El establecimiento de embriones de ratón con células madre neurales Cultura mediante el ensayo de neuroesfera

Summary

Este protocolo de vídeo se muestra la aplicación de la prueba neuroesfera para el aislamiento y la expansión de las células madre neurales de las eminencias ganglionares del día embrionario 14 de cerebro de ratón.

Abstract

En los mamíferos, las células madre actúa como una fuente de células indiferenciadas para mantener génesis y renovación celular en diferentes tejidos y órganos durante el ciclo de vida del animal. Que potencialmente pueden reemplazar las células que se pierden en el proceso de envejecimiento o en el proceso de lesiones y enfermedades. La existencia de células madre neurales (NSC) fue descrita por primera vez por Reynolds y Weiss (1992) en los mamíferos adultos del sistema nervioso central (SNC) utilizando un nuevo sistema de suero libre de la cultura, el ensayo neuroesfera (NSA). El uso de este ensayo, también es posible aislar y expandir NSCs de diferentes regiones del sistema nervioso central embrionario. Estos in vitro NSCs ampliado son multipotentes y pueden dar lugar a los tres principales tipos de células del sistema nervioso central. Mientras que la NSA parece relativamente simple de realizar, la atención a los procedimientos demostrado aquí se requiere a fin de lograr resultados confiables y consistentes. Este video demuestra prácticamente la NSA para generar y ampliar NSCs a partir del día 14 embrionario del ratón tejido cerebral y ofrece detalles técnicos por lo que uno puede lograr culturas neuroesfera reproducible. El procedimiento incluye la recolección de embriones de ratón E14, microdisección del cerebro para recoger las eminencias ganglionares, la disociación de los tejidos recolectados en el medio de NSC para obtener una suspensión de células individuales, y, finalmente, placas células en cultivo NSA. Después de 5-7 días en la cultura, las neuroesferas primarios resultantes se pasan a ampliar aún más el número de la NSCs para futuros experimentos.

Protocol

1. Configuración básica antes de proceder a la disección:

1. Volumen apropiado de medio completo NSC se prepara mezclando NeuroCult NSC medio basal y NeuroCult Suplementos NSC proliferación en una proporción de 9:1, respectivamente.
2. El medio es calentado en un baño de agua a 37 ° C.
3. Frío HEPES buffer medio esencial mínimo (HEM), con alta concentración de antibióticos (10%) se prepara para la disección y el propósito de lavado. Por otra parte, NSC medio basal con la suplementación de los antibióticos también pueden ser utilizados para este propósito.
4. 25-30 ml de HEM resfriado que contienen antibióticos se distribuye en tubos de 50 ml estériles para la recolección de los embriones.
5. Varias placas de Petri de plástico de 10 cm se necesitan para mantener los embriones y el cerebro durante la disección y también para mantener los tejidos disecados.
6. Los instrumentos quirúrgicos, necesarios para la toma de embriones (tijeras grandes, pequeñas tijeras con punta, pinzas grandes, pequeñas pinzas curvas) o para la disección del cerebro embrionario (pequeñas pinzas, pinzas finas curvas, ángulo de 45 ° pinzas finas y pequeñas tijeras) se esterilizan con esterilizador de cuentas de vidrio a 250 ° C o de otros métodos disponibles autoclave.
7. Microscopio de disección se limpia con alcohol al 70% y establecer dentro de una campana de flujo laminar o PC2.

2. La recolección E14 cerebro de ratón y Micro Disección:

1. Una vez acoplado del ratón embarazadas, se anestesia el día 14 ^de gestación de acuerdo a su protocolo institucional de los animales aprobados.
2. Dislocación cervical se realiza para asegurarse de que el animal no sufre dolor y la angustia.
3. El ratón anestesiado se coloca en la espalda a un pañuelo de papel absorbente, y el abdomen se enjuaga con etanol al 70% para esterilizar la zona.
4. La piel sobre el abdomen se sujeta con una pinza grande, y luego la piel y la fascia se corta con unas tijeras grandes para exponer la cavidad abdominal y los cuernos uterinos.
5. El útero se eliminan con pequeñas pinzas y tijeras y se transfieren a un tubo que contiene Erlenmeyer de 50 ml HEM frío.
6. Los tejidos uterinos son transferidos a la campana y luego se enjuaga una o dos veces con un volumen suficiente de agua dulce fría HEM estéril para eliminar posibles contaminantes como la sangre y el cabello.
7. Los tejidos del útero se transfieren a una placa de Petri de 10 cm que contiene HEM frío.
8. Los cuernos uterinos se abren usando unas pequeñas pinzas y tijeras curvas y los embriones se transfieren a un plato de 10cm nueva, que contiene HEM frío.
9. Las cabezas de los embriones están separados a nivel de la médula espinal cervical y trasladado a otra placa de Petri que contiene HEM frío.
10. La placa de Petri se transfiere en un microscopio de disección para extraer el cerebro del cráneo.
11. Los jefes se llevan a cabo con unas pinzas finas curvas de la parte caudal fin de la cara dorsal de la cabeza estén mirando hacia arriba. Utilizando micro-tijeras, en primer lugar un corte horizontal se realiza por encima de los ojos y luego continuó en la línea media de la frente hacia la parte posterior de la cabeza. Asegúrese de cortar la piel y el cráneo y no dañar el cerebro subyacente.
12. El cerebro es extraído del cráneo presionando los bordes de la sección de corte en un movimiento hacia atrás usando las pinzas curvas. Este procedimiento se continúa hasta que todos los cerebros se retiran de los cráneos.
13. El cerebro se mantiene constante con las pinzas curvas para que el lado dorsal es hacia arriba y luego utilizando micro tijeras se realiza un corte en la corteza de cada hemisferio se extiende desde el bulbo olfatorio a la parte posterior del hemisferio para exponer las eminencias ganglionares.
14. Usando las pinzas curvas en una mano y la pinza en ángulo de 45 ° en el otro, las solapas de corte de corteza se extienden y las eminencias ganglionares son diseccionados.
15. El tejido disecado se coloca en una placa de Petri estéril de 10 cm, y este procedimiento se repite hasta que todos los cerebros han sido micro-disección.
16. Trozos de tejido se recogen con 1 mL de medio NSC en una punta de pipeta ml y se transfiere a un tubo de centrífuga de 15 ml.
17. El tejido se disocia completamente pero con suavidad al presionar la punta de la pipeta a la parte inferior del tubo y pipetear la suspensión arriba y abajo. De esta manera los grupos se dividen en células individuales. Pipeteo se lleva a cabo 3-4 veces por lo que una suspensión lechosa como se consigue. Luego, la suspensión se deja reposar durante 1-2 minutos, así como grupos no disociada precipitados.
18. Casi toda la suspensión celular se transfirió a otro tubo y luego otro de 1 ml de medio NSC se añade a los agregados restantes y disociado a la celda individual como se describe.
19. El contenido de los tubos se agrupan y se centrifuga durante 5 minutos a temperatura ambiente, a 700rpm (110g).
20. El sobrenadante se aspira a correr por la actual pastilla, y las células se resuspenden en 1 ml de medio completo NSC.
21. El medio es ligeramente pipeta arriba y abajo paratener una suspensión homogénea de células individuales.
22. 10 l de la suspensión celular se mezcla con 90 l de azul tripán para llevar a cabo un recuento de células.
23. Finalmente, las células son colocadas en la densidad de 2x10 ⁵ células / ml en medio completo suplementado con NSC 20ng / ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF). 5 ml de medio se utiliza para la T25, T75 de 20 ml y 40 ml para T175 frascos.
24. Neuroesferas se forman en 5-7 días cuando se incuba a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO _2. En 6-7 días, las esferas deben medir entre 150-200 micras y estará listo para la subcultura (pasaje).

3. Pases y Ampliación de NSCs embrionarias:

1. Cuando las neuroesferas están listos para la subcultura (150-200 micras de diámetro), el medio de esferas de suspensión se retira de los frascos, colocado en un tubo estéril del tamaño adecuado del cultivo de tejidos, y se centrifuga a 700 rpm (110 g) durante 5 minutos a a temperatura ambiente.
2. El sobrenadante se descarta y las esferas se resuspenden en 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA.
3. La suspensión celular se incuba en un baño de agua a 37 ° C durante 2-3 minutos, luego un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se utiliza para detener la actividad de la tripsina.
4. La suspensión celular es una pipeta suavemente hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que la tripsina se ha eliminado por completo.
5. La suspensión celular se centrifuga a 700 rpm (110 g) durante 5 min. Luego, se retira el sobrenadante y las células se resuspenden en 1 ml de medio completo NSC.
6. 10 l de la suspensión celular se mezcla con 90 l de azul tripán para llevar a cabo un recuento de células.
7. Las células se sembraron a una concentración de 5x10 ⁴ células / ml en medio completo suplementado con NSC 20ng / mL de EGF en un frasco de cultivo de tejido del tamaño adecuado. 5 ml de medio se utiliza para la T25, T75 de 20 ml y 40 ml para T175 frascos.
8. Neuroesferas secundaria se forman en 5-7 días cuando se incuba a 37 ° C en una incubadora humidificada con 5% de CO _2.

4. Los resultados representativos:

En primaria embrionarias cultura NSC, la mayoría de las células se convertirá en hipertrófica y se unen a los platos de cultivo de tejidos en placas. Mientras que la mayoría de las células mueren o se diferencian, después de 2-3 días, las células proliferantes que pequeños grupos de células que se desprenden del sustrato (Figura 1). Formación de grandes agregados esferoidales en las primeras 48 horas de la cultura no debe ser confundido con esferas primarias. La formación de agregados depende principalmente de la cantidad de escombros y no disociada grupos de tejidos en la cultura. Neuroesferas verdadera fase son brillantes y más esférico a medida que aumenta el tamaño (Figura 2). Microspikes pequeña aparece en la superficie exterior de las esferas viable y saludable (Figura 3). Después de 5-7 días, las esferas deben ser redondas, pero no compactada, y debe medir entre 150 y 200 micras de diámetro. Si neuroesferas se les permite crecer demasiado grande (después de 90-10 días de cultivo), que podrían formar agregados o ser de color oscuro debido a la muerte celular en el centro de las esferas (ver video). Neuroesferas grandes con el tiempo podría empezar a diferenciar in situ (fijación al sustrato y la migración hacia la periferia). También es difícil disociar neuroesferas grandes y subcultura de ellos.

Figura 1. Primaria E14 cultura NSC 3 días después de la siembra. Las flechas indican los grupos de la proliferación de comités directivos. Original de la ampliación; 20x

Figura 2. Primaria E14 cultura NSC siete días después de la siembra. Original de la ampliación; 10 veces

Figura 3. Paso un E14 neuroesferas cinco días después de la siembra. Tenga en cuenta los picos de micro-(flechas) en la periferia de las esferas. Original de ampliación; 20x

Discussion

El ensayo neuroesfera es el método de elección para el aislamiento y la expansión de las células madre neurales ^1-5 debido a su sencillez y reproducibilidad. Este ensayo es una herramienta invaluable para generación a gran escala de células precursoras indiferenciadas del SNC, que podrían ser utilizados para los estudios in vitro e in vivo. Cabe destacar que neuroesferas podrían ser generados por la bona fide las células madre neuronales y progenitores más restringido. Por lo tanto, el cálculo de la frecuencia de formación de neuroesfera simplemente sobreestima el número de bona fide NSCs en cualquier población de células neurales dado ^6. Para estimar la frecuencia de bona fide NSCs, se recomienda utilizar la Colonia La formación de ensayo de células neuronales (N-ACCP), que ha sido desarrollado para este propósito ^7.

Para tener una consistente alta cultura neuroesfera calidad de E14 NSCs, se recomienda:

1. Para preparar los elementos necesarios antes de comenzar a cosechar los embriones.
2. Para mantener los embriones en HEM frío o medio base Consejo de Seguridad Nacional a través de la disección.
3. Para llevar a cabo la disección lo más rápidamente posible (dentro de 1 h), el tejido se vuelve blando y pegajoso con el tiempo y pueden ser difíciles de diseccionar.
4. No dejar que la esfera de crecer demasiado. Por lo general, deben ser sub-cultivo cada 5-7 días, dependiendo del tamaño de las esferas.
5. Para trypsinize las esferas del tamaño de 150-200 micras por 2-3 minutos. Dejando la tripsina de más de 3 minutos causa daños a las células y la eficiencia de la esfera de la formación de la voluntad y la disminución de las células tienden a colocar las placas de cultivo y se diferencian.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium	Medium	Stem Cell Technologies	05700
NeuroCult NSC Proliferation Supplements	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05701
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
Fine curved forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11251‐35
Small fine forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11272‐30
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050‐10
Fine scissors	Surgical tools	World Precision Instruments, Inc.	500216
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
*To make HEM, mix 1×10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.