Summary
وهناك طريقة لتضمين مستعمرات الخميرة السماح لsectioning المجهر الضوئي والإلكترون. هذا البروتوكول يسمح بتحديد توزيع الخلايا والخلايا sporulated الكاذبة داخل المستعمرات توفير أداة جديدة لفهم تنظيم أنواع الخلايا داخل المجتمع الفطرية.
Abstract
الزخرفة من أنواع مختلفة من الخلايا في الأجنة هي الآلية الرئيسية في عملية التنمية metazoan. مجتمعات الكائنات الدقيقة ، مثل المستعمرات والأغشية الحيوية أيضا عرض نماذج من أنواع الخلايا. على سبيل المثال ، في الخميرة س. البيرة ، لا الخلايا والخلايا sporulated الكاذبة موزعة بشكل متجانس في المستعمرات. لا تزال على أهمية وظيفية من الزخرفة والآليات الجزيئية التي تكمن وراء هذه الأنماط غير مفهومة.
أحد التحديات فيما يتعلق بالتحقيق في أنماط من أنواع الخلايا في مستعمرات الفطرية هو أنه على عكس الأنسجة metazoan ، ونسبيا في مستعمرات الخلايا ضعيفة المرفقة مع بعضها البعض. بصفة خاصة ، مستعمرات فطرية لا تحتوي على نفس المستوى واسعة من المصفوفة خارج الخلية الموجودة في معظم الأنسجة. نحن هنا التقرير على طريقة لدمج وsectioning مستعمرات الخميرة التي تكشف عن أنماط الداخلية من أنواع الخلايا في هذه المستعمرات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتحضير المقاطع سميكة (0.5 μ) مفيدة للفحص المجهري والمقاطع الخفيفة رقيقة (0،1 μ) مناسبة لانتقال المجهر الإلكتروني. ويمكن بسهولة زقاق الكاذبة خلايا يمكن تمييزها عن خلايا الخميرة بيضوي الشكل بواسطة المجهر الضوئي ، في حين أن بنية الداخلية لهذه الخلايا التي يمكن تصور EM.
يستند هذا الأسلوب على المستعمرات المحيطة بها مع آغار ، تسلل لهم Spurr المتوسطة ، ثم sectioning. المستعمرات التي يبلغ قطرها في حدود 1-2 مم هي مناسبة لهذا البروتوكول. بالإضافة إلى الرؤية والداخلية من المستعمرات ، وطريقة تسمح برؤية منطقة مستعمرة أن يغزو آغار الكامنة.
Protocol
1. عزل مستعمرة والتثبيت
- احتضان 300 المستعمرات على وسط آغار للمرة أشارت (مستعمرة معزولة ينبغي 1-2 مم في القطر).
- إزالة مستعمرة (حتى الوجه) والمتوسطة الكامنة باستخدام ملعقة الضيقة.
- المكان عدة قطرات من 2 ٪ آغار 42 درجة مئوية على شريحة المجهر باستخدام 1 مل pipetman طرف ومستعمرة على الفور مكان على وجه آغار حتى قبل أن يتصلب.
- المكان عدة قطرات من 2 ٪ آغار 42 درجة مئوية على مستعمرة والسماح ليصلب.
- ارتداء قفازات لجميع الخطوات خلال الفترة المتبقية من هذا البروتوكول
- تقليم كتلة مع شفرة حلاقة ووضعها في قارورة سعة 3،5 المسمار الحد الأقصى البورسليكات بارافورمالدهيد تحتوي على 2 ٪ / 2 ٪ تثبيتي غلوتارالدهيد لمدة 7 أيام في 4 درجات مئوية.
2. يغسل والمعاملة الأزميوم
- بعد حوالي 1 أسبوع ، وغسل كتل أغار على الجليد تحت غطاء الدخان الكيميائية التي تفرخ مرتين لمدة 15 دقيقة مع ما يكفي من الصوديوم كاكوديلات 0.15M (7.2 درجة الحموضة) لتغطية كامل مستعمرة (حوالي 1،5 مل) ثم مرتين لمدة 5 دقائق مع نفس الحجم من العازلة OS 1X (100 ملي KH 2 PO 4 10 ملي MgCl 2 ، ودرجة الحموضة 6.0).
- إضافة نفس الحجم من أوسو 1 4 ٪ [2 مل أوسو 4 (2 ٪) + 2 مل 2X OS مخزن] لقوارير (على الجليد) لتغطية كتل آغار تحت غطاء الدخان الكيميائي لمدة 1 ساعة ثم يغسل مرتين مع نفس المبلغ من العازلة OS 1X لمدة 10 دقيقة لكل منهما.
- ترك قنينة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية في المخزن المؤقت OS 1X.
- يتم التخلص من جميع تثبيتي ، ويغسل في هذه الخطوة على أنها نفايات خطرة. وكانت تحتوي على شطف جميع ماصات أوسو 4 3X مع الزيت النباتي.
3. غسل وتجفيف
- غسل القطع الصباحية أغار مرتين المقبل على الجليد مع نفس الحجم على النحو الوارد أعلاه من الماء البارد لمدة 10 دقيقة كل باستخدام ماصة باستور.
- غسل بالتتابع مع نفس الحجم من 25 ٪ و 50 ٪ و 75 ٪ ، 95 ٪ من الإيثانول لمدة 10 دقيقة كل تليها 2 يغسل مع الإيثانول بنسبة 100 ٪ لمدة 10 دقيقة. ترك المبيت في 4 درجات مئوية في الإيثانول بنسبة 100 ٪.
- يتم التخلص من جميع يغسل في هذه الخطوة على أنها نفايات خطرة.
4. Spurr في التحضير
- في صباح اليوم التالي (في أقرب وقت ممكن) تزن الحلول التالية (EM العلوم) في كوب من البلاستيك القابل للتصرف تحت غطاء الدخان للتحضير كاشف Spurr ل. بالنسبة لجميع الأعمال اللاحقة باستخدام هذا الكاشف ، الاستمرار في استخدام غطاء الدخان.
(ERL 4221 محلول 5 جرام)
(4 حل DER 736 غراما)
(NSA حل 13 غراما) - مزيج هذه الحلول (ببطء) لمدة 20 دقيقة في غطاء محرك السيارة باستخدام بقضيب
- إضافة DMAE حل 0،15 غراما ويقلب 20 دقيقة على النحو الوارد أعلاه.
- ديغا الخليط لمدة 1-2 ساعات أعلاه في غطاء محرك السيارة.
5. Spurr في التسلل
- حالما يتم Spurr لغسل كتل آغار 5 مرات مع نفس الحجم على النحو الوارد أعلاه 100 ٪ غرفة الايثانول مؤقت لمدة 10 دقيقة لكل منهما. بعد غسل الايثانول مشاركة إزالة الإيثانول باستخدام ماصة باستير بحيث يغطي الإيثانول المتبقية مجرد كتل آغار.
- إضافة ما يقرب من مبلغ مساو من كاشف لSpurr (حوالي 0،5 مل) وتدوير القوارير على عجلة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم السماح للوقوف لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة إزالة حل به تماما ماصة باستور ، إضافة إلى تغطية Spurr كتلة آغار (حوالي 1،5 مل) ، وتناوب على عجلة قوارير لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والسماح للوقوف لمدة 30 دقيقة. وكرر استبدال Spurr ، والتناوب ، وحضانة 3 مرات أكثر.
- بعد 30 دقيقة النهائي ، وإزالة كاشف Spurr وإضافة جديدة لتغطية Spurr القطع. السماح للكتل آغار لتصل إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات.
- استبدال لSpurr وتناوب بين عشية وضحاها.
- في الصباح ، واستبدال Spurr مغادرة الدورية حتى اليوم التالي.
- المكان صباح اليوم التالي Spurr في قوالب السيليكون مرقمة (فيشر العلمية) فقط لتغطية الجزء السفلي من قوالب ثم إضافة إلى كتل آغار قوالب. في احتضان 60 درجة مئوية لمدة 4 ساعات
- بعد 4 ساعات ، وأعلى قبالة العفن ، مع أكثر من Spurr واحتضان عند 60 درجة مئوية خلال الليل.
- إذا كان بعد إزالة الكتل من قوالب الكتل لا تزال مرنة قليلا ، والعودة إلى القوالب واحتضان إضافي 2 أيام
6. Sectioning
- وكان يستخدم مشراح Ultracut ايكا S لقطع المقاطع μ 0.5 سميكة لالمجهر الضوئي و 0.1 μ المقاطع رقيقة لEM الإرسال.
- المجهري للضوء ، كما تم خفض أقسام ، وضعوا على قطرة درهم 2 O ، والمجففة على حرارة 52 درجة مئوية كتلة. وكانت ملطخة ثم المقاطع المجففة مع انخفاض 1.0 ٪ طولويدين الزرقاء ، 1 ٪ البورات الصوديوم ل15/05 ثانية. بعد التلوين ، وغسلها فورا المقاطع تحت تيار من الماء ، والمجففة ، وغطت وسائل الاعلام في تركيب (KPL) ، وزلة تغطية مختومة على العينة.
> 7. ممثل النتائج :
وقد جرى استعراض واسع النطاق على أهمية تشكيل لقياس النمط في الخميرة وغيرها من الكائنات الحية الدقيقة في السابق 1. وتجدر الإشارة بوجه خاص هو زيادة وظائف للمستعمرات الجرثومية المنظمة النسبية للمجتمعات غير منظم.
وصف الأسلوب هو تعديل لطريقة لدمج أكبر المستعمرات المتخصصة 2 ، ولقد تم نشر وصفا موجزا للتعديلات لدينا 3.
مثال على صورة مجهرية ضوء مقطع من خلال مركز مستعمرة S. البرية ويرد خميرة مستعمرة الخميرة في الشكل 1. زقاق ، الخيطان الكاذبة والخميرة بيضوي الشكل يمكن تمييزها بسهولة ، ومنطقة مستعمرة غزو آغار وراء ذلك هو أيضا واضح.
ويرد مثال لصورة مجهرية الإلكترون من سلالة من الخميرة مختبر (W303 الخلفية) في الشكل 2. كانت الصورة من منطقة المستعمرة تحتوي على وتيرة عالية من الخلايا sporulated.
الشكل 1. المجهري ضوء مستعمرة الخميرة البرية. تم عزل هذه الخميرة (YPS133) مؤخرا من الإفرازات الشجرة 4. وقد حضنت المستعمرة لمدة 6 أيام في المتوسط 5 YNA قبل sectioning. السهام تشير ممثل فتح زقاق والسهام تملأ تشير ممثل الخلايا الخضرية بيضوي الشكل ، السهام تملأ تشير سلاسل من الخلايا ممدود (الخيطان الكاذبة) ، وزقاق.
الشكل 2. الكترون المجهري مختبر سلالة الخميرة. وقد حضنت مستعمرة SH1020 (W303 الخلفية) لمدة 6 أيام في المتوسط قبل YNA sectioning 3. الصورة تظهر منطقة المقطع مع ارتفاع وتيرة زقاق. سهم يشير إلى بنية ثنائية الطبقة الجدار بوغ.
الشكل 3. الكمي لتوزيع الخلايا في مستعمرات sporulated : أ) تم تركيب شبكة تحتوي على 15 المستطيلات المجاورة مكدسة جنبا الى جنب مع الطويلة في المنطقة الوسطى من صورة مقطع مستعمرة. يتم تحجيم الشبكة ، مع الحفاظ على نسب المستمر ، لتغطي فقط الجزء العلوي والسفلي من مستعمرة. (B & C) ويتم تحديد جزء من الخلايا في كل مستطيل sporulated النسبي لمجموع الخلايا في هذا المستطيل عن طريق التفتيش البصري للصور في الفترة من 4 ايام القديمة (B) و 8 ايام المستعمرات القديمة (C). على سبيل المثال ، مستطيل في الجزء العلوي من مستعمرة (المسمى "1") يتوافق مع الجانب الأيسر من الرسم البياني. ويبين متوسط 4 المستعمرات ، وأشرطة الخطأ عرض الأمراض المنقولة جنسيا. خطأ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
طريقة عرض يكشف عن الهياكل الداخلية للمستعمرات. لأن الطريقة فعالة في تحديد أنماط من أنواع الخلايا في مجموعة س. سلالات خميرة مع morphologies مستعمرة مختلفة ، وأيضا في الأنواع متناقض S. ذات الصلة 5 ، الأسلوب ومن المرجح أيضا أن تعمل على نطاق واسع من الفطريات والكائنات الدقيقة الأخرى.
خطوة واحدة حاسمة لنجاح هذه الطريقة لضمان أن تكون مستعمرة بأكملها ، بما في ذلك الجزء العلوي من مستعمرة ، والمغطى في جميع أنحاء آغار البروتوكول. ويمكن تحديد ما إذا كانت المستعمرات والمغطى تماما في آغار بعد sectioning المجهري للضوء والتلوين باللون الأزرق طولويدين. عندما يتم عرضها من قبل أقسام ملطخة المجهر الضوئي ، ملطخة المتوسط آغار أغمق قليلا من المتوسط التضمين. بسبب تقلص آغار خلال الخطوات dehydrations ، من أجل استرداد كامل مستعمرة تأكد من : 1) إضافة قطرات من 4-5 آغار لتغطية موثوق مستعمرة في الخطوة 1.2 ، و 2) تقليم آغار فقط على الجانبين ، وليس على أعلى وأسفل ، وتقليم ما يكفي لتمكينه من احتواؤها ضمن قوالب في الخطوة 1.5.
والمرحلة الثانية من البروتوكول الذي هو أمر حاسم لأقسام الأمثل ينطوي على صلابة كتلة من تضمين المتوسط. عادة يتم فحص القطع بعد الحضانة بين عشية وضحاها ، من خلال حرمانهم من القوالب. إذا كانت الكتل لا تزال مرنة عندما عقدت بين كلتا يديه ومثنى ، وأنها ربما لا يكفي لsectioning الثابت. في هذه الحالة هي أنهم عادوا إلى حاضنة في نفس درجة الحرارة لمدة 48 ساعة إضافية واختبارها على النحو الوارد أعلاه.
أهمية أن تكون قادرة على الكشف عن أنماط من أنواع الخلايا داخل المستعمرات الجرثومية هي أن هذه الأنماط تعكس على الأرجح التنظيم الوظيفي للخلايا في المجتمعات المحلية. في الواقع ، قد تعكس الزخرفة الجرثومية القديمة والآليات الأساسية التي الكائنات من نفس النوع تفاعل. جنبا إلى جنب مع أساليب لرصد أنماط التعبير الجيني في مستعمرات 3،6 ، يمكن أن القدرة على اكتشاف الأنماط من تمايز الخلايا في هذه المجتمعات تساعد على اختبار الآليات المحتملة لتشكيل نمط الميكروبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة 1R15GM094770.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genetics. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
