Summary
Um método para a incorporação de colônias de leveduras permitindo o corte de microscopia óptica e eletrônica. Este protocolo permite a determinação da distribuição de células esporuladas e células pseudohyphal dentro colônias fornecendo uma nova ferramenta para a compreensão da organização de tipos de células dentro de uma comunidade de fungos.
Abstract
Padronização dos diferentes tipos de células de embriões é um mecanismo fundamental no desenvolvimento metazoários. Comunidades de microrganismos, tais como colônias e biofilmes também exibem padrões de tipos de células. Por exemplo, na levedura S. cerevisiae, células e células esporuladas pseudohyphal não são uniformemente distribuídos em colônias. A importância funcional da padronização e os mecanismos moleculares que fundamentam esses padrões ainda são pouco compreendidos.
Um desafio que diz respeito à investigação de padrões de tipos de células em colônias de fungos é que, diferentemente do tecido metazoários, as células em colônias são relativamente fracamente ligados um ao outro. Em particular, colônias de fungos não contêm o mesmo nível extensivo de matriz extracelular encontrado na maioria dos tecidos. Aqui nós relatamos em um método para a incorporação e secção colônias de leveduras que revela o interior padrões de tipos de células nessas colônias. O método pode ser usado para preparar seções espessas (0,5 μ) úteis para microscopia de luz e cortes finos (0,1 μ) adequado para microscopia eletrônica de transmissão. Células ascos e pseudohyphal podem ser facilmente distinguidas das células de levedura ovóide por microscopia de luz, enquanto a estrutura interior destas células pode ser visualizado por EM.
O método baseia-se em torno colônias com agar, infiltrando-los com o meio Spurr, e depois do corte. Colônias com um diâmetro na faixa de 1-2 mm são adequados para este protocolo. Além de visualizar o interior das colônias, o método permite a visualização da região da colônia, que invade o agar subjacente.
Protocol
1. Isolamento colônia e Fixação
- Incubar 300 colônias em ágar durante o tempo indicado (uma colônia isolada deve ser 1-2 mm de diâmetro).
- Remover colônia (viradas para cima) e médio subjacente usando uma espátula estreita.
- Coloque algumas gotas de agar 2% 42 ° C em uma lâmina de microscópio utilizando 1 mL Pipetman ponta e imediatamente colônia lugar no rosto de agar-se antes que ela se solidifica.
- Coloque algumas gotas de agar 2% 42 ° C na colônia e deixar solidificar.
- Use luvas para todas as etapas até o final deste protocolo
- Bloco guarnição com lâmina de barbear e colocá-los em um frasco de borosilicato 3,5 mL tampa de rosca contendo paraformaldeído 2% / fixador de glutaraldeído 2% por 7 dias a 4 ° C.
2. Lavagens e Tratamento Ósmio
- Após cerca de uma semana, lave blocos de ágar no gelo em química capela, incubando por duas vezes durante 15 minutos com cacodilato de sódio 0,15 M suficiente (pH 7,2) para cobrir completamente a colônia (aproximadamente 1,5 mL), em seguida, mais duas vezes durante 5 minutos com o mesmo volume de 1X OS tampão (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0).
- Adicionar o mesmo volume de OsO 1% 4 [2 mL OsO 4 (2%) + 2 mL de buffer 2x OS] para frascos (no gelo), para cobrir os blocos de agar com Cobertura de vapores químicos para uma hora depois lave duas vezes com a mesma quantidade OS de 1X tampão de 10 minutos cada.
- Deixe os frascos durante a noite a 4 ° C em tampão 1X OS.
- Fixador e todas as lavagens nesta etapa são eliminados como resíduos perigosos. Todas as pipetas contendo OsO 4 foram lavadas 3X com óleo vegetal.
3. Lavagem e desidratação
- Na manhã seguinte, lave blocos de agar duas vezes no gelo com o mesmo volume acima de água fria por 10 minutos cada um usando pipeta Pasteur.
- Lavar seqüencialmente com o mesmo volume de 25%, 50%, 75%, etanol 95% por 10 minutos cada, seguidos de duas lavagens com etanol 100% por 10 minutos. Deixe overnight a 4 ° C em etanol 100%.
- Todas as lavagens nesta etapa são eliminados como resíduos perigosos.
4. Preparação de Spurr
- Na manhã seguinte (o mais cedo possível) pesam as seguintes soluções (EM Sciences) em um copo plástico descartável sob uma coifa para preparar o reagente de Spurr. Para todo o trabalho subsequente utilizando este reagente, continuar a usar um exaustor.
(ERL solução 4,221 5 gramas)
(DER solução 736 4 gramas)
(NSA solução 13 gramas) - mix dessas soluções (lentamente) por 20 minutos na capa usando uma barra de agitação
- Adicionar solução de DMAE 0,15 gramas e agitar 20 minutos como acima.
- Degas mistura acima para 1-2 hrs no capô.
5. Infiltração de Spurr
- Assim que Spurr é feita lavar blocos de agar 5 vezes com mesmo volume de etanol acima de 100 temp% ambiente por 10 minutos cada. Após a lavagem de etanol última remover o etanol utilizando uma pipeta Pasteur para que o etanol restantes apenas cobre os blocos de ágar.
- Adicionar cerca de uma quantidade igual de reagente Spurr (aproximadamente 0,5 mL) e girar frascos na roda por 15 minutos em temperatura ambiente e, em seguida, deixar repousar por 30 minutos. Após 30 minutos retire a solução completamente usando uma pipeta de Pasteur, adicione Spurr para cobrir bloco agar (aproximadamente 1,5 mL), gire na roda de frascos por 15 minutos em temperatura ambiente e deixar repousar por 30 minutos. Repita a substituição Spurr, rotação e incubação de 3 vezes mais.
- Após os 30 minutos finais, retire o reagente Spurr e adicionar novas Spurr para cobrir os blocos. Permitir que os blocos de agar para ficar à temperatura ambiente durante 4 horas.
- Substituir a de Spurr e rodar durante a noite.
- Na parte da manhã substituir Spurr e deixar rodar até o dia seguinte.
- O lugar Spurr manhã seguinte, em moldes de silicone numeradas (Fisher Scientific) apenas para cobrir o fundo de moldes em seguida, adicione blocos agar para os moldes. Incubar a 60 ° C por 4 horas
- Após 4 horas, top off os moldes, com mais Spurr e incubar a 60 ° C durante a noite.
- Se depois de remover os blocos a partir de moldes dos blocos ainda estão um pouco flexível, volte para os moldes e incubar um período adicional de dois dias
6. Seccionamento
- Um micrótomo Leica Ultracut S foi usada para cortar 0,5 μ de espessura seções para microscopia de luz e 0,1 μ seções finas para EM transmissão.
- Para microscopia de luz, como as seções foram cortadas, eles foram colocados em uma gota de dH 2 O, e secas em um bloco de aquecimento 52 ° C. Seções secas foram então coradas com uma gota de azul de toluidina 1,0%, borato de sódio 1% por 5-15 segundos. Após a coloração, os cortes foram imediatamente lavadas em uma corrente de água, secas, coberto de meios de montagem (KPL), e uma lamínula sobre a amostra selada.
A grande relevância da formação de padrões de medição em leveduras e outros microorganismos foram revisadas anteriormente 1. Da nota particular é o maior funcionalidade de colônias microbianas organizadas em relação às comunidades desorganizado.
O método descrito é uma modificação de um método para a incorporação de maiores colônias especializados 2, e uma breve descrição dos nossos modificações foi publicada 3.
Um exemplo de uma micrografia luz de uma seção através do centro de uma colônia de S. selvagens colônia de levedura Saccharomyces é mostrado na Figura 1. Ascos, pseudo-ovóide e leveduras são facilmente distinguíveis, e na região da colônia invadindo o agar subjacente é aparente.
Um exemplo de uma micrografia eletrônica de uma cepa de levedura de laboratório (W303 fundo) é mostrado na Figura 2. A imagem é de uma região da colônia contendo uma alta freqüência de células esporuladas.
Figura 1. Microscopia de luz de uma colônia de leveduras selvagens. Esta levedura (YPS133) foi isolada recentemente de exsudatos árvore 4. A colônia foi incubada por 6 dias em média 5 yna antes do corte. Setas indicam aberta representante ascos, setas cheias indicam representante ovóide células vegetativas, pontas de flechas cheias indicam as cadeias de células alongadas (pseudo) e ascos.
Figura 2. Microscopia eletrônica de uma cepa de levedura de laboratório. A colônia de SH1020 (W303 fundo) foi incubada por 6 dias em meio yna antes secção 3. A imagem mostra uma região da seção com uma alta freqüência de ascos. Uma seta indica a estrutura bi-layer da parede de esporos.
Figura 3. Quantificação da distribuição de células esporuladas em colônias: A) uma grade contendo 15 retângulos adjacentes empilhados ao longo de seu lado mais longo é sobreposta à região central de uma imagem de uma seção de colônia. A grade é em escala, mantendo suas proporções constantes, apenas cobre a parte superior e inferior da colônia. (B & C) A fração de células esporuladas em cada retângulo em relação ao total de células na retângulo que é determinado por inspeção visual de imagens de quatro dias de idade (B) e 8 dias de idade (C) colônias. Por exemplo, o retângulo na parte superior da colônia (identificado como "1") corresponde ao lado esquerdo do gráfico. Média de quatro colônias é mostrada; as barras de erro exibir o std. erro.
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Discussion
O método apresentado revela as estruturas interior das colônias. Porque o método é eficaz na determinação dos padrões de tipos de células em um intervalo de S. cepas cerevisiae com morfologias diferentes colônia, e também em uma espécie aparentada S. paradoxus 5, o método também é passível de trabalhar em uma grande variedade de fungos e outros microorganismos.
Um passo crítico para o sucesso do método é garantir que toda a colônia, incluindo a parte superior da colônia, é envolto em agar durante todo o protocolo. Se as colônias são completamente encerrados no agar pode ser determinada após o corte para microscopia de luz e coloração com azul de toluidina. Quando cortes corados são vistos por microscopia de luz, o meio agar é manchado um pouco mais escura do que o meio de incorporação. Porque encolhe agar durante as etapas desidratações, a fim de recuperar toda a colônia não se esqueça de: 1) adicionar 4-5 gotas de agar para cobrir de forma confiável a colônia no passo 1.2, e 2) aparar o agar apenas nas laterais, e não em parte superior e inferior, e apenas aparar o suficiente para permitir que ele para caber dentro de moldes no passo 1.5.
A segunda fase do protocolo que é fundamental para seções ideal envolve a dureza do bloco de incorporar médio. Normalmente os blocos são examinados após incubação durante a noite, removendo-os a partir dos moldes. Se os blocos ainda estão flexível quando realizada entre ambas as mãos e flexionou, eles provavelmente não são rígidos o suficiente para corte. Neste caso, eles são devolvidos para a incubadora na mesma temperatura por mais 48 horas e retestado como descrito acima.
A importância de ser capaz de detectar padrões de tipos de células dentro de colónias de micróbios é que esses padrões provavelmente refletem uma organização funcional das células em comunidades. De fato, padronização microbiana pode refletir mecanismos antiga e fundamental pelo qual os organismos da mesma espécie interagem. Juntamente com métodos para monitoramento de padrões de expressão gênica em colônias 3,6, a capacidade de detectar padrões de diferenciação celular nessas comunidades pode ajudar a testar potenciais mecanismos de formação de padrões microbiana.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Pesquisa foi financiada pelo NIH 1R15GM094770.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genetics. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
