Summary
Enzymatic पृथक्करण, सतह और fibro / adipogenic और murine कंकाल की मांसपेशी से myogenic progenitors के प्रवाह cytometry द्वारा लेबलिंग शुद्धि के लिए विधि.
Abstract
कंकाल की मांसपेशी अलग भ्रूण मूल और विकास क्षमता के कई पूर्वज आबादी शामिल हैं. Myogenic progenitors, आमतौर पर myofiber प्लाज्मा झिल्ली और laminin अमीर तहखाने झिल्ली है कि यह ensheaths के बीच एक उपग्रह सेल की स्थिति में रहने वाले, स्वयं renewing कोशिकाओं है कि केवल myogenic वंश 1,2 करने के लिए प्रतिबद्ध हैं. हमने हाल ही में पोत जुड़े progenitors कि myofibroblasts और सफेद adipocytes, जो कुशलता प्रसार दर्ज करके क्षति जवाब है और myogenic कोशिकाओं ऊतक पुनर्जनन 3,4 दौरान पौष्टिकता समर्थन प्रदान करता है उत्पन्न कर सकते हैं की एक द्वितीय श्रेणी का वर्णन किया है. सबसे भरोसेमंद assays के लिए एक दिया सेल की आबादी का विकास और पुनर्योजी क्षमता का निर्धारण उनके अलगाव और 5-7 प्रत्यारोपण पर निर्भर करता है . यह अंत करने के लिए हम enzymatically dissociated मांसपेशियों से प्रवाह cytometry, जो हम इस लेख में की रूपरेखा तैयार करेंगे द्वारा उनकी शुद्धि के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलित है. इस पद्धति का उपयोग करके प्राप्त की आबादी या तो myogenic या fibro / adipogenic कॉलोनी कोशिकाओं के गठन में शामिल होंगे: कोई अन्य कोशिका प्रकार इन विट्रो में vivo वितरण में विस्तार या जीवित करने में सक्षम हैं. हालांकि, जब इन आबादी आणविक विश्लेषण (जैसे QRT-पीसीआर) एक ध्यान में रखना है कि हौसले से सॉर्ट किया गया सबसेट अन्य contaminant कोशिकाओं है कि कालोनियों बनाने या engrafting प्राप्तकर्ताओं की क्षमता की कमी शामिल कर सकते हैं चाहिए के लिए तरह के बाद तुरंत इस्तेमाल किया जाता है.
Protocol
1. ऊतक संग्रह:
- 7 और 12 के बीच सप्ताह पुरानी चूहों का प्रयोग करें. आमतौर पर, कम से कम दो पशुओं इस्तेमाल किया जाता है: एक FACS एकल रंग के मुआवजे के लिए और प्रतिदीप्ति ऋण एक निर्धारण नियंत्रण नमूने के लिए आवश्यक नियंत्रण स्थापित करने के लिए है. अन्य छँटाई के लिए वास्तविक नमूना है.
- सीओ 2 साँस लेना द्वारा चूहों euthanize या पसंद का एक नैतिकता प्रोटोकॉल के अनुसार. एक कागज तौलिया का सामना करना पड़ रहा, और 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे पर प्लेस चूहों माउस फर के साथ अच्छी तरह से प्रदूषण को रोकने.
- संदंश के साथ पेट क्षेत्र में त्वचा लिफ्ट, तो तेज कैंची के साथ एक छोटे से अनुदैर्ध्य काट कर.
- पील त्वचा की दो विपरीत दिशाओं में फ्लैप (ऊपर और नीचे) पूरी तरह से नीचे के लिए पिछले अंग की मांसपेशियों को बेनकाब.
- आबकारी डालने और टिबिअ के दोनों पक्षों के साथ कैंची विस्तार से मांसपेशियों के ऊतकों.
- मांसपेशियों के ऊतकों को निकालने के लिए जांध की हड्डी के लिए एक ही प्रक्रिया दोहराएँ.
- सभी excised 60mm पेट्री - व्यंजन में मांसपेशियों के ऊतकों प्लेस, ऊतक के लिए प्रत्येक माउस से एक डिश का उपयोग कर.
- सभी चूहों के लिए ऊपर दोहराएँ.
2. Enzymatic पाचन द्वारा एकल कोशिकाओं में ऊतक अलग कर देना:
प्रोटोकॉल के इस खंड के दौरान, बाँझ अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग करें और बाँझ की शर्तों के तहत काम करते हैं.
- प्रत्येक पेट्री पकवान Collagenase द्वितीय के 2 एमएल (सिग्मा, 6885 # बिल्ली, 500u / एमएल) और 250mm CaCl 2 शेयर के 20 μL जोड़ें.
- दो संदंश (एक दाँतेदार, 2 दांत के साथ ठीक विज्ञान उपकरण से, बिल्ली 11051-10 # 11154-10) के साथ छोटे टुकड़े (1 के बारे में 3 मिमी), ध्यान दे हटाने और के रूप में दूषित बहुत त्यागने में मांसपेशियों के ऊतकों फाड़ संभव के रूप में गैर मांसपेशी ऊतक.
- पेट्री - व्यंजन कवर और उन्हें 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- पेट्री - व्यंजन पुनर्प्राप्त और अच्छी तरह से ऊतक के टुकड़े मैश लिए एक 3 एमएल सिरिंज सवार का उपयोग करें. Contaminations से बचने के लिए प्रत्येक नमूना के लिए एक गोताख़ोर का उपयोग करें.
- प्रत्येक पेट्री डिश के लिए (~ 5 एमएल) कुछ बाँझ ठंड पीबीएस जोड़ें और एक 50ml फाल्कन ट्यूब में ऊतक कीचड़ हस्तांतरण (पेट्री पकवान कुल्ला यदि आवश्यक सभी ऊतकों को ठीक करने के लिए)
- फाल्कन ट्यूब शेक सख्ती, Pbs के साथ ट्यूब भरने, अपकेंद्रित्र @ 800rpm एक्स 5 (Eppendorf बेंच शीर्ष मॉडल: 5810R) मिनट, और aspirate सतह पर तैरनेवाला (दोहराने 3 बार)
- प्रत्येक ट्यूब करने के लिए और 2 CaCl के 10μL (250mm), 37 डिग्री पर सेते: Collagenase डी के 1ml मिश्रण (Roche, 11088882001 # बिल्ली, 1.5u / एमएल) / Dispase II (04942078001, 2.4u एमएल / Roche, बिल्ली #) जोड़ें एक घंटे के लिए रोटेशन के साथ सेल्सियस.
- ठंड, बाँझ पीबीएस भंवर, और अच्छी तरह से विंदुक ऊतक homogenize 5-10 एमएल जोड़ें.
- पीबीएस के साथ ट्यूबों भरें और मिश्रण अच्छी तरह से.
- एक 40μm सेल एक 50 एमएल फाल्कन ट्यूब के शीर्ष पर रखा करने के लिए बाहर के ऊतकों के शेष बड़े टुकड़े को फ़िल्टर झरनी तरल स्थानांतरण. तीन 50ml फाल्कन ट्यूबों में समान रूप से प्रत्येक नमूना फूट डालो. पीबीएस फिर 5 मिनट के लिए 8 डिग्री सेल्सियस पर 1600rpm @ अपकेंद्रित्र के साथ ट्यूबों के प्रत्येक भरें.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धुंधला के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा.
3. एंटीबॉडी धुंधला और छंटनी:
प्रोटोकॉल के इस खंड के दौरान, बाँझ FACS और संग्रह buffers का उपयोग करें और बाँझ की शर्तों के तहत काम करते हैं. वाणिज्यिक एंटीबॉडी आम तौर पर बाँझ माना जाता है अगर ठीक से संभाला.
- एकल रंग निर्धारण और नियंत्रण के नमूने लिए, 1ml FACS बफर में नमूना resuspend और नौ 1.5mL पूर्व लेबल Eppendorf ट्यूब (100 μL प्रत्येक ट्यूब) में निलंबित कोशिकाओं के विभाजन.
- एकल रंग धुंधला सेट निम्न तालिका के अनुसार घोला जा सकता है है:
आकर्षित: दाग में निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी के अंतिम एकाग्रता प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए वे नियंत्रण हैं कि मैच चाहिए. उदाहरण के लिए, यदि विरोधी SCA-1 1 μg/10 6 कोशिकाओं के लिए प्रयोग किया जाता है, अपनी इसी निर्धारण एक ही एकाग्रता में इस्तेमाल किया जा चाहिए.# ट्यूब ट्यूब का नाम कंपनी बिल्ली # क्लोन निर्धारण पतला करने की क्रिया 1 गैर दाग 2 Hoechst33342 सिग्मा B2261 2-5ug/ml 3 PI सिग्मा P4864 1ug/ml 4 CD31-FITC
CD45-FITCebioscience 11-0311-85 390 चूहा IgG2a 500 हाउस बनाया / I3 2 चूहा IgG2b 500 5 Sca1 - PECY7 ebioscience 25-5981-82 D7 चूहा IgG2a 5000 6 α-7 APC हाउस बनाया R2F2 चूहा IgG2b 1000 - निर्धारण नियंत्रण धुंधला निम्न तालिका का उपयोग कर सेट घोला जा सकता है:
# ट्यूब नाम
ट्यूब केHoechst PI CD31 -
FITCCD45 -
FITCScal -
पीई - Cy77
APCचूहा -
IgG2b -
APCचूहा -
IgG2a -
pecy7चूहा -
IgG2a -
FITCचूहा -
IgG2b -
FITC7 ISO-
CD31
/ CD45+ + - - + + - - + + 8 ISO-
Scal -
pecy7+ + + + - + - + - - 9 ISO-
α-7-APC+ + + + + - + - - - - चरण 20 से उपयुक्त Eppendorf ट्यूब में Pipet एकल रंग और आइसोटोप नियंत्रण धुंधला घोला जा सकता है (हम आम तौर पर एंटीबॉडी की एकाग्रता इतनी समायोजित कि मिश्रण धुंधला हो जाना के बीच 5 और 10 μL प्रत्येक नमूने के लिए जोड़ रहे हैं). अच्छी तरह से मिलाएं और 1 घंटे के लिए बर्फ पर सेते हैं.
- एकल रंग धुंधला सेट निम्न तालिका के अनुसार घोला जा सकता है है:
- एंटीबॉडी कॉकटेल के FACS सेल छँटाई के लिए 800μL (नीचे) के साथ नमूना माउस से कोशिकाओं दाग. अच्छी तरह से मिलाएं और 1 घंटे के लिए बर्फ पर सेते हैं.
एंटीबॉडी कॉकटेल: Hoechst, पीआई, CD31-FITC, CD45-FITC, Sca1 PECY7, APC α-7
आकर्षित: कोशिकाओं को एंटीबॉडी के इष्टतम अनुपात व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक titrating एंटीबॉडी, के रूप में महत्वपूर्ण मतभेद बैचों के बीच मौजूद हो सकता है के द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए . एंटीबॉडी के इष्टतम राशि के लिए इस्तेमाल किया जा प्रति 10 6 लक्ष्य कोशिकाओं एंटीबॉडी के μgs में व्यक्त किया जाना चाहिए और स्थिर रखा जब एंटीबॉडी का एक ही बैच का उपयोग कर. जाहिर है, अगर लक्ष्य कोशिकाओं की संख्या काफी प्रयोगों के बीच बदल नहीं करता है, या यदि धुंधला मात्रा कोशिकाओं की संख्या के साथ बढ़ाया है, प्रत्येक एंटीबॉडी के एक निश्चित कमजोर पड़ने का भी इस्तेमाल किया जा सकता है. - धो: लगभग 9 नियंत्रण ट्यूबों में से प्रत्येक के लिए FACS बफर के 1ml जोड़ें, नमूना ट्यूब FACS बफर के लगभग 20ml जोड़ने.
- अपकेंद्रित्र Eppendorf ट्यूबों @ 3000rpm (5417C: Eppendorf बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र, मॉडल) के लिए 5 मिनट. नमूना ट्यूब 5 मिनट के लिए @ 1600rpm (: 5810R Eppendorf बेंच शीर्ष अपकेंद्रित्र, मॉडल) अपकेंद्रित्र.
- Aspirate और सभी ट्यूब से सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
- FACS बफर (1ml नियंत्रण की प्रत्येक के लिए, छँटाई नमूना के लिए 4mL) में Resuspend कोशिकाओं, FACS ट्यूबों "सेल झरनी टोपी के माध्यम से (बी फाल्कन बिल्ली # 352,235, 40μm रोमकूप आकार) में पिपेट कोशिकाओं शेष clumps कि हो सकता है निकालने के लिए cytometer प्रभावित.
- एकल रंग नियंत्रण और निर्धारण नियंत्रण के साथ FACS सॉर्टर सेट.
- एक 3.5 एमएल संग्रह बफर में निम्न तालिका (95%, 5% DMEM FBS) अलग के अनुसार सॉर्ट किया गया कोशिकाओं लीजिए. आम तौर पर, जब दोनों हिंद अंग कटाई, एक एकल जंगली प्रकार माउस 150.000 myogenic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं या 95% से ऊपर व्यवहार्यता के साथ 100.000 adipogenic पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं, के रूप में FACS द्वारा reanalyzing सॉर्ट किया गया कोशिकाओं द्वारा प्रक्रिया के अंत में न्याय (चित्रा 1 के बारे में उपज सकता है )
Myogenic और adipogenic progenitors की परिभाषा धुंधला सतह पर आधारितएंटीबॉडी / दाग Myogenic पूर्वज (म. प्र.) Adipogenic पूर्वज (एपी) Hoechst + + PI - - CD31-FITC - - CD45-FITC - Sca1 - PECY7 - + α-7 APC + -
4. ट्रांसप्लांटेशन:
- अपकेंद्रित्र सॉर्ट किया गया कोशिकाओं @ 1500rpm 5 मिनट के लिए, autoclaved Eppendorf ट्यूबों (1.5 एमएल) के लिए सतह पर तैरनेवाला और हस्तांतरण कोशिकाओं को हटाने, बाँझ पीबीएस (सीरम मुक्त!) के 500 μL के साथ कोशिकाओं कुल्ला, तो 5 मिनट के लिए @ 3000rpm अपकेंद्रित्र. बाँझ परिस्थितियों में सभी अभिकर्मकों को बनाए रखने और एक टिशू कल्चर हुड में काम कर रहे लगभग 10 6 कोशिकाओं / एमएल पीबीएस में myogenic progenitors, या Matrigel में adipogenic पूर्वज (बी.डी. बिल्ली # 354234) resuspend.
- Myogenic progenitors या प्राप्तकर्ता चूहों को adipogenic पूर्वज प्रत्यारोपण.
- Isoflouran अपनी संस्था नीति के अनुसार के साथ माउस चतनाशून्य करना.
- इंजेक्शन क्षेत्र के आसपास बाल दाढ़ी, तो 70% इथेनॉल के साथ रगड़ से त्वचा बाँझ
- Myogenic progenitors या adipogenic progenitors (= 20k कोशिकाओं) एक CC 3 / 10 इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करने के 20μL (बी.डी. बिल्ली # ३,०९,३००) इंजेक्षन.
- एक उचित समय (तीन सप्ताह अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन दाता व्युत्पन्न ट्रांसजेनिक मार्करों व्यक्त myofibers आम तौर पर प्रत्यारोपण के बाद एक सप्ताह के भीतर स्पष्ट कर रहे हैं) के बाद, 400 μL Avertin की intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा 29 कदम से प्राप्तकर्ता चूहों (सिग्मा बिल्ली # T04840-2 चतनाशून्य करना, 25 मिलीग्राम / एमएल), तो 50ml (EDTA के 10 सुक्ष्ममापी शामिल हैं) पीबीएस पहले, 15ml 4% पीएफए के द्वारा पीछा के साथ transcardially perfuse. 4% रातोंरात पीएफए के साथ लक्ष्य ऊतक के बाद तय लीजिए यदि आवश्यक हो, तो 20% sucrose के लिए रातोंरात हस्तांतरण. अक्टूबर, फ्रीज, और cryosection में एम्बेड.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
जब सांसद माउस कंकाल की मांसपेशी में प्रतिरोपित कर रहे हैं, वे पूर्व मौजूदा myofibers के साथ आसानी से फ्यूज. इसलिए किसी भी आनुवंशिक दाता कोशिकाओं में मौजूद लेबल आसानी से फाइबर है कि उन्हें प्राप्त में detectable जाएगा. चित्रा 2 से पता चलता है एक उदाहरण है जहां प्रतिरोपित कोशिकाओं मानव क्षारीय phostphatase व्यक्त की, histochemically पता चला है.
जब एपी प्रतिरोपित कर रहे हैं परिणाम प्रत्यारोपण साइट के पर्यावरण पर अत्यधिक निर्भर है: जब इन कोशिकाओं प्रतिरोपित subcutaneously adipocytes और myofibroblasts करने के लिए मूल दे (आंकड़ा 2 देखें). मांसपेशियों सहित कई अन्य साइटों, में, वे जब तक फैटी अध: पतन 3 प्रेरित किया गया है जीवित नहीं है .
चित्रा 1. कंकाल की मांसपेशी से पूर्वज आबादी के अलगाव के लिए रणनीति (ए) छंटनी रणनीति छंटनी: व्यवहार्य कोशिकाओं आगे तितर बितर और पक्ष स्कैटर के आधार पर पहचान की गई. Hoechst धुंधला anuclear मलबे और propidium आयोडाइड धुंधला (PI) बाहर मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. (CD45) hematopoietic और endothelial कोशिकाओं (CD31) छँटाई फाटक से बाहर रखा गया है. α7 + + Hoechst PI - CD45 - CD31 - scal - सबसेट सभी myogenic progenitors (सांसद) शामिल हैं. Scal + Hoechst + PI - CD45 - CD31 - α7 - जनसंख्या adipogenic progenitors (एपी) शामिल हैं. (बी) प्रतिदीप्ति शून्य से एक (FMO) निर्धारण नियंत्रण दाग की विशिष्टता की पुष्टि की. (सी) पवित्रता छँटाई के बाद सांसद और एपी सबसेट जाँच.
चित्रा 2. सांसद और एपी प्रत्यारोपण एपी. निम्न प्रतिनिधि परिणाम subcutaneously प्रत्यारोपित किया गया (शीर्ष पैनल) और सांसद intramuscularly (नीचे के पैनल). दोनों ही मामलों में, दाता कोशिकाओं ट्रांसजेनिक मानव alkaline फॉस्फेट व्यक्त माउस, भूरे रंग धुंधला हो जाना के द्वारा की पहचान से उत्पन्न.
Discussion
इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए उच्च पैदावार और शुद्ध कोशिकाओं की उच्च व्यवहार्यता के बीच एक उचित संतुलन है. सुनिश्चित करना है कि स्वस्थ कोशिकाओं को बरामद कर रहे हैं में सबसे महत्वपूर्ण कदम है, जाहिर है, शुरू ऊतक के enzymatic पृथक्करण. ऊतक की हैंडलिंग विशेष रूप से कोमल है, जो प्रदर्शित करने के लिए या एक audiovisual प्रारूप में भी सराहना करते हैं करने के लिए कठिन है चाहिए. एक अन्य महत्वपूर्ण कारक प्रक्रिया की लंबाई है. अब यह दाता से प्राप्तकर्ता जानवर के लिए जाना जाता है, कम व्यवहार्यता और इसलिए, engraftment दक्षता. वहाँ व्यवहार्यता कि PI छँटाई के बाद शुद्ध सेल के नमूनों में सकारात्मक घटना की आवृत्ति में देखकर तुरंत जवाब नहीं है के बारे में कोई प्रश्न हो सकता है, तो हमारा सुझाव है कि एक सीमित कमजोर पड़ने clonogenicity को मापने परख 3 प्रदर्शन किया है . Undamaged मांसपेशियों से विशिष्ट प्रकार के नियमित रूप से 15-20 कोशिकाओं में इन विट्रो में myogenic / या fibro adipogenic कालोनियों की शुरुआत की सक्षम के बारे में 1 उपज. जबकि सांसदों से शुरू कालोनियों की अनिवार्य रूप से 100% विभेदित myotubes होते हैं, FAPs से प्राप्त कालोनियों के बारे में केवल एक तिहाई चिकनी पेशी actin सकारात्मक myofibroblasts के अलावा adipocytes होते हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase II | Sigma-Aldrich | C-6885, | 500 u/ml |
| Collagenase D | Roche Group | 11088882001 | 1.5 u/ml |
| Displace II | Roche Group | 04942078001 | 2.4 u/ml |
| cell strainer | BD Biosciences | 352340 | 40 μm |
| Tube with cell strainer | BD Biosciences | 352235 | 40 μm |
| H–chst33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | 2-5 ug/ml |
| CD31-FITC | eBioscience | 11-0311-85 | Clone 390 |
| CD45-FITC | Home made | Clone I3/2 | |
| Sca1-PECY7 | eBioscience | 25-5981-82 | Clone D7 |
| α-7 integrin APC | Home made | Inquire with Rossi lab | R2F2 |
References
- Buckingham, M., Montarras, D.
- Relaix, F., Marcelle, C.
- Joe, A. W. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nat Cell Biol. 12, 153-163 (2010).
- Natarajan, A., Lemos, D. R., Rossi, F. M. Fibro/adipogenic progenitors: A double-edged sword in skeletal muscle regeneration. Cell Cycle. 9, (2010).
- Sherwood, R. I. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119, 543-554 (2004).
- Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. , (2008).
- Montarras, D. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309, 2064-2067 (2005).
