 + +呼吸計測の実験中に0.6モルのMgCl 2 /モルADPを追加。 |
| アスコルビン酸塩 | 800mmの | 0.1584グラム/ mLののddH 2 O 200μL分注し、-20℃で保存する。敏感な光 | 5μL | 2mMの | TMPDと並行して使用される基板として機能します。自動酸化のための酸素フラックスを補正する必要があります。 |
| チトクロームC | 4MM | 50mgの/ mLののddH 2 O 250μL分注し、-20℃で保存する。 | 5μL | 10uM | |
| シアン化カルボニル のp -（トリフルオロメトキシ） フェニルヒドラゾン（FCCP） | 0.1mmの | 0.254mg/10 mLの100％EtOHを。 500μL分注し-20℃でガラスバイアルに保管してください。 | 1μLのステップ | 脱共役剤として作用する。最大の電子輸送能力とリン酸化システムによる電子輸送のあらゆる制限を決定します。 | |
| グルタミン酸 | 2M | 0.3742グラム/ mLののddH 2 O室温で7.1にpHを調整する。 250μL分注し、-20℃で保存する。 | 10ul | 10mMの | NADH脱水素酵素（複合体I）の基質として作用する。 |
| リンゴ酸塩 | 800mmの | 0.1073グラム/ mLののddH 2 O室温で7.1にpHを調整する。 250μL分注し、-20℃で保存する。 | 5UL | 2mMの | NADH脱水素酵素（複合体I）の基質として作用する。一人で呼吸をサポートすることはできません。 |
| ピルビン酸塩 | 1M | 11mg/0.1 mLののddH 2 O新鮮な準備。 | 5μL | 2.5MM | NADH脱水素酵素（複合体I）の基質として作用する。 |
| コハク酸エステル | 1000mmの | 1.3505グラム/ 5 mLののddH 2 O室温で7.1にpHを調整する。 250μL分注し、-20℃で保存する。 | 20ul | 10mMの | コハク酸脱水素酵素（複合体II）のための基質として作用する。 |
| N、N、N'、N' -テトラメチル- pphenylenediamine 二塩酸塩（TMPD） | 200mmの | 47.1mg / mLののddH 2 O 200μLのアリコートで-20℃で自動酸化ストアを防ぐために、10mMの最終濃度に0.8Mアスコルビン酸を追加。 | 5μL | 0.5 | 青い色の外観で明らか原液の自動酸化。 TMPDと並行して使用される基板として機能します。自動酸化のための酸素フラックスを補正する必要があります。 |
ミトコンドリア呼吸の解析に選択阻害剤のリスト
| 基材 | [株式] | 準備 | 2 mLの商工会議所当たりの体積 | [決勝] | コメント |
| アンチマイシン | 5mMの | 27.4mg/10 mLの100％EtOHを。 250μL分注し、-20℃で保存する。 | 1μL | 2.5μM | コエンザイムQの阻害剤： シトクロム c酸化還元酵素（複合体III）</ TD> |
| アトラクチロシド | 50mmの | 40mgの/ mLののddH 2 O 250μL分注し、-20℃で保存する。 | 30μL | 0.75 | ATP合成酵素の阻害剤。 |
| オリゴマイシン | 4mgの/ mLの | 4mgの/ mLの100％EtOHを。 200μL分注し、-20℃で保存する。 | 1μL | ATP合成酵素の阻害剤。 | |
| シアン化カリウム | 1M | 65.1mg / mLののddH 2 O新鮮な準備。室温で7.1にpHを調整する | 1μL | 1mMの | シトクロム c オキシダーゼ （複合体IV）の阻害剤。以下のTMPDと自動酸化にアクセスするためのアスコルビン酸の滴定を利用する。 |
| ロテノン | 0.1mmの | 0.39mg/10 mLの100％EtOHを。 250μL分注し、-20℃で保存する。敏感点灯。 | 1μL | 0.05μM | NADH脱水素酵素（複合体I）の阻害剤。高濃度は、概説を開始チャンバー内にロテノンの保持を減らすために、しかし、必要な場合があります。 |
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Discussion
サポニン透過性心臓繊維の技術は、in vitroおよびミトコンドリアOXPHOSの酸素消費量の in vivo評価の間のユニークな妥協を提供しています。この手法の利点は、細胞構造が維持されるとして単離ミトコンドリアに比べて増加した生理学的関連性などがあります。原形質膜が劣化している間、ミトコンドリア12を含む細胞内膜構造、14、筋小胞体14は 、フィラメントと細胞骨格1、17はそのまま残ります。また、ミトコンドリアと細胞骨格1、17との間の相互作用も不変です。透過処理繊維のミトコンドリアが増加した安定性を示す。げっ歯類の繊維製剤は、最大24時間18,2のための安定性を示す6Hと人間の繊維試料を氷冷preservationsソリューションに保存することができます。インキュベーション溶液とミトコンドリア経験急速な平衡。これは、追加基質、阻害剤とuncouplers 1、5に対応して電子輸送チェーンのサイト固有の分析を直接制御できます。さらに、 その場のテクニックで 、これは組織のほんの数ミリグラムが必要です。
サポニンスキンドファイバー法の制限を無視することはできない。心臓のミトコンドリアは、2つの母集団で構成される、異機種があります。。subsarcolemmalと原線維間のその場ミトコンドリアの呼吸では、母集団5の間で区別する能力なしに、総ミトコンドリアの人口を評価しています。さらに、様々な細胞代謝と細胞質因子は、ミトコンドリアの機能を調節する。心臓の繊維のこれらの細胞質成分は、 生体内環境5 の正確な時ミトコンドリア評価不能になり透過処理中に失われます。
レポートの問題は重要な関心事です。酸素消費量の測定は湿重量か乾燥重量当たりに発現されることがあります、しかし、ミトコンドリアの密度は、組織量7％に発現呼吸フラックスの不均一性の大きな要因です。呼吸速度と変化の解釈が大きく、基準状態の選択によって影響されることを理解することが重要です。透過処理繊維の呼吸計測OXPHOSの結果の直接比較のために、金利は、ミトコンドリアDNA、クエン酸シンターゼの活性を、シトクロムcオキシダーゼ活性、および/ またはシトクロムAA3のコンテンツ19と共通の基準マーカからの相対を表明する必要があります。
要約すると、呼吸の分析と組み合わせて使用する透過処理繊維の調製は、心臓のミトコンドリアの統合機能の評価が可能になります。様々な病態や遺伝的モデルは、このテクニックを利用してきた。これらは、薬剤誘発性毒性の評価、高齢化、糖尿病、うっ血性心不全、虚血性損傷とミトコンドリアの生理学5、20上で酸化ストレスが含まれています。いくつかの優れた方法論のレビューとサポニン透過性繊維の技術およびポーラログラフ酸素消費量の評価の原稿は、以前は1、5、14、20を発表されていると強く推奨されています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、ヘルスリサーチおよびゲノムカナダのカナダの協会によってサポートされていました。 JSは、医学研究、ハートとカナダのストローク財団とカナダ糖尿病協会のためのアルバータヘリテージ財団からの給与支援賞を保持しています。研究室では、サポニン、透過性繊維の技術の取得中にOroborosインスツルメンツの技術支援に感謝したい。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
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