Summary
Метод для встраивания дрожжей колонии позволяет срезов для световой и электронной микроскопии. Этот протокол позволяет определить распределение спорулированных клеток и pseudohyphal клеток в колонии предоставления новым инструментом на пути к пониманию организации типов клеток в течение грибковых сообщества.
Abstract
Структурирования различных типов клеток в эмбрионы является ключевым механизмом в развитии многоклеточных. Сообщества микроорганизмов, например, колоний и биопленок также отображать модели типов клеток. Например, в дрожжах S. CEREVISIAE, спорулированных клеток и pseudohyphal клетки не равномерно распределены в колониях. Функциональное значение структурирование и молекулярные механизмы, лежащие в основе этих моделей по-прежнему плохо изучены.
Одна из проблем, по отношению к исследованию моделей типов клеток в колонии грибов является то, что в отличие от многоклеточных тканей, клеток в колонии относительно слабо соединены друг с другом. В частности, грибковых колоний не содержат обширную же уровня внеклеточного матрикса в большинстве тканей. Здесь мы сообщаем о методе вложения и срезов дрожжей колонии, который показывает интерьер модели типов клеток в этих колониях. Метод может быть использован для подготовки толстым слоем (0,5 μ) полезно для световой микроскопии и тонкие срезы (0,1 μ), пригодных для просвечивающей электронной микроскопии. Сумки и pseudohyphal клетки могут легко отличить от яйцевидной дрожжевых клеток с помощью световой микроскопии, в то время как внутренняя структура этих клеток могут быть визуализированы на EM.
Метод основан на окружающих колонии с агар, проникновение их со средними Сперр, а затем секционирования. Колонии диаметром в диапазоне 1-2 мм подходят для этого протокола. В дополнение к визуализации интерьера колоний, метод позволяет выявлять области колонию, которая вторгается основной агара.
Protocol
1. Изоляция колонии и фиксация
- Инкубируйте 300 колоний на агаре средой для указанного времени (изолированные колонии должна быть на 1-2 мм в диаметре).
- Удалить колонии (лицевой стороной вверх) и подстилающей среде с помощью узкого шпателя.
- Место несколько капель 2% агара 42 ° С на предметном стекле микроскопа с использованием 1 мл pipetman наконечник и сразу же месте колонии на агаре лицевой стороной вверх перед она затвердевает.
- Место несколько капель 2% агара 42 ° С на колонии и дать затвердеть.
- Надевайте перчатки для всех шагов по оставшейся части этого протокола
- Обрезка блока с лезвием бритвы и поместить их в 3,5 мл боросиликатного завинчивающейся крышкой флакон, содержащий 2% параформальдегида / 2% глутаральдегида фиксатором в течение 7 дней при температуре 4 ° C.
2. Моет и осмия Лечение
- Примерно через 1 неделю, мыть агар блоков на лед под химическим вытяжного шкафа путем инкубирования в два раза в течение 15 минут с достаточно натрия 0,15 М какодилатном (рН 7,2), чтобы полностью покрыть колонии (примерно 1,5 мл), затем еще дважды в течение 5 минут с того же объема из 1X OS буфера (100 мМ KH 2 PO 4 10 мМ MgCl 2, рН 6,0).
- Добавить такой же объем 1% OsO 4 [2 мл OsO 4 (2%) + 2 мл 2 раза OS буфера] для флаконов (на льду), чтобы покрыть агар блоков под химическим вытяжной шкаф на 1 час, затем вымыть два раза с таким же количеством из 1X OS буфера в течение 10 минут каждый.
- Оставьте флаконы на ночь при 4 ° С в буфере 1X ОС.
- Fixative и все смывает на этом этапе удаляются как опасные отходы. Все пипетки содержащие OsO 4 были промыты 3X с растительным маслом.
3. Вымойте и обезвоживание
- На следующее утро мыть агар блоки в два раза на льду с такой же объем, что и выше с холодной водой в течение 10 минут каждый с помощью пипетки Пастера.
- Вымойте последовательно с тем же объемом 25%, 50%, 75%, 95% этанола в течение 10 минут каждая, затем 2 моет со 100%-ным этанолом в течение 10 минут. Оставить на ночь при 4 ° С на 100% этанола.
- Все моет на этом этапе удаляются как опасные отходы.
4. Сперр в подготовке
- На следующее утро (как можно раньше) весят следующие решения (EM наук) в одноразовый стакан пластмасс под вытяжным шкафом для подготовки реагентов Сперр в. Для всех последующих работ с использованием этого реагента, продолжают использовать вытяжной шкаф.
(ERL 4221 решением 5 г)
(DER 736 раствор 4 г)
(NSA решение 13 грамм) - смешивать эти решения (медленно) в течение 20 минут в капот использованием мешалкой
- Добавить DMAE решение 0,15 г, и движение 20 минут и выше.
- Дега выше смесь в течение 1-2 часов в капот.
5. Сперр в Инфильтрация
- Как только Сперр выполнен мыть агар блоков 5 раз с такой же объем, что и выше 100% этанола комнатной температуре в течение 10 минут каждый. После последнего мыть этанола удаления этанола помощью пипетки Пастера, так что оставшиеся этанола просто охватывает агар блоков.
- Добавьте примерно равное количество реагента Сперр (примерно 0,5 мл) и поверните флаконов на колесе в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем дать постоять 30 минут. Через 30 минут удалите решение полностью используя пипетку Пастера, добавьте Сперр для покрытия агара блок (около 1,5 мл), вращать колесо флаконах по 15 минут при комнатной температуре и дать постоять 30 минут. Повторите замены Сперр, вращение, и инкубации еще 3 раза.
- После последние 30 минут, удалить реагент Сперр и добавить свежие Сперр, распространив его на блоки. Разрешить агар блоков стоять при комнатной температуре в течение 4 часов.
- Замените Сперр и вращаются в одночасье.
- Утром заменить Сперр и оставить вращающихся до следующего дня.
- Следующий Сперр место утром в пронумерованных силиконовые формы (Fisher Scientific), чтобы покрыть дно формы затем добавить агар блоки для пресс-форм. Инкубировать при 60 ° С в течение 4 часов
- После 4-х часов, довершение пресс-форм, с более Сперр и инкубировать при температуре 60 ° С в течение ночи.
- Если после удаления блоков из форм блоки все еще немного гибкой, вернуться к пресс-форм и инкубировать дополнительных 2 дней
6. Секционирование
- Микротома Leica Ultracut S был использован, чтобы сократить 0,5 μ толстых секций для световой микроскопии и 0,1 μ тонких срезов для передачи EM.
- Для световой микроскопии, как разделы были сокращены, они были размещены на каплю дН 2 O и высушивали на 52 ° C тепла блока. Сушеные срезы затем окрашивали капли 1,0% толуидиновым синим, 1% борат натрия в течение 5-15 секунд. После окрашивания, разделы были немедленно мыть под струей воды, сухие, покрытые монтажа СМИ (КПЛ), и покровным стеклом запечатанном по образцу.
Широкий актуальность измерения структур в дрожжи и другие микроорганизмы были рассмотрены ранее 1. Особо следует отметить повышенную функциональность организованной колонии микробных относительно дезорганизованы общин.
Описанный метод является модификацией метода для вложения больших специализированных колоний 2, и краткое описание нашей модификации была опубликована 3.
Примером свет микрофотография разделе через центр колонии диких С. колонией дрожжей CEREVISIAE показано на рисунке 1. Сумки, pseudohyphae и яйцевидные дрожжи легко различимы, и область колонии вторжения в основной агар также очевидна.
Примером электронная микрофотография лаборатории штамма дрожжей (W303 фоне) показано на рисунке 2. Изображение из области колонии содержащих высокую частоту спорулированных клеток.
Рисунок 1. Световая микроскопия дикого колонией дрожжей. Это дрожжи (YPS133) был выделен недавно из дерева экссудаты 4. Колония была инкубировали в течение 6 дней на YNA средний 5 до секционирования. Открытые стрелки указывают представитель сумки, наполненные стрелки указывают представитель яйцевидные вегетативных клеток, заполненных наконечники стрел свидетельствуют цепочки удлиненных клеток (pseudohyphae) и сумки.
Рисунок 2. Электронная микроскопия штамм дрожжей лаборатории. Колония SH1020 (W303 фоне) инкубировали в течение 6 дней на средней YNA до секционирования 3. Изображение показывает область секция с высокой частотой сумки. Стрелка указывает двухслойной структуре споры стене.
Рисунок 3. Количественное распределение спорулированных клеток в колонии:) сетка, содержащая 15 прилегающих прямоугольников уложены вдоль длинной стороны накладывается на центральном регионе образ колонии разделе. Сетка масштабируется, сохраняя при этом его пропорции постоянно, просто покрывает верхней и нижней части колонии. (B & C) доля спорулированных ячеек в каждом прямоугольнике по отношению к общему клетки этого прямоугольника определяется при визуальном осмотре изображений с 4-дневных (В) и 8-дневных (C) колоний. Например, прямоугольник в верхней части колонии (с надписью "1") соответствует левой части графика. Среднее из 4 колоний показано, ошибка Панели ЗППП. ошибке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод, изложенный раскрывает внутренние структуры колоний. Потому что метод эффективен в определении структуры клеточных типов в диапазоне S. CEREVISIAE штаммов с различной морфологией колоний, а также в связанных с ними видов С. Парадоксальный 5, метод, вероятно, также работы по широкому спектру грибков и других микроорганизмов.
Один важный шаг для успеха метода заключается в обеспечении всей колонии, в том числе верхней части колонии, заключен в агар всей протокола. Независимо от того колонии полностью заключен в агар может быть определена после перерезки для световой микроскопии и окрашивания толуидиновым синим. При окраске разделах рассматриваются с помощью световой микроскопии, агар окрашивается несколько темнее, чем вложение среды. Потому что агар сжимается во время dehydrations шаги для того, чтобы восстановить всю колонию не забудьте: 1) добавить 4-5 капель агара надежно охватывать колонии в шаге 1.2, и 2) отделка агар только по сторонам, а не на сверху и снизу, и только отделка достаточно, чтобы позволить ему вписываются в формы в шаге 1.5.
Второй этап протокол, который является критическим для оптимального разделов включает в себя жесткость блока вложение среды. Обычно блоки рассматриваются после инкубации в течение ночи, удаляя их из пресс-форм. Если блоков по-прежнему гибкими, когда состоялся между обеими руками и согнутыми, они, вероятно, не достаточно сильно для секционирования. В этом случае они возвращаются в инкубатор при той же температуре в течение дополнительных 48 часов и повторное тестирование как указано выше.
Значение, которое позволяет обнаруживать шаблоны типов клеток в микробных колоний в том, что эти образцы всего, отражают функциональной организации клетки в общины. В самом деле, микробного структурирование может отражать древнюю и основные механизмы, с помощью которых организмы того же вида взаимодействия. Вместе с методами мониторинга моделей экспрессии генов в колонии 3,6, способность обнаруживать модели дифференцировки клеток в этих сообществах может помочь проверить потенциальных механизмов микробного структурообразования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Исследование было профинансировано NIH 1R15GM094770.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genetics. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
