Summary
Saponin-permeabilized fiber förberedelser i samband med respirometric oxidativ fosforylering analys ger integrerad bedömning av mitokondriell funktion. Mitokondriell andning i fysiologiska och patologiska tillstånd kan spegla olika rättsliga influenser inklusive mitokondriella interaktioner, morfologi och biokemi.
Abstract
Utredning av mitokondriell funktion är en viktig parameter för hjärt fysiologi som mitokondrierna är involverade i energiomsättningen, oxidativ stress, apoptos, åldrande, mitokondrie encephalomyopathies och läkemedelstoxicitet. Med tanke på detta, teknik för att mäta hjärtats funktion i mitokondrierna är i efterfrågan. En teknik som använder en integrerad strategi för att mäta mitokondriefunktion är respirometric oxidativ fosforylering (OXPHOS) analys.
Principen om respirometric OXPHOS bedömning är centrerad kring att mäta syrehalten använda en Clark-elektrod. Som permeabilized fibern bunt förbrukar syre, syrehalt i sluten kammare minskar. Använda utvalda substrat-hämmare-uncoupler titrering protokoll, är elektroner ges till specifika platser i elektron transportkedjan, som möjliggör utvärdering av mitokondriell funktion. Innan respirometric analyser av mitokondriell funktion, mekaniska och kemiska förberedande tekniker utnyttjas för att permeabilize de sarcolemma av muskelfibrerna. Kemisk permeabilization sysselsätter saponin att selektivt perforera cellmembranet bibehållen cellulär arkitektur.
Detta dokument beskriver grundligt de steg som ingår i förberedelserna saponin skal hjärt fibrer för mätningar syreförbrukning att utvärdera mitokondriella OXPHOS. Dessutom, felsökning rådgivning samt särskilda substrat, är hämmare och uncouplers som kan användas för att bestämma mitokondrierna fungera på vissa ställen av elektronens transportkedjan tillhandahålls. Viktigt kan beskrivas protokollet lätt appliceras på hjärt-och skelettmuskler vävnad av olika djurmodeller och mänskliga prover.
Protocol
1. Reagensberedning
- Den avslappning och bevarande lösning (RP Solution) är beredd som tidigare beskrivits med smärre modifieringar 1. I korthet består RP Lösning av 2.77mM CAK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 20mm imidazol, 0.5mm ditiotreitol, 20mm taurin, 50mm K-MES, 6,56 MgCl 2, 5.7mm ATP, 14.3mm phosphocreatine, pH 7,1 justeras, i rumstemperatur (RT). Filtrera lösningen genom ett 0,45-ìm filter för att sterilisera. Dela upp i 15 ml (Falcon polypropenrör) och förvara vid -20 ° C Se diskussionen för recept.
- Det mitokondriella respiration Solution (MiR05) bereds som tidigare beskrivits 2 och innehåller 0,5 mm EGTA, 3mm MgCl 2 0,6 H 2 O, 20mm taurin, 10mm KH 2 PO 4, 20mm HEPES, 1g / L BSA, 60mm kalium-lactobionate, 110mm sackaros, pH 7,1, justerat vid 30 ° C. Filtrera lösningen genom ett 0,45-ìm filter för att sterilisera. Dela upp i 50 ml (Falcon polypropenrör) och förvara vid -20 ° C. Se diskussion för recept. Syret lösligheten faktorn för MiR05 vid 30 ° C och 37 ° C är 0,92 3.
2. Tissue Förberedelser
A. Hjärtat fibrer Mekanisk preparation
- Förfaranden godkändes av University of Calgary Djurvård och användning kommittén och följa den kanadensiska Föreningen för Laboratory riktlinjer husdjursvetenskap för experiment.
- Halsdislokation att immobilisera musen är den metod som föredras. Alternativt kan intraperotineal (IP) injektion av ketamin och xylazin (80 och 10mg/kg, respektive) eller 0.5mg/kg natrium pentobarbital ges. Obs: Natrium pentobarbital är en reversibel hämmare av NADH dehydrogenas (komplex I) 4.
- Ta ut hjärtat och placera den i en Petri-skål som innehåller RP lösningen på is (Figur 1A). Ta försiktigt bort all bindväv och / eller matfett i en dissektion mikroskop.
- Skär hjärtat i hälften längs membranet. Punktskatter 10-25mg våtvikt (ww) av vävnad genom att skära från endokardiet ytan av vänster kammare (Figur 1B). Se till att snitt längs fibern orientering för att minimera mekaniska skador på hjärtmuskeln.
- Placera dissekerade, delprov av vävnad i en separat Petri-skålen innehåller RP lösningen på is. Med hjälp av en dissektion mikroskop skär i hjärtat i längsgående remsor längs fiberorientering med en diameter på 1-1.5mm.
- Korta band med en skalpell i längder av 2-4mm (Figur 1C).
- Använda extrem försiktighet och vassa pincett mekaniskt separata fiberknippen. Slutlig fiberknippen bör innehålla högst 6-8 fibrer, som förbinds med små områden av kontakt, väger inte mer än 5 mg ww. Hjärtat fibrer av 1-3mg ww rekommenderas. Visuellt bör hjärtvävnad ändras från originalet rött till en ljusrosa färg (figur 1D).
B. Hjärt fiberknippen kemiskt preparat
- Placera en 12-brunnar på is.
- Skölj väl (s) med RP lösning för att minimera kalcium kontamination 5.
- Överför mekaniskt beredd fiberknippen till en brunn som innehåller 3 ml iskall RP lösning med 50ug / ml saponin. Obs: Koncentrationen av saponin beror inte på mängden hjärtmuskeln närvarande i lösningen.
- Inkubera i 20 minuter med mild omrörning på is.
C. Hjärt Fiber Bundle Tvätt
- Skölj en ny brunn med MiR05 att minimera kalcium kontamination 5.
- Överför hjärt buntar till den nya brunnen innehåller 10mL iskall MiR05. Inkubera i 10 min med lätt omrörning på is.
- Upprepa (1-2) 2-3 gånger med färsk MiR05. Den repetitiva tvätt steg är att se till att avskaffa eller saponin, ATP, ADP och resterande substrat från fiberknippen.
D. våtvikt beslutsamhet
- Direkt före luftvägarna analys, är våtvikt erhålls genom blotting den enskilde fiberknippen (1-3mg WW) på en absorberande yta (filterpapper) med hjälp av pincett och hålla fiber till ytan för 5s eller tills all fukt är onda borta.
- Använda en annan absorberande ytan, ta bort överflödig vätska från tång.
- Tare skalan och placera fiber bylte på en plast väger båten för massa mätning.
- Överför hjärt fiber bunten till en ny brunn med iskallt MiR05. Fibern bunt är klar för syreförbrukning bedömning.
3. Respirometric OXPHOS Analys
A. Respirometric Utrustning
- Laboratoriet använder och rekommenderar en två kammare titrering-injektion oxygraph (Oroboros Oxygraph2-k, Oroboros instrument). Den Oxygraph 2-k erbjuder hög upplösning respiration till stor del genom att utnyttja instrumentell hårdvara och mjukvara (DatLab) som minimerar instrumentella bakgrund som bidrar tillsyreförbrukning artefakter.
- Kalibrering av oxygraph är ett viktigt steg för att minimera störande effekter av instrumentala syreförbrukning. Kalibrering varierar något beroende på oxygraph. Se oxygraph bruksanvisning för särskilda förfaranden.
B. representant kvalitetsstyrning / Teknik valideringsprotokoll
- Se till MiR05 har lagts till oxygraph kammare bostäder polarographic syresensorer (POS) och ge tillräcklig tid för luft mättnad och jämvikt i MiR05 vid 37 ° C före sätta murina hjärt fibermaterial till oxygraph kamrarna.
- Den kardiella fiber proverna placeras i rörde MiR05 av oxygraph kamrarna. Obs: Kontrollera att rör staplarna är PVDF-eller PEEK-belagd omrörare barer (6 mm diameter).
- Använda en syre-spruta, ökar syrekoncentrationen i den oxygraph kamrarna till 250-550uM. Det bör noteras att syrehalten är begränsande för permeabilized fiber förberedelser till och med 50% över luftmättnadsvärdet 6. Låt 5-10min för syrehalten stabilisering.
- Med hjälp av en 25μL Hamilton mikrospruta lägga 10μL av 2M glutamat och 5μL av 800mm malat att framställa en slutlig koncentration av 10 mm och 2 mm, respektive. Dessa titreringar möjliggör bestämning av basala komplex I-stött andning (staten 2, frånvaro av ADP). Syre flux ska stabiliseras inom ca 5min titrering. Rätt förberedelse bör ge mycket reproducerbara tillstånd 2 syreförbrukning.
- Efter 2-5min av stabila syreförbrukning, lägg 20μL av 500mm ADP för en slutlig koncentration av 5mm (mättar), med hjälp av en 25μL Hamilton mikrospruta för maximal (State 3) mitokondrie andning genom komplexa I. Få studier använder denna höga av en koncentration av ADP, är det dock viktigt att notera att mer än 90% mättnad bara nås vid koncentrationer över 5 mm 7.
- Efter 2-5min av stabila syreförbrukning, lägg 5μL av 4mm cytokrom c för att få en slutlig koncentration av 10μM, med hjälp av en 10μL Hamilton mikrospruta för kvalitetskontroll analys av yttre mitokondriella membranet (OMM) integritet.
- Efter 2-5min av stabila syreförbrukning, lägg 1μL 4 mg / ml oligomycinkänslig, med hjälp av en 10μL Hamilton mikrospruta att hämma ATP-syntas. Denna titrering steg kommer att erbjuda validering av inre mitokondrie membranet intactness.
- Efter respirometric OXPHOS bedömningen. Provet sparas för torrvikt eller mitokondriella markör beslutsamhet.
- Ta MiR05 från glaset kamrarna i oxygraph. Tvätta kamrarna minst tre gånger med destillerat vatten (DDH 2 O).
- Tvätta kamrarna minst tre gånger med 100% etanol (EtOH) för att ta bort EtOH-lösliga hämmare såsom oligomycinkänslig.
- Tvätta kammare med 70% EtOH tre gånger med den slutliga 70% EtOH tvätta varar 30min att sterilisera oxygraph kamrarna.
- Innan tillägg av MiR05 för nya experimentella titrering protokollet att kamrarna innehåller POS tvättas minst fem gånger med DDH 2 O.
- Validering titreringar kan utföras som ett givet protokoll (Figur 2) eller titreringarna kan ingå i en välplanerad titrering protokoll beroende på experimentella och diagnostiska syften respiration studierna.
4. Representativa resultat:
Syreförbrukning i ordentligt förberedd murina hjärt fibrer utvärderas av kvalitetskontroll protokoll som visas i figur 2. Siffrorna 3-5 ger vanligt förekommande exempel på felaktigt förberedda hjärt fibrer. Den respiratoriska kontrollen (RCR) är ett viktigt index i respiration. Denna parameter anger kopplingen mellan syreförbrukning och oxidativ fosforylering. I permeabilized fiber preparat är RCR graden av andning i statliga 3 i förhållande till status 2 eller alternativt tillstånd 3 över statliga 4 (induceras av oligomycinkänslig och / eller atractyloside, ATR). Dessutom kan RCR användas som en kvalitetssäkring markör och kan identifiera förändringar i kopplingen till följd av experimentella eller patologiska interventioner 5. Väl kopplad permeabilized murin hjärtsjukdomar ger en RCR mellan 3-6 beroende på inkubationen lösningen används 1, 8, 9.
Titrering av cytokrom c används som en validering av riktig vävnad förberedelse. Cytokrom c är ett protein som finns i intermembrane utrymme i mitokondriernas inre membran 10. När det yttre membranet av mitokondrier är intakt, förblir endogena cytokrom C i intermembrane utrymme och titrering av exogena cytokrom C har en försumbar effekt på andningen (Figur 2). Om det yttre membranet av mitokondrier är skadad kan den endogena cytokrom c frigöras från intermembrane utrymme och kommer att hämma andning tills exogena cytokromc Dessutom (Figur 3). Rätt förberedelser bör uppleva endast en liten förhöjning i syre flux efter cytokrom c tillskott i 5-15% intervallet 5. Dessutom ger detta experimentella titrering för bedömning av patologiska eller experimentell stressfaktorer påverkan på mitokondriernas yttre membran intactness. Om ett cytokrom c effekt är erfarna, säkra vård under mekanisk utarbetandet av vävnad och / eller minska saponin koncentration.
Tillägget av oligomycinkänslig och / eller ATR används för att bedöma förändringar i läcker andning, syreförbrukning inte bidrar till ADP fosforylering 11. Dessutom kan detta titrering steg användas som en validering av lämplig provberedning. Control eller vildtyp fibrer bör vara lyhörd för detta tillägg och uppleva en betydande minskning av syre flux. En låg RCR och minskad känslighet för oligomycinkänslig och / eller ATR resulterar i en relativt förhöjda oxygen flux visar på skador i inre mitokondrie membranet under beredning (Figur 4). Skador kommer troligen framkallas under mekanisk separation av hjärt fibrer som det inre mitokondrie membranet är mindre känslig för förolämpning saponin i förhållande till det yttre mitokondriella membranet. Däremot kan både mekaniska och kemiska preparat måste justeras för att undvika felaktigt förberedda hjärt fibrer 5, 12.
Den saponin väggar fiberknippen från möss bör inte stanna kvar i RP lösning för mer än 6h eller MiR05 lösning för mer än 2 timmar. Bristande respons på substrat-hämmare-uncoupler titreringar som visas i Figur 5 kan indikera längre inkubationstider. Efterföljande insatser bör minimera perioder mellan djuroffer och syre mätningar konsumtion.
Figur 1. Mekanisk beredning av murina hjärt fiberknippen. A. Hela hjärtat omedelbart efter dissektion. B. En 10-25mg urval av de främre vänster kammare. C. hjärtvävnad delas upp i 1 mm diameter och 2-4mm remsor längd. D. Slutlig hjärt fiberknippen redo för kemiska permeabilization med saponin.
Figur 2. Representativa resultat av korrekt vävnad förberedelse utnyttja polarographic bedömning. Staten 2 syre flux stöds av komplexa Jag substrat glutamat och malat (M / G) och är betydligt stimuleras efter tillägg av ADP (State 3). Inga stimulerande effekt av exogena cytokrom c Dessutom visar det yttre mitokondriella membranet är intakt. Känslighet för syreförbrukning till oligomycinkänslig tyder på det inre mitokondriemembranbarriären är intakt. Syrekoncentration i en 2 ml sluten kammare identifieras med den blå linjen. Syreförbrukning i hjärtat vävnadsprov i en 2 ml sluten kammare representeras av den röda linjen. Malat och glutamat, M / G, adenosindifosfat, ADP, cytokrom c, Cyto c; oligomycinkänslig, O.
Figur 3. Cytokrom c effekten valideringstest utnyttja polarographic bedömning. Staten 2 syre flux stöds av komplexa Jag substrat glutamat och malat (M / G) och är betydligt stimuleras efter tillägg av ADP (State 3). Stimulerande effekten av exogent cytokrom c Dessutom visar det yttre mitokondriemembranbarriären äventyras. Syrekoncentration i en 2 ml sluten kammare identifieras med den blå linjen. Syreförbrukning i hjärtat vävnadsprov i en 2 ml sluten kammare representeras av den röda linjen. Malat och glutamat, M / G, adenosindifosfat, ADP, cytokrom c, Cyto C.
Figur 4. Inre mitokondriemembranbarriären valideringstest utnyttja polarographic bedömning. Staten 2 syre flux stöds av komplexa Jag substrat glutamat och malat (M / G) och en relativt svag stimulering av syreförbrukning efter tillägg av ADP (State 3). Dålig känslighet syreförbrukning till oligomycinkänslig tyder på det inre mitokondrie membranet är skadat. Syrekoncentration i en 2 ml sluten kammare identifieras med den blå linjen. Syreförbrukning i hjärtat vävnadsprov i en 2 ml sluten kammare representeras av den röda linjen. Malat och glutamat, M / G, adenosindifosfat, ADP oligomycinkänslig, O.
Figur 5. Polarographic bedömning efter långvarig inkubation i MiR05. Syreförbrukning är okänslig för exogen tillsats av glutamat och malat (M / G) och syreförbrukning efter tillägg av ADP (State 3) minskar. Det finns ingen stimulerande effekt av exogena cytokrom c tillägg och okänslighet för syreförbrukning till oligomycinkänslig upplevs. Bristande respons på tillägg till extramitochondrial inkubation lösning föreslår mitokondriella funktionell stabilitet äventyras. Syrekoncentration i en 2 ml sluten kammare identifieras med den blå linjen. Syreförbrukning i hjärtat vävnadsprov i en 2 ml sluten kammare representeras av den röda linjen. Malat och glutamat, M / G, adenosindifosfat, ADP, cytokrom c, Cyto C.
1. Anteckningar: Reagensberedning
Beredning av K 2 EGTA 100mm stamlösning
| Reagensets namn | Slutlig koncentration (MM) | g/100 ml H 2 O |
| Etylenglykol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacetic syra (EGTA) | 100 | 3,805 |
| Kaliumhydroxid (KOH) | 200 | 1,15 |
Obs: Justera pH till 7,4 vid rumstemperatur.
Beredning av Ca 2 EGTA 100mm stamlösning
| Reagensets namn | Slutlig koncentration (MM) | g/100 ml H 2 O | Kommentarer (frivilligt) |
| Etylenglykol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacetic syra (EGTA) | 100 | 3,805 | Värm till 80 ° C och rör milt. |
| Kalciumkarbonat (CaCO 3) | 100 | 1,001 | Kalciumkoncentrationen måste vara exakt som kalcium reglerar funktionen hos olika organeller, inklusive mitokondrierna. Säkerställa fullständig lösningsgörande av alla CaCO 3. Den slutliga lösningen skall vara helt genomskinligt. CaCO 3 är från början blandas med EGTA och lite vatten för att aktivera det bildas kolsyra och CO 2 avdunstning. Denna reaktion kan påskyndas genom uppvärmning till 80 ° C. |
| Kaliumhydroxid (KOH) | 200 | 1,15 | Neutralisera med KOH efter avdunstning av CO 2 är avslutad. |
Obs: Justera pH till 7,4 vid rumstemperatur.
Beredning av Avkoppling och Preservation Solution (RP Solution) 1
| Reagens | Slutlig koncentration (MM) | Per liter | Kommentarer |
| K 2 EGTA | 7,23 | 72,3 ml | |
| CAK 2 EGTA | 2,77 | 27,7 ml | |
| Imidazol | 20 | 1.36g | |
| Dithiothreitol | 0,5 | ||
| Taurin | 20 | 2.52g | |
| Adenosin 5'-trifosfat dinatriumsalt hydrat (ATP) | 5,7 | 3.14g | |
| Phosphocreatine (PCR) | 14,3 | 4.0g | |
| Magnesiumklorid (MgCl 2) | 6,56 | 0.624g | |
| K-MES | 50 | 14.0g |
Obs: Justera pH till 7,1 vid rumstemperatur
Beredning av Mitokondriell respiration Solution (MiR05 Solution) 2
| Reagens | Slutlig koncentration (MM) | Per liter | Kommentarer (frivilligt) |
| Etylenglykol-bis-(2-aminoethylether) - N, N, N ', N'-tetraacetic syra (EGTA) | 0,5 | 0.190g | Används som kelator av kalcium |
| Magnesiumkloridhexahydrat (MgCl 2 0,6 H 2 O) | 3,0 | 0.610g | Kvaliteten av fiber preparatet kan inte testas utan Mg 2 +. |
| Taurin | 20,0 | 2.502g | Taurin är ett membran stabilisator och antioxidant. 20mm är den intracellulära koncentrationen finns i hjärtat. |
| Kalium monobasiskt (KH 2 PO 4) | 10,0 | 1.361g | |
| 20,0 | 4.77g | ||
| Kalium-lactobionate | 60,0 | 120 mL 0,5 M K-lactobionate lager | 0,5 M K-lactobionate lager: Lägg till 35,83 g lactobionic syra till 100 ml H 2 O och pH-värdet till 7,0 vid RT. Justera volymen till 200 ml med DDH 2 O. Används för att replikera den höga intracellulära koncentrationen K +. Tidigare KCl användes dock de höga Cl-hämmar mitokondriefunktion kreatinkinas. |
| Sackaros | 110,0 | 37.65g | Används som en ROS asätare. |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 1g / L | 1g | Används som ett membran stabilisator, antioxidanter och kelator av kalcium och fria fettsyror. |
Obs: Justera pH till 7,1 vid 30 ° C
3. Anteckningar: Respirometric OXPHOS Analys
B. Välj substrat uncouplers och inhibitorer
Lista på utvalda substrat för mitokondriernas respiration analys
| Substrat | [Stock] | Förberedelser | Volym per 2 ml | [Final] | Kommentarer |
| Adenosin 5'-difosfat monokaliumsalt dihydrat (ADP) | 500mm | 246mg / ml DDH 2 O. Justera pH till 7,1 vid RT. Förvaras vid -80 ° C i 250 mikroliter alikvoter. | 20ul | 5mm | För att upprätthålla konstant Mg 2 + + under respiration experiment lägga 0,6 mol MgCl 2 / mol ADP. |
| Askorbat | 800mm | 0.1584g / ml DDH 2 O. Förvara vid -20 ° C i 200 mikroliter alikvoter. Ljuskänsliga | 5 mikroliter | 2mm | Fungerar som substrat när de används parallellt med TMPD. Måste korrigera för syrgas flux för självoxidering. |
| Cytokrom C | 4mm | 50 mg / ml DDH 2 O. Förvara vid -20 ° C i 250 mikroliter alikvoter. | 5 mikroliter | 10uM | |
| Karbonyl cyanid P-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | 0.1mm | 0.254mg/10 ml 100% EtOH. Förvara i glasflaska vid -20 ° C i 500 mikroliter alikvoter. | Steg om 1 mikroliter | Fungerar som en uncoupler. Bestämmer maximal kapacitet elektron transport och varje begränsning av elektron transporter genom fosforylering systemet. | |
| Glutamat | 2M | 0.3742g / ml DDH 2 O. Justera pH till 7,1 vid RT. Förvara vid -20 ° C i 250 mikroliter alikvoter. | 10ul | 10 mM | Fungerar som ett substrat för NADH dehydrogenas (komplex I). |
| Malate | 800mm | 0.1073g / ml DDH 2 O. Justera pH till 7,1 vid RT. Förvara vid -20 ° C i 250 mikroliter alikvoter. | 5ul | 2mm | Fungerar som ett substrat för NADH dehydrogenas (komplex I). Kan inte stödja andning ensam. |
| Pyruvat | 1M | 11mg/0.1 mL DDH 2 O. Bered en färsk. | 5 mikroliter | 2.5mm | Fungerar som ett substrat för NADH dehydrogenas (komplex I). |
| Succinat | 1000mm | 1.3505g / 5 ml DDH 2 O. Justera pH till 7,1 vid RT. Förvara vid -20 ° C i 250 mikroliter alikvoter. | 20ul | 10 mM | Fungerar som ett substrat för succinatdehydrogenas (komplex II). |
| N, N, N ', N'-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydroklorid (TMPD) | 200mm | 47.1mg / ml DDH 2 O. Lägg 0,8 askorbat till slutlig koncentration av 10 mM för att förhindra självoxidering Förvara vid -20 ° C i 200 mikroliter alikvoter. | 5 mikroliter | 0.5mm | Autooxidation av stamlösning uppenbara genom uppkomsten av blå färg. Fungerar som substrat när de används parallellt med TMPD. Måste korrigera för syrgas flux för självoxidering. |
Förteckning över vissa hämmare för mitokondriernas respiration analys
| Substrat | [Stock] | Förberedelser | Volym per 2 ml avdelningen | [Final] | Kommentarer |
| Antimycin A | 5mm | 27.4mg/10 ml 100% EtOH. Förvara vid -20 ° C i 250 mikroliter alikvoter. | 1 mikroliter | 2.5μM | Hämmare av coenzym Q: cytokrom c oxidoreductase (komplex III) </ Td> |
| Atractyloside | 50 mM | 40 mg / ml DDH 2 O. Förvara vid -20 ° C i 250 mikroliter alikvoter. | 30 mikroliter | 0,75 mm | Hämmare av ATP-syntas. |
| Oligomycinkänslig | 4 mg / ml | 4 mg / ml 100% EtOH. Förvara vid -20 ° C i 200 mikroliter alikvoter. | 1 mikroliter | Hämmare av ATP-syntas. | |
| Cyankalium | 1M | 65.1mg / ml DDH 2 O. Bered en färsk. Justera pH till 7,1 vid RT | 1 mikroliter | 1mm | Hämmare av cytokrom c oxidas (komplex IV). Utnyttja följande TMPD och Askorbat titrering för att komma autooxidation. |
| Rotenon | 0.1mm | 0.39mg/10 ml 100% EtOH. Förvara vid -20 ° C i 250 mikroliter alikvoter. Ljuskänsliga. | 1 mikroliter | 0.05μM | Hämmare av NADH dehydrogenas (komplex I). Högre koncentrationer kan behövas, men för att minska rotenon retention i kammaren börjar som beskrivs. |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den saponin-permeabilized hjärt fiber tekniken erbjuder en unik kompromiss mellan in vitro och in vivo utvärdering av mitokondrie OXPHOS syreförbrukning. Fördelar med denna teknik är bland annat ökad fysiologisk betydelse i jämförelse med isolerade mitokondrier som cellulära arkitektur är bevarad. Medan plasmamembran bryts ned, intracellulära membran strukturer inklusive mitokondrierna 12, 14, sarkoplasmatiska nätmagen 14, myofilamenten och cytoskelettet 1, 17 förblir intakt. Dessutom är samspelet mellan mitokondrierna och cytoskelettet 1, 17 är också oförändrade. Mitokondrierna i permeabilized fibrer visa ökad stabilitet. Gnagare fiber förberedelser kan lagras i iskallt preservations lösningar för 6h och mänsklig fiber prover visar stabilitet i upp till 24h 18,2. Mitokondrier erfarenhet snabb jämvikt med inkubation lösningen. Detta möjliggör direkt kontroll över platsspecifika analys av elektron transportkedjan som svar lagt substrat hämmare och uncouplers 1, 5. Dessutom kräver detta på plats tekniken bara några milligram av vävnad.
Begränsningar av saponin skal fiber teknik kan inte ignoreras. Hjärtat mitokondrierna är heterogena, bestående av två subpopulationer,. Subsarcolemmal och interfibrillar In situ mitokondrie respiration bedömer den totala mitokondrie befolkningen utan möjlighet att skilja mellan subpopulationer 5. Dessutom olika cellulära metaboliter och cytosola faktorer som reglerar mitokondriell funktion. Dessa cytosoliskt komponenter i hjärt fibrerna går förlorade under permeabilization process som leder till en oförmåga att bedöma mitokondrie på exakt in vivo-miljö 5.
Rapportering frågor är en viktig fråga. Syreförbrukning mätningar kan anges per våtvikt eller torrvikt är dock mitokondrie täthet en viktig faktor i luftvägarna flux heterogenitet uttryckt per vävnadsmassa 7. Det är viktigt att förstå att tolkningen av andningsfrekvens och förändringar är starkt präglat av valet av referens stat. För direkta jämförelser av respirometric OXPHOS resulterar i permeabilized fibrer, måste priserna uttryckas i förhållande till en gemensam referens markör som mitokondrie-DNA, citrat syntasaktivitet, cytokrom c oxidas aktivitet och / eller cytokrom Aa3 innehåll 19.
Sammanfattningsvis tillåter permeabilized fiber preparat som används i samband med respiration analys för bedömning av integrerande funktion av hjärt mitokondrier. Olika sjukdomstillstånd och genetiska modeller har utnyttjat denna teknik. Dessa inkluderar utvärdering av läkemedelsinducerad toxicitet, åldrande, diabetes, hjärtsvikt, ischemisk skada och oxidativ stress på mitokondriell fysiologi 5, 20. Flera goda metodologiska omdömen och manuskript av saponin-permeabilized fiber teknik och polarographic syreförbrukning bedömning har tidigare publicerats 1, 5, 14, 20 och kan verkligen rekommenderas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research och Genome Canada. JS har utmärkelser lön stöd från Alberta Heritage Foundation för medicinsk forskning, Hjärt-och Stroke Foundation i Kanada och den kanadensiska Diabetes Association. Laboratoriet vill tacka för det tekniska biståndet till Oroboros Instrument under förvärvet av saponin-permeabilized fiber teknik.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma-Aldrich | A-6003 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Ascobic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Atractyloside | Sigma-Aldrich | A6882 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9779 | |
| Ethylene glycol-bis-(2-amin–thylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glutamic acid | Sigma-Aldrich | 27647 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Ketamine | Pfizer Pharma GmbH | Ketaset | |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| Malic acid | Sigma-Aldrich | M1000 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Phosphocreatine | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Succinic acid | Sigma-Aldrich | S3674 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T8691 | |
| Xylazine | Bayer AG | Rompun | |
| ddH2O | |||
| Ice | |||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | ||
| Kimwipes | VWR international | 21905-026 | |
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-368 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR international | 89004-364 | |
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | |
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| Sterile Surgical Blade | VWR international | BD371610 | |
| 0.45-μm Syringe filters | VWR international | CA28145-485 | |
| pH meter | VWR international | CA11388-308 | |
| Glass Petri dishes | VWR international | 89000-300 | |
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR international | 82050-926 | |
| Plate Stirrer | VWR international | 97042-594 | |
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | |
| Weigh Scale | VWR international | CA11278-162 | |
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | |
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | |
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | |
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | |
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR international | 89106-750 | |
| Dissecting Microscope | Olympus Corporation |
References
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. Heldmaier, G., Klingenspor, M. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e, Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 Forthcoming.
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O'Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 Forthcoming.
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. Morad, M. , Academic. New York. 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. , Univ. Press. Vol 3. Modern Trends in BioThermoKinetics 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. Dykens, J., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. 327-352 (2008).
