טיהור אבות מן שרירי השלד

Summary

שיטת ניתוק האנזימטית, תיוג משטח וטיהור על ידי cytometry זרימה של fibro / adipogenic ואת אבות myogenic מן שרירי השלד Murine.

Abstract

שריר השלד מכיל אוכלוסיות מרובות אבי ממוצא עובריים ברורים הפוטנציאל ההתפתחותי. אבות Myogenic, בדרך כלל תושבי "העמדה תא הלוויין" בין הממברנה myofiber פלזמה הממברנה laminin עשיר במרתף ensheaths זה, הן עצמית חידוש התאים מחויבים אך ורק ^1,2 את השושלת myogenic. תיארנו לאחרונה מדרגה שנייה של אבות כלי קשורה כי ניתן להפיק myofibroblasts ו adipocytes לבן, אשר מגיב נזק על ידי הפצת ביעילות הכניסה ומספקת תמיכה trophic לתאי myogenic במהלך התחדשות רקמות ^3,4. אחת מבחני האמינים ביותר לקבוע את הפוטנציאל ההתפתחותי ועל ההתחדשות של האוכלוסייה תא נתון מסתמך על הבידוד שלהם השתלת ^5-7. לשם כך יש לנו אופטימיזציה פרוטוקולים לטיהור שלהם על ידי cytometry לזרום שריר ניתק enzymatically, אשר נתאר במאמר זה. האוכלוסיות שהושגו בשיטה זו תכלול גם תאים המושבה myogenic או fibro / adipogenic יוצרים: אין סוגי תאים אחרים ומסוגלים להרחיב במבחנה או לשרוד במשלוח vivo. עם זאת, כאשר אוכלוסיות אלו משמשים מיד לאחר למיין את ניתוח מולקולרי (למשל qRT-PCR) יש לזכור כי תת מיון טרי עשוי להכיל תאים מזהמים אחרים כי חוסר היכולת של יוצרים מושבות או engrafting הנמענים.

Protocol

1. אוסף רקמות:

1. שימוש בעכברים בין 7 ל 12 שבועות. בדרך כלל, לפחות שני בעלי חיים משמשים: האחד הוא להגדיר את FACS צבע שולט יחיד נדרש פיצוי עבור הקרינה מינוס אחד דגימות בקרה אלוטיפ. השני הוא מדגם בפועל למיון.
2. להרדים את העכברים משאיפת CO ₂ או לפי פרוטוקול אתיקה של בחירה. עכברים מניחים על מגבת נייר, פונה כלפי מעלה, ולרסס עם אתנול 70% ביסודיות על מנת למנוע זיהום עם פרווה העכבר.
3. הרם את העור באזור הבטן עם מלקחיים, ולאחר מכן לבצע חתך אורכי קטן במספריים חדים.
4. קולפים את שני קפלי עור בכיוונים מנוגדים (למעלה ולמטה) כדי לחשוף לגמרי את שרירי הגפיים האחוריות מתחתיו.
5. רקמת השריר והבלו ידי הוספת והארכת מספריים לאורך שני הצדדים של השוקה.
6. חזור על התהליך זהה עבור עצם הירך כדי לחלץ את רקמת השריר.
7. שמים את כל רקמת שריר נכרת ב-60mm פטרי מנות, באמצעות צלחת אחת עבור הרקמה מהעכבר כל אחד.
8. חזור על הנ"ל עבור כל העכברים.

2. לנתק את רקמות לתוך התאים על ידי יחיד עיכול אנזימטי:

לאורך קטע זה של הפרוטוקול, להשתמש ריאגנטים סטרילית כלים לעבודה בתנאים סטריליים.

9. הוסף 2 מ"ל של collagenase II (Sigma, חתול # 6885, 500u / mL) ו - 20 μL של המניה 250mm CaCl ₂ אל צלחת פטרי כל אחד.
10. לקרוע את רקמת השריר לחתיכות קטנות (כ 1 מ"מ ³⁾ עם שני מלקחיים (אחד משונן, אחת מתוך כלים מדע טוב, עם 2 שיניים, חתול # 11051-10, 11154-10), לשים לב להסיר ולסלק כמה מזוהם ללא רקמות השריר ככל האפשר.
11. מכסים את פטרי, כלים דגירה אותם 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
12. אחזר את פטרי, כלים להשתמש הבוכנה 3 מ"ל המזרק ביסודיות מחית החלקים רקמות. השתמש באחת הבוכנה עבור כל דגימה, כדי למנוע זיהומים.
13. להוסיף קצת (~ 5 מ"ל) סטרילי קר PBS על צלחת פטרי כל העברת הבוצה רקמה לתוך צינור פלקון 50 מ"ל (לשטוף את צלחת פטרי, אם יש צורך לשחזר את כל הרקמה)
14. נער את הצינורית פלקון במרץ, למלא את הצינור עם PBS, צנטריפוגה @ 800rpm x 5 דקות (דגם Eppendorf הספסל העליון: 5810R), וכן לשאוב supernatant (חוזר 3 פעמים)
15. מוסיפים תערובת של 1mL collagenase ד '(רוש, חתול # 11088882001, 1.5u / mL) / Dispase II (רוש, חתול #: 04942078001, 2.4u / mL) ו 10μL של CaCl ₂ (250mm) כדי צינור אחד, דגירה על 37 מעלות צלזיוס עם רוטציה למשך שעה אחת.
16. הוסף 5-10 מ"ל של מערבולת קר, סטרילי, PBS ו פיפטה ביסודיות כדי homogenize הרקמה.
17. ממלאים את צינורות עם PBS ומערבבים היטב.
18. מעבירים את הנוזל מסננת תא 40μm מונח על גבי צינור פלקון 50 מ"ל לסנן את חתיכות גדולות של רקמה הנותרים. מחלקים כל דגימה שווה לשלוש מבחנות פלקון 50 מ"ל. מלאו את כל הצינורות עם PBS אז צנטריפוגות @ 1600rpm במשך 5 דקות על 8 מעלות צלזיוס.
19. בטל supernatant לאסוף תאים מכתים.

3. נוגדן מכתים ומיון:

לאורך קטע זה של הפרוטוקול, להשתמש FACS סטרילית מאגרים לאיסוף ולעבוד בתנאים סטריליים. נוגדנים מסחרי נחשבים בדרך כלל סטרילי אם ינוהלו כהלכה.

20. לקבלת צבע יחיד ושליטה דגימות אלוטיפ, resuspend המדגם במאגר FACS 1mL ולחלק את התאים מושעה בתשע 1.5mL מראש שכותרתו צינורות Eppendorf (100 μL כל שפופרת).
    1. הגדרת מכתים צבע יחיד מערבב על פי הטבלה הבאה:
       שים לב: הריכוז הסופי של נוגדנים לשלוט אלוטיפ את הכתם צריך להתאים לזה של נוגדן הראשוני הם הבקרה. לדוגמה, אם אנטי SCA-1 משמש 1 μg/10 ⁶ תאים, אלוטיפ המתאים יש להשתמש בריכוז זהה.
       

       Tube #	שם שפופרת	חברה	חתול #	שיבוט	אלוטיפ	מהילה
       1	ללא כתם
       2	Hoechst33342	סיגמא	B2261			2-5ug/ml
       3	PI	סיגמא	P4864			1ug/ml
       4	CD31-FITC CD45-FITC	ebioscience	11-0311-85	390	עכברוש IgG2a	500
       		בית עשה		I3 / 2	עכברוש IgG2b	500
       5	Sca1-PECY7	ebioscience	25-5981-82	D7	עכברוש IgG2a	5000
       6	α-7 APC	בית עשה		R2F2	עכברוש IgG2b	1000

    2. הגדרת מכתים אלוטיפ לשלוט מתערבב באמצעות הטבלה הבאה:
       

       Tube #	שם של הצינור	Hoechst	PI	CD31- FITC	CD45- FITC	Scal- PE-CY7	-7- APC	Rat- IgG2b- APC	Rat- IgG2a- pecy7	Rat- IgG2a- FITC	Rat- IgG2b- FITC
       7	שוה CD31 / CD45	+	+	-	-	+	+	-	-	+	+
       8	שוה Scal- pecy7	+	+	+	+	-	+	-	+	-	-
       9	שוה α-7-APC	+	+	+	+	+	-	+	-	-	-

    3. Pipet יחיד צבע איזוטופ מכתים לשלוט מתערבב (אנחנו בדרך כלל להתאים את הריכוז של נוגדנים כך בין 5 ל 10 μL של מכתים לערבב מתווספים כל דגימה) לתוך הצינור Eppendorf המתאים שלב 20. מערבבים היטב לדגור על הקרח במשך שעה 1.
21. הכתם תאים העכבר מדגם 800μL עם קוקטייל של נוגדנים (להלן) למיון תא FACS. מערבבים היטב לדגור על הקרח במשך שעה 1.
    קוקטייל נוגדנים: Hoechst, PI, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1-PECY7, α-7 APC
    שים לב: יחס אופטימלי של נוגדנים לתאי צריכות להיקבע על ידי כל אחד בנפרד titrating נוגדנים, כמו הבדלים משמעותיים עשויים להתקיים בין קבוצות. כמות אופטימלית של נוגדנים כדי לשמש צריך לבוא לידי ביטוי μgs של נוגדנים לכל 10 ⁶ תאים היעד והמשיך קבוע בעת השימוש אצווה אותו נוגדן. ברור שאם את מספר התאים היעד אינו משתנה משמעותית בין ניסויים, או אם נפח מכתים ישתנה עם מספר תאים, דילול קבוע של נוגדן זה יכול לשמש גם.
22. שטפי: הוסף 1mL של כ חיץ FACS לכל אחד 9 צינורות שליטה; להוסיף 20mL של כ חיץ FACS אל הצינור המדגם.
23. צנטריפוגה צינורות Eppendorf @ 3000rpm במשך 5 דקות (Eppendorf צנטריפוגות גבי ספסל, דגם: 5417C). צנטריפוגה צינור דגימה @ 1600rpm במשך 5 דקות (למעלה Eppendorf ספסל צנטריפוגות, דגם: 5810R).
24. לשאוב ולזרוק supernatant מכל הצינורות.
25. תאים Resuspend במאגר FACS (1mL עבור כל אחד שולט, 4mL למדגם מיון), תאים פיפטה לתוך "צינורות FACS" דרך מסננת תא כובע (חתול פלקון BD # 352235, 40μm גודל הנקבוביות) כדי להסיר גושים שנותרו שעשויים להשפיע על cytometer.
26. הגדרת סדרן FACS עם צבע שולט יחיד ושולט אלוטיפ.
27. איסוף תאים ממוינים על פי הטבלה הבאה חיץ mL 3.5 אוסף (95% DMEM, 5% FBS) בנפרד. בדרך כלל, כאשר קצירת הן הגפיים האחוריות, עכבר אחת סוג בר יכולה להניב כ 150,000 ובתאים myogenic או 100,000 ובתאים adipogenic, עם הכדאיות מעל 95%, דהיינו על ידי FACS ידי תאים ממוינים reanalyzing בסוף ההליך (איור 1 )
    הגדרה של אבות myogenic ו adipogenic מבוסס על משטח מכתים
    -

    נוגדן / כתם	אבי Myogenic (MP)	אבי Adipogenic (AP)
    Hoechst	+	+
    PI	-	-
    CD31-FITC	-	-
    CD45-FITC	-
    Sca1-PECY7	-	+
    α-7 APC	+	-

4. השתלה:

28. צנטריפוגה תאים ממוינים @ 1500rpm במשך 5 דקות, להסיר את התאים supernatant ולהעביר autoclaved Eppendorf צינורות (1.5 מ"ל), לשטוף עם תאים μL של 500 סטרילי PBS (נסיוב בחינם!), ואז צנטריפוגות @ 3000rpm במשך 5 דקות. שמירה על כל ריאגנטים בתנאים סטריליים ולעבוד במנדף בתרבית רקמה, resuspend אבות myogenic ב-PBS, או אבי adipogenic ב Matrigel (חתול BD # 354234) על כ 10 ⁶ תאים / מ"ל.
29. להשתלות או אבי אבות myogenic adipogenic לעכברים הנמען.
    1. לטשטש את העכבר עם isoflouran פי מדיניות המוסד שלך.
    2. לגלח את השיער סביב איזור ההזרקה, ולאחר מכן לחטא את העור על ידי שפשוף עם אתנול 70%
    3. הזרק 20μL של אבות myogenic או אבות adipogenic (= 20k תאים) באמצעות 3 / 10 מזרק אינסולין CC (חתול BD # 309300).
30. לאחר זמן מתאים (שלושה שבועות עובד היטב, אבל הבעת myofibers התורם הנגזרות סמנים מהונדס הם בדרך כלל מאליה בתוך שבוע לאחר ההשתלה), לטשטש את העכברים הנמען משלב 29 בזריקה intraperitoneal של 400 Avertin μL (חתול Sigma # T04840-2, 25 מ"ג / מ"ל), אנקב transcardially עם 50 מ"ל PBS (מכיל 10 מיקרומטר של EDTA) הראשון, ואחריו 15 מ"ל של PFA 4%. איסוף רקמות היעד, שלאחר לתקן עם PFA 4% בין לילה, אם נדרש, ואז להעביר סוכרוז 20% בין לילה. שבץ להקפיא, אוקטובר ו cryosection.

5. נציג תוצאות:

כאשר חבר פרלמנט מושתלים לתוך השריר שלד העכבר, הם בקלות עם הפתיל קיימים myofibers. לכן כל תווית גנטי הנוכחית בתאי התורם יהיה להבחין בקלות הסיבים כי קיבל אותם. תרשים 2 מציג דוגמה שבה הביע את התאים המושתלים phostphatase אלקליין בני האדם, גילו histochemically.

כאשר AP מושתלים התוצאה היא תלויה מאוד בסביבה של אתר ההשתלה: כאשר המושתלים מתחת לעור תאים אלו כדי לתת מקורות adipocytes ו myofibroblasts (ראה איור 2). באתרים רבים אחרים, כולל שרירים, הם אינם שורדים אלא ניוון שומן כבר המושרה ^3.

באיור 1. מיון אסטרטגיה לבידוד של אוכלוסיות אבי מן שרירי השלד (א) אסטרטגיה מיון:. תאים חיים זוהו המבוססת על פיזור קדימה פיזור לוואי. מכתים Hoechst שימש להוציא פסולת anuclear ו יודיד propidium (PI) מכתים להוציא תאים מתים. Hematopoietic (CD45) לבין האנדותל (CD31) תאים הוצאו משערי מיון. Α7 Hoechst ^{+ +} PI ^- CD45 ^- CD31 ^- Scal ^- משנה זה מכיל את כל אבות myogenic (MP). ^{+ +} Scal Hoechst לצרכן ^- CD45 ^- CD31 ^- α7 ^- האוכלוסייה כוללת אבות adipogenic (AP). (ב) Fluorescence מינוס אחד (FMO) שולטת אלוטיפ לאשר את הספציפיות של הכתם. (ג) טוהר בדיקות של תת MP ו AP לאחר מיון.

איור 2. תוצאות נציג הבאים MP ו AP השתלה. AP הושתלו תת עורי (פאנל עליון) MP לתוך שריר (הפאנל התחתון). בשני המקרים, תאים התורם שמקורה עכבר מהונדס המבטא phosphatase אלקליין אדם, שזוהה על ידי מכתימה את החום.

Discussion

מטרת פרוטוקול זה היא איזון סביר בין תשואות גבוהות כדאיות גבוהה של תאים מטוהרים. השלב הקריטי ביותר להבטיח כי תאים בריאים הם התאוששו הוא, כצפוי, ניתוק האנזימטית של רקמת המוצא. הטיפול של הרקמה צריך להיות עדין במיוחד, אשר קשה להוכיח או להעריך אפילו בפורמט אורקולי. גורם המפתח הוא אורך ההליך. ככל שנדרש כדי לצאת מן התורם אל החיה הנמען, התחתון את הכדאיות, ולכן את היעילות engraftment. אם יש איזו שאלה לגבי כדאיות שלא ענה מיד על ידי הסתכלות תדירות האירוע לצרכן חיובי דגימות תאים מטוהרים לאחר מיון, אנו ממליצים כי assay דילול הגבלת למדוד clonogenicity מבוצעת ^3. מיני טיפוסיות מן השריר ניזוק באופן שגרתי התשואה על 1 ב 15-20 תאים המסוגלים ליזום מושבות myogenic או fibro / adipogenic במבחנה. בעוד למעשה 100% במושבות יזם של חברי פרלמנט להכיל myotubes הבדיל, רק כשליש מושבות המתקבל FAPs מכילים adipocytes בנוסף חלקה אקטין myofibroblasts שריר חיובית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Collagenase II	Sigma-Aldrich	C-6885,	500 u/ml
Collagenase D	Roche Group	11088882001	1.5 u/ml
Displace II	Roche Group	04942078001	2.4 u/ml
cell strainer	BD Biosciences	352340	40 μm
Tube with cell strainer	BD Biosciences	352235	40 μm
H–chst33342	Sigma-Aldrich	B2261	2-5 ug/ml
CD31-FITC	eBioscience	11-0311-85	Clone 390
CD45-FITC	Home made		Clone I3/2
Sca1-PECY7	eBioscience	25-5981-82	Clone D7
α-7 integrin APC	Home made	Inquire with Rossi lab	R2F2