Summary
嵌入酵母菌菌落，允许光学和电子显微镜切片的一种方法。此协议允许孢子细胞的分布和假菌丝细胞内提供了一个新的工具，对理解组织类型的细胞内一种真菌社会的殖民地的决心。
Abstract
不同类型的细胞在胚胎的图案是一个后生发展的关键机制。殖民地和生物膜的微生物，如社区也显示细胞类型的模式。例如，在酵母S.的酵母 ，孢子细胞和假菌丝细胞不是均匀分布在菌落。图案和背后的分子机制，这些模式的功能的重要性仍然知之甚少。
调查真菌菌落的细胞类型模式的一个挑战是，不像后生动物的组织，细胞在殖民地比较弱连接到另一个。特别是，真菌菌落不包含在大多数组织中发现的细胞外基质的广泛的同一水平。在这里，我们报告上嵌入和切片酵母殖民地，揭示了在这些殖民地的细胞类型的内部模式的方法。该方法可用于准备厚切片，光镜和超薄切片（0.1μ）适合透射电子显微镜（0.5μ）有用。 ASCI和假菌丝细胞可以很容易地区别于卵形酵母细胞，通过光镜，而这些细胞的内部结构可以由EM观察。
该方法是基于对菌落周围的琼脂，渗透Spurr的培养基，然后切片。菌落直径在1-2毫米的范围内适用于本议定书。此外，以可视化的内部殖民地，该方法允许侵入底层琼脂的殖民地地区的可视化。
Protocol
1。殖民地隔离和固定
- 指定的时间孵育300琼脂培养基上菌落（一个孤立的殖民地应在直径1-2毫米）。
- 删除殖民地（正面朝上）及相关的媒介，使用一个狭窄的铲。
- 将数滴2％琼脂42 ° C的载玻片，使用琼脂面对1毫升pipetman提示，并立即将殖民地之前巩固。
- 置于42℃菌落数滴2％琼脂，并允许以巩固。
- 穿手套的所有步骤，通过本协议的其余部分
- 修剪块刀片，并将其放置在一个3.5毫升硼硅螺丝帽7天的2％多聚甲醛/ 2％戊二醛固定液的小瓶4 ° C。
2。清洗和锇治疗
- 约1周后，洗下孵育15分钟，两次不够0.15米的钠cacodylate（pH 7.2）中，同体积的完全覆盖殖民地（约1.5毫升），然后5分钟两次化学通风柜在冰上的琼脂块1X操作系统缓冲区（100毫米KH 2 PO 4 10毫米氯化镁2，pH值6.0）。
- 加入相同体积的1％OSO 4 [2 OSO 4毫升（2％）+ 2毫升2个操作系统的缓冲区]小瓶（冰）覆盖琼脂块化学通风柜下1小时，然后洗两次相同数额1X操作系统的缓冲区，每次10分钟。
- 离开瓶过夜，在4 ° C的1X操作系统的缓冲区。
- 固定液，并在此步骤中的所有洗作为危险废物处置。所有含有OSO 4的移液器冲洗用植物油的三倍。
3。清洗和脱水
- 第二天早晨洗两次冰琼脂块相同体积冷水以上，每次10分钟使用巴斯德吸管。
- 顺序相同体积的25％，50％，75％，95％乙醇10分钟，每2 100％乙醇10分钟洗涤，冲洗。离开一夜之间在4 ° C的100％的乙醇。
- 这一步洗处置危险废物。
4。 Spurr的准备
- 第二天早晨，（尽快）权衡成一次性塑料烧杯中的下列解决方案下通风柜准备Spurr试剂（EM）。使用这种试剂对于所有后续工作，继续使用通风柜。
（广深港高速铁路4221解决方案5克）
（DER 736解决方案4克）
（NSA的解决方案，13克） - 搅拌20分钟罩，使用搅拌棒的这些解决方案（慢慢）
- 添加0.15克的DMAE的解决方案，并搅拌20分钟以上。
- 德加罩在1-2小时以上的混合物。
5。 Spurr的渗透
- 只要Spurr的是洗琼脂块，与同体积的5倍以上100％的空间，每次10分钟的温度乙醇。在最后的乙醇洗涤，除去乙醇，用巴斯德吸管，使剩余的乙醇只是涵盖的琼脂块。
- 新增约等量Spurr的试剂（约0.5毫升）和旋转为15分钟，在室温下对车轮的小瓶，然后让站在30分钟。 30分钟后删除的解决方案，完全使用巴斯德吸管，添加Spurr的覆盖琼脂块（约1.5毫升），对轮旋转瓶在室温下15分钟，静置30分钟。重复Spurr的更换，旋转和孵化3次以上。
- 最后30分钟后，取出Spurr的试剂，并补充新鲜Spurr的覆盖块。允许琼脂块，在室温下静置4小时。
- 更换Spurr的旋转过夜。
- 在早上取代Spurr和旋转，直到次日离开。
- 第二天早晨，地方Spurr的编号硅胶模具（尔科技），只是覆盖模具的底部，然后加入琼脂块的模具。在60℃孵育4小时
- 4小时后，关闭模具的顶部，Spurr的，在60 ° C过夜孵育。
- 如果取出后从模具块的块还是稍微灵活的，返回的模具，并培育一个额外的2天
6。切片
- 徕卡Ultracut小号切片机是用于切割0.5μ厚切片光镜和0.1μ薄片传输的EM。
- 光镜，部分被切断，他们被安置在生署2下降，并在52℃加热块干燥。干节，然后沾上下降1.0％甲苯胺蓝，1％硼酸钠为5-15秒。染色后，部分被立即下的水流洗净，晒干，在安装媒体（KPL）覆盖，并盖玻片样品密封。
酵母和其他微生物的测量模式形成的广泛的相关性已审查以前1。特别值得注意的是增加功能相对混乱的社区组织的微生物菌落。
所描述的方法中嵌入较大的专门殖民地2的方法修改的简短描述了我们的修改已出版了3 。
野生S.殖民地中心的一个部分，通过光显微镜的一个例子酵母酵母殖民地如图1所示。 ASCI，假菌丝及卵圆形的酵母很容易分辨，和入侵的底层琼脂的殖民地地区也很明显。
电子显微镜实验室的酵母株（W303背景）的一个例子是如图2所示。该图像是从一个区域含有孢子细胞的高频率的殖民地。
图1。野生酵母殖民地的光镜。这酵母（YPS133）最近被隔离树分泌物4。培养6天YNA中等5到切片前殖民地。打开的箭头指示代表ASCI，充满箭头指示代表卵形营养细胞，充满箭头指示链拉长细胞（假菌丝）和ASCI。
图2电子显微镜实验室酵母菌株。 SH1020（W303背景）菌落培养6天YNA中等，前切片 3 。图像显示了与高频率的ASCI部分地区。箭头指示的孢子壁的双向层结构。
图3。在殖民地孢子细胞分布的定量分析 ：一）包含沿其长边堆放的15个毗邻的矩形网格叠加在中部地区的一个殖民地部分的形象。网格缩放，同时保持其比例不变，只是涵盖的顶部和底部的殖民地。 （B＆C）在每个矩形在该矩形的细胞总数相对孢子细胞的一小部分是图像的目视检查，为期4天的老（B）和8日龄（三）殖民地决定。例如，在殖民地上方的矩形（标有“1”）对应的图形的左侧。平均4殖民地显示错误栏显示STD。错误。
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Discussion
方法揭示了殖民地的内部结构。由于该方法是有效S 的范围内确定的细胞类型的模式酵母株不同的菌落形态，而且在一个相关的物种S. paradoxus 5，该方法也有可能工作的真菌和其他微生物的广泛。
方法的成功的一个关键的步骤是，以确保整个殖民地，包括殖民地的顶部，是在整个协议的琼脂包裹。无论是殖民地完全包裹在琼脂可以切片光镜和甲苯胺蓝染色后才能确定。当染色切片光镜下观察，琼脂培养基上沾有略高于包埋剂暗。由于琼脂缩小在dehydrations步骤，以收回整个殖民地，一定要：1）添加4-5滴的琼脂可靠地覆盖在步骤1.2的殖民地，和2）修剪琼脂，只在两侧，而不是顶部和底部，只修剪足以允许它在模具适合在步骤1.5。
一个协议，以获得最佳的部分是关键的第二阶段涉及块包埋剂的硬度。典型的块检查孵育过夜后，从模具中取出。如果块仍然是灵活的双手之间举行，并弯曲，它们可能不是够硬切片。在这种情况下，他们返回到孵化器在相同的温度下增设48个小时以上复检。
能够检测类型的细胞内微生物菌落模式的意义在于，这些模式可能反映了细胞进社区的功能组织。事实上，微生物的图案可能反映了古代和同一物种的生物相互作用的基本机制。加上殖民地3,6基因表达的监测模式的方法，能够检测细胞分化的模式，在这些社区可以帮助测试潜在微生物格局的形成机制。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
研究是由美国国立卫生研究院1R15GM094770。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genetics. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
