Summary
खमीर प्रकाश और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए सेक्शनिंग अनुमति कालोनियों को एम्बेड करने के लिए एक विधि. इस प्रोटोकॉल sporulated एक कवक समुदाय के भीतर सेल प्रकार के संगठन को समझने की ओर एक नए उपकरण प्रदान कालोनियों के भीतर और कोशिकाओं pseudohyphal कोशिकाओं के वितरण का निर्धारण की अनुमति देता है.
Abstract
भ्रूण में अलग सेल प्रकार के patterning metazoan विकास में एक महत्वपूर्ण तंत्र है. कालोनियों और biofilms जैसे सूक्ष्मजीवों के समुदाय को भी सेल प्रकार के पैटर्न प्रदर्शित करते हैं. उदाहरण के लिए, खमीर में एस cerevisiae, sporulated कोशिकाओं और pseudohyphal कोशिकाओं समान कालोनियों में वितरित कर रहे हैं. patterning और आणविक तंत्र है कि इन नमूनों को आबाद की कार्यात्मक महत्व अभी भी खराब समझ रहे हैं.
कवक कालोनियों में सेल प्रकार के पैटर्न की जांच करने के लिए सम्मान के साथ एक चुनौती है कि metazoan ऊतक के विपरीत, कालोनियों में कोशिकाओं अपेक्षाकृत कमजोर कर रहे हैं एक दूसरे से जुड़ी है. विशेष रूप से, कवक कालोनियों सबसे ऊतकों में पाया कोशिकी मैट्रिक्स के एक ही व्यापक स्तर शामिल नहीं है. यहाँ हम एम्बेडिंग और सेक्शनिंग खमीर कालोनियों कि इन कालोनियों में सेल प्रकार के आंतरिक पैटर्न से पता चलता है के लिए एक विधि पर रिपोर्ट. विधि मोटी वर्गों को तैयार (0.5 μ) प्रकाश माइक्रोस्कोपी और पतली वर्गों (0.1 μ) संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त के लिए उपयोगी किया जा सकता है. एएससीआई और pseudohyphal कोशिकाओं को आसानी से प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा ovoid खमीर कोशिकाओं से प्रतिष्ठित किया जा है, जबकि इन कोशिकाओं के आंतरिक संरचना EM द्वारा visualized किया जा सकता है.
विधि अगर साथ आसपास कालोनियों, उन्हें Spurr माध्यम से घुसपैठ, और तब सेक्शनिंग पर आधारित है. 1-2 मिमी की रेंज में एक व्यास के साथ कालोनियों इस प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त हैं. कालोनियों के इंटीरियर visualizing अलावा, विधि है कि अंतर्निहित अगर आक्रमण कॉलोनी के क्षेत्र के दृश्य की अनुमति देता है.
Protocol
1. कालोनी अलगाव और फिक्सेशन
- अगर मध्यम पर संकेत समय के लिए 300 कालोनियों सेते हैं (एक अलग उपनिवेश 1-2 मिमी व्यास में होना चाहिए).
- कॉलोनी (चेहरा) और अंतर्निहित मध्यम एक संकीर्ण रंग का उपयोग कर निकालें.
- अगर 2% की कई बूँदें प्लेस 42 डिग्री सेल्सियस अगर चेहरे पर 1 एमएल pipetman टिप और तुरंत जगह कॉलोनी का उपयोग करने से पहले यह solidifies एक खुर्दबीन स्लाइड पर.
- 42 ° कॉलोनी पर सी 2% अगर के कई बूँदें प्लेस और जमना अनुमति देते हैं.
- इस प्रोटोकॉल के शेष के माध्यम से सभी चरणों के लिए दस्ताने पहनें
- छाँटो ब्लॉक और धार के साथ एक 3.5 एमएल borosilicate पेंच टोपी 7 दिनों के लिए 2% paraformaldehyde / 2% glutaraldehyde लगानेवाला युक्त शीशी में उन्हें 4 में जगह डिग्री सेल्सियस
2. Washes और आज़मियम उपचार
- के बारे में 1 सप्ताह के बाद, रासायनिक धूआं हुड के तहत पर्याप्त 0.15M सोडियम (7.2 पीएच) cacodylate पूरी तरह से एक ही मात्रा के साथ (लगभग 1.5 एमएल) के 5 मिनट के लिए तो कॉलोनी में दो बार अधिक को कवर के साथ दो बार 15 मिनट के लिए incubating द्वारा बर्फ पर अगर ब्लॉकों धो 1X ओएस बफर (100 मिमी के.एच. 2 4 पीओ 10 मिमी MgCl 2, 6.0 पीएच).
- रासायनिक धूआं हुड के तहत 1 घंटे के लिए अगर ब्लॉक कवर 1% 4 OSO का एक ही मात्रा शीशियों के लिए [2 एमएल Oso 4 (2%) + 2 एमएल 2x ओएस बफर] (बर्फ पर) जोड़ें तो एक ही राशि के साथ दो बार धोने 1X ओएस बफर के 10 मिनट प्रत्येक के लिए.
- शीशियों 4 में रातोंरात छोड़ो ° 1X ओएस बफर में सी.
- लगानेवाला और इस चरण में सभी washes के खतरनाक अपशिष्ट के रूप में निपटारा कर रहे हैं. सभी 4 Oso युक्त pipettes वनस्पति तेल के साथ 3X rinsed थे .
3. धो और निर्जलीकरण
- इसके बाद के संस्करण के रूप में ठंडे पानी की एक ही 10 पाश्चर पिपेट का उपयोग कर प्रत्येक मिनट के लिए मात्रा के साथ अगले सुबह धोने बर्फ पर दो बार अगर ब्लॉक.
- उसी मात्रा का 25%, 50%, 75%, 10 10 मिनट के लिए 100% इथेनॉल के साथ 2 washes के द्वारा बाद प्रत्येक मिनट के लिए 95% इथेनॉल के साथ क्रमिक रूप से धो लें. 4 में रात भर छोड़ दो डिग्री सेल्सियस 100% इथेनॉल में.
- इस चरण में सभी washes के खतरनाक कचरे के रूप में निपटाया जाता है.
4. Spurr तैयारी
- निम्नलिखित सुबह (के रूप में संभव के रूप में में जल्दी) एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक बीकर में निम्नलिखित (EM विज्ञान) Spurr अभिकर्मक तैयार करने के लिए एक धूआं हुड के नीचे समाधान तौलना. बाद के सभी इस अभिकर्मक का उपयोग कर काम के लिए, के लिए एक धूआं हुड का उपयोग जारी है.
(ERL ४२२१ समाधान 5 ग्राम)
(DER 736 समाधान 4 ग्राम)
(एनएसए समाधान 13 ग्राम) - हुड में 20 मिनट हलचल पट्टी का उपयोग करने के लिए इन समाधान (धीरे) मिश्रण
- DMAE समाधान 0.15 ग्राम जोड़ें और 20 मिनट के रूप में ऊपर से हलचल.
- देगास हुड में 1-2 घंटे के लिए ऊपर मिश्रण.
5. Spurr घुसपैठ
- जैसे ही Spurr अगर ब्लॉकों एक ही मात्रा के साथ 5 बार धोने के रूप में 10 मिनट प्रत्येक के लिए 100% कमरा अस्थायी इथेनॉल के ऊपर बना है. पिछले इथेनॉल धोने के बाद एक पाश्चर पिपेट का उपयोग ताकि शेष इथेनॉल सिर्फ अगर ब्लॉक शामिल हैं इथेनॉल हटा दें.
- लगभग Spurr अभिकर्मक (लगभग 0.5 एमएल) के बराबर राशि जोड़ें और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पहिया पर शीशियों को घुमाएगी और फिर 30 मिनट के लिए खड़े होने की अनुमति. 30 मिनट के बाद पूरी तरह से एक पाश्चर पिपेट का उपयोग कर समाधान निकालने के लिए, जोड़ने के Spurr अगर ब्लॉक (लगभग 1.5 एमएल) को कवर, कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए पहिया पर शीशियों और बारी बारी से 30 मिनट के लिए खड़े होने की अनुमति. Spurr प्रतिस्थापन, रोटेशन, और 3 ऊष्मायन अधिक बार दोहराएँ.
- अंतिम 30 मिनट के बाद, Spurr अभिकर्मक हटाने और ताजा Spurr जोड़ने के लिए ब्लॉक कवर. अगर ब्लॉक कमरे Temp पर 4 घंटे के लिए खड़े करने के लिए अनुमति दें.
- Spurr है बदलें और बारी बारी से रात भर.
- सुबह में Spurr जगह और अगले दिन जब तक घूर्णन छोड़.
- अगली सुबह जगह Spurr गिने सिलिकॉन molds (फिशर साइंटिफिक) में सिर्फ molds के नीचे कवर करने के लिए तब molds करने के लिए अगर ब्लॉक जोड़ने. 4 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते
- बाद 4 बजे, अधिक Spurr और 60 डिग्री सेल्सियस रातोंरात सेते के साथ नए नए साँचे बंद ऊपर,.
- यदि molds से ब्लॉक को हटाने के बाद ब्लॉक अभी भी थोड़ा लचीला molds करने के लिए लौटने और एक अतिरिक्त 2 दिनों सेते
6. सेक्शनिंग
- एक Leica एस Ultracut सूक्ष्म तक्षणी 0.5 प्रकाश माइक्रोस्कोपी और 0.1 संचरण EM के लिए पतली वर्गों μ के लिए μ मोटी वर्गों में कटौती करने के लिए इस्तेमाल किया गया था.
- प्रकाश माइक्रोस्कोपी के लिए, के रूप में वर्गों को काट रहे थे, वे DH 2 हे की एक बूंद पर रखा गया था, और एक 52 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक पर सूख. सूखे वर्गों तो 1.0% toluidine नीले, 5-15 सेकंड के लिए 1% borate सोडियम की एक बूंद के साथ दाग रहे थे. वर्गों, धुंधला के बाद तुरंत पानी की एक धारा के तहत धोया थे, सूखे, बढ़ते मीडिया (KPL) में शामिल किया गया है, और एक कवर पर्ची के नमूने पर सील.
खमीर और अन्य सूक्ष्मजीवों में पैटर्न गठन को मापने के व्यापक प्रासंगिकता 1 पहले की समीक्षा की गई . नोट का विशेष बेतरतीब समुदायों को संगठित माइक्रोबियल रिश्तेदार कालोनियों की वृद्धि की कार्यक्षमता है.
वर्णित विधि बड़ा विशेष 2 कालोनियों को एम्बेड करने के लिए एक विधि के एक संशोधन है, और हमारे संशोधनों का एक छोटा वर्णन 3 किया गया है प्रकाशित किया है.
जंगली एस की एक कॉलोनी के केन्द्र के माध्यम से एक अनुभाग के प्रकाश माइक्रोग्राफ का एक उदाहरण cerevisiae खमीर कॉलोनी चित्र 1 में दिखाया गया है. एएससीआई pseudohyphae, और ovoid खमीर आसानी से अलग पहचाना जाता है, और अंतर्निहित अगर हमलावर कॉलोनी के क्षेत्र में भी स्पष्ट है.
खमीर के एक प्रयोगशाला तनाव (W303 पृष्ठभूमि) के एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ का एक उदाहरण चित्रा 2 में दिखाया गया है. छवि sporulated कोशिकाओं के एक उच्च आवृत्ति वाले कॉलोनी के एक क्षेत्र से है.
चित्रा 1 एक जंगली खमीर कॉलोनी की लाइट माइक्रोस्कोपी. यह खमीर (YPS133) हाल ही में पेड़ 4 exudates से पृथक किया गया. कॉलोनी YNA 5 सेक्शनिंग करने के लिए पहले मध्यम पर 6 दिनों के लिए incubated किया गया था. ओपन तीर प्रतिनिधि एएससीआई से संकेत मिलता है, भरा तीर प्रतिनिधि ovoid वनस्पति कोशिकाओं से संकेत मिलता है, भरा arrowheads लम्बी कोशिकाओं की श्रृंखला (pseudohyphae) और एएससीआई से संकेत मिलता है.
चित्रा 2 एक प्रयोगशाला खमीर तनाव के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी. SH1020 (W303 पृष्ठभूमि) के कॉलोनी YNA माध्यम पर 6 दिनों के लिए incubated 3 सेक्शनिंग करने के लिए पहले. छवि एएससीआई की एक उच्च आवृत्ति के साथ अनुभाग के क्षेत्र से पता चलता है. एक तीर द्वि - परत बीजाणु दीवार की संरचना को इंगित करता है.
चित्रा 3. Sporulated कोशिकाओं की कालोनियों में वितरण की मात्रा का ठहराव: ए) 15 सटे उनके लंबे पक्ष के साथ खड़ी आयत युक्त ग्रिड एक कॉलोनी खंड के एक छवि के मध्य क्षेत्र पर आरोपित है. ग्रिड पहुंचा है, जबकि इसके अनुपात में लगातार रखते हुए, बस और कॉलोनी के ऊपर और नीचे शामिल हैं. (बी एंड सी) कि आयत में कुल कोशिकाओं के सापेक्ष प्रत्येक आयत में sporulated कोशिकाओं के अंश 4 दिन (बी) के पुराने और 8 दिन पुरानी कालोनियों (सी) से छवियों के दृश्य निरीक्षण के द्वारा निर्धारित किया जाता है. उदाहरण के लिए, कॉलोनी के शीर्ष पर आयत (लेबल "1") ग्राफ के बाईं ओर के लिए मेल खाती है. 4 कालोनियों के मीन दिखाया गया है, त्रुटि सलाखों एसटीडी प्रदर्शन. त्रुटि.
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Discussion
प्रस्तुत विधि कालोनियों की आंतरिक संरचनाओं पता चलता है. क्योंकि विधि एस के एक रेंज में सेल प्रकार के पैटर्न को निर्धारित करने में प्रभावी है अलग कॉलोनी morphologies के साथ cerevisiae उपभेदों, और यह भी एक संबंधित प्रजातियों एस paradoxus में 5, विधि भी कवक और अन्य सूक्ष्मजीवों के एक विस्तृत रेंज पर काम करने की संभावना है .
विधि की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम करने के लिए सुनिश्चित करें कि कॉलोनी के ऊपर सहित पूरे कॉलोनी, प्रोटोकॉल भर में अगर में encased है. चाहे अगर कालोनियों में पूरी तरह से encased हैं और toluidine नीले रंग के साथ प्रकाश माइक्रोस्कोपी धुंधला के लिए सेक्शनिंग के बाद निर्धारित किया जा सकता है. जब दाग वर्गों प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखा जाता है, अगर मध्यम embedding के माध्यम से थोड़ा गहरा दाग है. क्योंकि dehydrations चरणों के दौरान अगर सिकुड़ती, क्रम में पूरे कॉलोनी की वसूली सुनिश्चित हो: 1) अगर की 4-5 बूँदें जोड़ने के लिए मज़बूती से 1.2 चरण में कॉलोनी को कवर, और 2) केवल पक्षों पर अगर ट्रिम करने के लिए, पर नहीं ऊपर और नीचे, और केवल पर्याप्त ट्रिम करने के लिए यह molds के भीतर 1.5 चरण में फिट करने के लिए अनुमति देते हैं.
प्रोटोकॉल है कि इष्टतम वर्गों के लिए महत्वपूर्ण है की एक दूसरे चरण में मध्यम एम्बेड के ब्लॉक की कठोरता शामिल है. आमतौर पर ब्लॉक रातोंरात ऊष्मायन के बाद जांच कर रहे हैं molds से उन्हें हटाने के द्वारा,. यदि ब्लॉक अभी भी कर रहे हैं लचीला है जब दोनों हाथों के बीच आयोजित और flexed है, वे सेक्शनिंग के लिए शायद नहीं कर रहे हैं काफी मुश्किल है. इस मामले में वे एक ही तापमान पर इनक्यूबेटर लौट रहे हैं और एक अतिरिक्त 48 घंटे के लिए ऊपर के रूप में retested.
माइक्रोबियल कालोनियों के भीतर सेल प्रकार के पैटर्न का पता लगाने में सक्षम होने के महत्व यह है कि इन नमूनों की संभावना समुदायों में कक्षों की एक कार्यात्मक संगठन को दर्शाते हैं. दरअसल, माइक्रोबियल patterning के प्राचीन और मौलिक तंत्र है जिसके द्वारा एक ही प्रजाति के जीवों बातचीत को प्रतिबिंबित कर सकते हैं. 3,6 कालोनियों में जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न की निगरानी के लिए तरीकों के साथ साथ, इन समुदायों में सेल भेदभाव के पैटर्न का पता लगाने की क्षमता माइक्रोबियल पैटर्न के गठन के संभावित तंत्र का परीक्षण करने में मदद कर सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
अनुसंधान NIH 1R15GM094770 द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
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