Summary
Een methode voor het inbedden gistkolonies waardoor snijden voor licht-en elektronenmicroscopie. Dit protocol maakt de bepaling van de verdeling van gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen in kolonies die een nieuwe tool in de richting van het begrijpen van de organisatie van de celtypen in een schimmel gemeenschap.
Abstract
Patroonvorming van de verschillende celtypes in embryo's is een belangrijk mechanisme in metazoïsche ontwikkeling. Gemeenschappen van micro-organismen, zoals de koloniën en biofilms ook weer patronen van celtypen. Bijvoorbeeld, in de gist S. cerevisiae, zijn gesporuleerde cellen en pseudohyfale cellen niet uniform verdeeld in kolonies. De functionele betekenis van patronen en de moleculaire mechanismen die deze patronen ten grondslag liggen zijn nog slecht begrepen.
Een van de uitdagingen met betrekking tot de onderzoeken van patronen van celtypen in schimmelkolonies is dat in tegenstelling tot metazoïsche weefsel, cellen in kolonies relatief zwak aan elkaar gehecht. In het bijzonder, hebben schimmelkolonies bevat niet dezelfde uitgebreide niveau van extracellulaire matrix gevonden in de meeste weefsels. Hier doen we verslag van een methode voor het inbedden en snijden gistkolonies dat het interieur patronen van celtypes openbaart in deze kolonies. De methode kan gebruikt worden om dikke secties voor te bereiden (0,5 μ) nuttig zijn voor lichtmicroscopie en dunne secties (0,1 μ) geschikt voor transmissie elektronenmicroscopie. ASCI en pseudohyfale cellen kunnen gemakkelijk te onderscheiden van eivormige gistcellen met lichtmicroscopie, terwijl het interieur structuur van deze cellen kan worden gevisualiseerd door EM.
De methode is gebaseerd op de omliggende kolonies met agar, infiltreert ze met medium Spurr, en dan snijden. Kolonies met een diameter in het bereik van 1-2 mm zijn geschikt voor dit protocol. In aanvulling op het visualiseren van het interieur van de kolonies, de methode maakt het mogelijk visualisatie van de regio van de kolonie dat de onderliggende agar binnendringt.
Protocol
1. Kolonie Isolatie en fixatie
- Incubeer 300 kolonies op agar medium voor de aangegeven tijd (een geïsoleerde kolonie moet 1-2 mm in diameter).
- Verwijder de kolonie (naar boven) en de onderliggende medium met behulp van een smalle spatel.
- Plaats een paar druppels van 2% agar 42 ° C op een objectglaasje met behulp van een mL Pipetman tip en meteen plaats kolonie op agar naar boven voordat het stolt.
- Plaats een paar druppels van 2% agar 42 ° C op kolonie en laat stollen.
- Draag handschoenen voor alle stappen door de rest van dit protocol
- Trim blok met scheermesje en leg ze in een 3,5 ml borosilicaat schroefdop flacon bevat 2% paraformaldehyde / 2% glutaaraldehyde fixeermiddel voor 7 dagen bij 4 ° C.
2. Wast en Osmium behandeling
- Na ongeveer 1 week, wassen agar blokken op ijs onder chemische dampkap door het incuberen van twee keer 15 minuten met genoeg 0,15 M natrium cacodylate (pH 7,2) naar de kolonie (ongeveer 1,5 ml) en vervolgens nog twee keer gedurende 5 minuten volledig bedekken met hetzelfde volume van 1X OS buffer (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0).
- Voeg hetzelfde volume van 1% OSO 4 [2 mL Oso 4 (2%) + 2 ml 2x OS Buffer] om de injectieflacons (op ijs) om de agar blokken onder chemische dampkap gedurende 1 uur te dekken dan twee keer wassen met hetzelfde bedrag van 1X OS buffer gedurende 10 minuten elk.
- Laat flacons overnacht bij 4 ° C in 1x OS buffer.
- Fixatief en alles wast in deze stap worden verwijderd als gevaarlijk afval. Alle pipetten met Oso 4 werden gespoeld 3X met plantaardige olie.
3. Wassen en uitdroging
- De volgende ochtend was agar blokken twee keer op het ijs met hetzelfde volume als hierboven met koud water gedurende 10 minuten per behulp van Pasteur pipet.
- Was opeenvolgend met hetzelfde volume van 25%, 50%, 75%, 95% ethanol gedurende 10 minuten elk gevolgd door twee wasbeurten met 100% ethanol gedurende 10 minuten. Laat een nacht bij 4 ° C, in 100% ethanol.
- Alle wasbeurten in deze stap worden verwijderd als gevaarlijk afval.
4. Spurr's voorbereiding
- De volgende ochtend (zo vroeg mogelijk) wegen van de volgende oplossingen (EM Sciences) in een wegwerp plastic beker onder een zuurkast te Spurr-reagens te bereiden. Voor alle verdere werk met behulp van dit reagens, nog steeds een zuurkast te gebruiken.
(ERL 4221-oplossing 5 gram)
(DER 736-oplossing 4 gram)
(NSA oplossing 13 gram) - mix van deze oplossingen (langzaam) gedurende 20 minuten in capuchon met een roerstaafje
- Voeg DMAE oplossing 0,15 gram en roerbak 20 minuten, zoals hierboven.
- Degas bovenstaande mengsel voor 1-2 uur in capuchon.
5. Spurr's Infiltratie
- Zodra Spurr is gemaakt wassen agar blokken 5 keer met hetzelfde volume als boven de 100% ethanol kamertemperatuur gedurende 10 minuten elk. Na de laatste ethanol te wassen wordt de ethanol met behulp van een Pasteur pipet, zodat de resterende ethanol alleen de agar blokken bedekt.
- Voeg ongeveer een gelijke hoeveelheid reagens Spurr's (ongeveer 0,5 ml) en draai flesjes op het wiel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en daarna laat het 30 minuten staan. Na 30 minuten verwijderd van de oplossing volledig met behulp van een Pasteur pipet, voeg Spurr's te dekken agar blok (ongeveer 1,5 ml), draaien flesjes op het wiel gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en laat 30 minuten staan. Herhaal de Spurr's vervanger, rotatie, en de incubatietijd drie keer.
- Na de laatste 30 minuten, verwijder Spurr's reagens en voeg verse Spurr om de blokken te dekken. Laat de agar blokken om bij kamertemperatuur staan 4 uur.
- Vervang de Spurr en draaien 's nachts.
- In de ochtend vervangen Spurr's en laat draaien tot de volgende dag.
- De volgende ochtend plaats Spurr in genummerde siliconen mallen (Fisher Scientific) alleen maar om de onderkant van mallen dek agar blokken toe te voegen aan de mallen. Incubeer bij 60 ° C gedurende 4 uur
- Na 4 uur, top uit de mallen, met meer Spurr's en incubeer bij 60 ° C gedurende de nacht.
- Als na het verwijderen van de blokken van mallen de blokken zijn nog steeds enigszins flexibel zijn, terug naar de mallen en incubeer een extra 2 dagen
6. Snijden
- Een Leica Ultracut S microtoom werd gebruikt om de 0,5 μ dikke secties voor lichtmicroscopie en 0,1 μ dunne secties voor transmissie EM te snijden.
- Voor lichte microscopie, zoals coupes werden gesneden, werden ze geplaatst op een daling van dH 2 O, en gedroogd op een 52 ° C verwarmen blokkeren. Gedroogde secties werden vervolgens gekleurd met een daling van 1,0% toluïdine blauw, 1% natriumboraat voor 5-15 seconden. Na kleuring werden de secties onmiddellijk gewassen onder een stroom van water, gedroogd, bedekt met montage media (KPL), en een dekglas verzegeld over het monster.
De brede relevantie van het meten van patroonvorming in gist en andere micro-organismen zijn eerder een beoordeeld. Van bijzonder belang is de toegenomen functionaliteit van de georganiseerde microbiële kolonies ten opzichte van gedesorganiseerd gemeenschappen.
De beschreven methode is een wijziging van een methode voor het inbedden van een grotere gespecialiseerde kolonies 2, en een korte beschrijving van onze aanpassingen is gepubliceerd 3.
Een voorbeeld van een licht microfoto van een doorsnede door het midden van een kolonie van wilde S. cerevisiae gist kolonie is weergegeven in figuur 1. ASCI, pseudohyphae en eivormige gist zijn gemakkelijk te onderscheiden, en de regio van de kolonie invasie van de onderliggende agar is ook duidelijk.
Een voorbeeld van een electronen microscoop foto van een laboratorium stam van gist (W303 achtergrond) is weergegeven in figuur 2. Het beeld is uit een regio van de kolonie met een hoge frequentie van gesporuleerde cellen.
Figuur 1. Lichtmicroscopie van een wilde gist kolonie. Deze gist (YPS133) is onlangs geïsoleerd van de boom exsudaten 4. De kolonie werd geïncubeerd gedurende 6 dagen op YNA medium 5 voorafgaand aan snijden. Open pijlen geven vertegenwoordiger van ASCI, gevuld pijlen geven vertegenwoordiger eivormig vegetatieve cellen, gevuld pijlpunten wijzen op ketens van langgerekte cellen (pseudohyphae) en de ASCI.
Figuur 2. Elektronenmicroscopie van een laboratorium giststam. De kolonie van SH1020 (W303 achtergrond) werd geïncubeerd gedurende 6 dagen op YNA medium voorafgaand aan snijden 3. Afbeelding toont een gebied van de sectie met een hoge frequentie van ASCI. Een pijl geeft aan dat de bi-laag-structuur van de spore muur.
Figuur 3. Kwantificering van de verdeling van gesporuleerde cellen in kolonies: A) een grid met 15 aangrenzende rechthoeken gestapeld langs de lange zijde is bovenop de centrale regio van een beeld van een kolonie sectie. Het raster wordt geschaald, terwijl de verhoudingen constant, om er maar omvat de boven-en onderkant van de kolonie. (B & C) De fractie van gesporuleerde cellen in elke rechthoek ten opzichte van de totale cellen in die rechthoek wordt bepaald door visuele inspectie van beelden van 4-dagen oude (B) en 8-dagen oude (C) kolonies. Bijvoorbeeld, de rechthoek aan de bovenkant van de kolonie ("1") komt overeen met de linkerkant van de grafiek. Gemiddelde van vier kolonies is getoond; de foutbalken display van de std. fout.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gepresenteerde methode toont het interieur structuren van de kolonies. Omdat de methode effectief is bij het bepalen van de patronen van celtypen in een reeks van S. cerevisiae stammen met verschillende kolonie morfologie, en ook in een verwante soorten S. paradoxus 5, de methode is ook kans om te werken op een breed scala van schimmels en andere micro-organismen.
Een kritische stap voor het succes van de methode is om ervoor te zorgen dat de gehele kolonie, waaronder de top van de kolonie, is ingekapseld in agar door het protocol. Of het nu kolonies zijn volledig ingekapseld in de agar kan worden bepaald na het snijden voor licht microscopie en kleuring met toluidine blauw. Bij de gekleurde coupes worden bekeken door lichtmicroscopie, is het agarmedium gebrandschilderde iets donkerder dan de inbedding medium. Omdat agar krimpt tijdens de dehydrations stappen, om de gehele kolonie te herstellen moet u: 1) toe te voegen 4-5 druppels agar om een betrouwbare dekking van de kolonie in stap 1.2, en 2) trimmen van de agar alleen aan de zijkant, niet op de boven-en onderkant, en slechts genoeg trimmen in staat te stellen binnen de mallen te passen in stap 1.5.
Een tweede fase van het protocol dat is van cruciaal belang voor een optimale hoofdstukken heeft betrekking op de hardheid van het blok van de inbedding medium. Typisch blokken zijn onderzocht na incubatie gedurende de nacht, door het verwijderen ze uit de mallen. Als de blokken zijn nog steeds flexibel gehouden tussen beide handen en gebogen, ze zijn waarschijnlijk niet hard genoeg voor het snijden. In dit geval zijn ze terug in de incubator bij dezelfde temperatuur voor een extra 48 uur en getest zoals hierboven.
Het belang van de mogelijkheid om patronen van celtypen te detecteren binnen microbiële kolonies is dat deze patronen waarschijnlijk een functionele organisatie van de cellen in gemeenschappen weerspiegelen. Inderdaad, kan microbiële patronen reflecteren oude en van de fundamentele mechanismen die organismen van dezelfde soort met elkaar omgaan. Samen met methoden voor monitoring van patronen van genexpressie in kolonies 3,6, kan de mogelijkheid om patronen van celdifferentiatie te detecteren in deze gemeenschappen te helpen om potentiële mechanismen van microbiële patroonvorming te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Onderzoek werd gefinancierd door NIH 1R15GM094770.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genetics. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
