Summary
Une méthode pour l'intégration des colonies de levures permettant la coupe pour la microscopie optique et électronique. Ce protocole permet la détermination de la distribution de cellules et les cellules sporulées pseudohyphal au sein des colonies fournissant un nouvel outil pour comprendre l'organisation de types de cellules dans une communauté fongiques.
Abstract
Modélisation des différents types de cellules dans des embryons est un mécanisme clé dans le développement des métazoaires. Communautés de microorganismes, comme les colonies et les biofilms également afficher les modèles de types cellulaires. Par exemple, dans la levure S. cerevisiae, les cellules et les cellules sporulées pseudohyphal ne sont pas réparties uniformément dans les colonies. L'importance fonctionnelle de la structuration et les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ces tendances sont encore mal compris.
Un défi à l'égard de schémas de enquêter types de cellules dans les colonies fongiques, c'est que contrairement au tissu métazoaires, les cellules en colonies sont relativement faiblement attaché à un autre. En particulier, colonies de champignons ne contiennent pas le même niveau complète de la matrice extracellulaire dans la plupart des tissus. Nous rapportons ici une méthode pour intégrer et de sectionnement des colonies de levures qui révèle les habitudes intérieures de types de cellules dans ces colonies. La méthode peut être utilisée pour préparer des coupes épaisses (0,5 μ) utiles pour la microscopie optique et lames minces (0,1 μ) adapté à la microscopie électronique à transmission. Cellules asques et pseudohyphal peuvent être facilement distingués des cellules de levure ovoïde par microscopie optique, tandis que la structure intérieure de ces cellules peuvent être visualisées par EM.
La méthode est basée sur les colonies environnantes avec de l'agar, les infiltrer avec des moyennes de Spurr, puis sectionner. Colonies avec un diamètre de l'ordre de 1-2 mm sont adaptés à ce protocole. En plus de visualiser l'intérieur des colonies, la méthode permet la visualisation de la région de la colonie qui envahit la gélose sous-jacente.
Protocol
1. Isolement des colonies et de fixation
- Incuber 300 colonies sur milieu gélosé pendant le temps indiqué (une colonie isolée devrait être de 1-2 mm de diamètre).
- Retirez la colonie (face) et moyennes sous-jacentes à l'aide d'une spatule étroite.
- Placez quelques gouttes d'agar à 2% 42 ° C sur une lame de microscope en utilisant 1 ml Pipetman pointe et la colonie place immédiatement sur le visage d'agar-vous avant qu'il se solidifie.
- Placez quelques gouttes d'agar à 2% 42 ° C sur la colonie et laisser se solidifier.
- Portez des gants pour toutes les étapes jusqu'à la fin de ce protocole
- Bloc de Trim avec lame de rasoir et les placer dans un borosilicate 3,5 mL à bouchon à vis flacon contenant 2% de paraformaldéhyde / fixateur glutaraldéhyde à 2% pendant 7 jours à 4 ° C.
2. Lavages et traitements Osmium
- Après environ 1 semaine, se laver les blocs de glace sous le agar chimiques hotte en incubant à deux reprises pendant 15 minutes avec assez de cacodylate de sodium 0,15 M (pH 7,2) pour couvrir complètement la colonie (environ 1,5 mL) puis deux fois plus pendant 5 minutes avec le même volume de 1X OS tampon (100 mM KH 2 PO 4 10 mM MgCl 2, pH 6,0).
- Ajouter le même volume de 1% OsO 4 [2 mL OsO 4 (2%) + 2 ml de tampon 2x OS] pour flacons (sur glace) pour couvrir les blocs de gélose sous hotte pendant 1 heure puis laver deux fois avec la même quantité de 1X OS tampon pour 10 minutes chacune.
- Laisser les flacons nuit à 4 ° C en 1X OS tampon.
- Fixateur et tous les lavages dans cette étape sont éliminés comme des déchets dangereux. Toutes les pipettes contenant OsO 4 ont été rincées 3X avec l'huile végétale.
3. Lavez et déshydratation
- Le lendemain matin, lavez les blocs de gélose deux fois sur la glace avec le même volume que ci-dessus de l'eau froide pendant 10 minutes chacun utilisant une pipette Pasteur.
- Laver séquentiellement avec le même volume de 25%, 50%, 75%, 95% d'éthanol pour 10 minutes chacune suivie de 2 lavages avec de l'éthanol à 100% pendant 10 minutes. Laisser une nuit à 4 ° C dans de l'éthanol à 100%.
- Tous les lavages dans cette étape sont éliminés comme des déchets dangereux.
4. Préparation de Spurr
- Le matin suivant (le plus tôt possible) soupeser les solutions suivantes (EM Sciences) dans un bécher en plastique jetables sous une hotte à préparer le réactif de Spurr. Pour tous les travaux ultérieurs utilisant ce réactif, continuer à utiliser une hotte.
(ERL 4221 solution à 5 grammes)
(DER 736 solution de 4 grammes)
(Solution NSA 13 grammes) - mélange de ces solutions (lentement) pendant 20 minutes dans le capot à l'aide d'un barreau
- Ajouter la solution de 0,15 g de DMAE et remuer 20 minutes comme ci-dessus.
- Degas mélange ci-dessus pendant 1-2 heures dans le capot.
5. Spurr Infiltration
- Dès que Spurr est fait laver les blocs de gélose à 5 reprises avec le même volume que ci-dessus de 100 d'éthanol temp% ambiante pendant 10 minutes chacun. Après le lavage à l'éthanol dernière éliminer l'éthanol à l'aide d'une pipette Pasteur afin que l'éthanol restant couvre simplement les blocs de gélose.
- Ajouter environ un montant égal de réactif de Spurr (environ 0,5 ml) et faire tourner la roue de flacons pendant 15 minutes à température ambiante, puis laisser reposer pendant 30 minutes. Après 30 minutes retirer la solution complète à l'aide d'une pipette Pasteur, ajouter Spurr pour couvrir bloc de gélose (environ 1,5 mL), tourner sur la roue flacons pendant 15 minutes à température ambiante et laisser reposer pendant 30 minutes. Répétez le remplacement du Spurr, la rotation et d'incubation encore 3 fois.
- Après les 30 dernières minutes, retirez réactif Spurr et ajouter frais de Spurr pour couvrir les blocs. Autoriser les blocs de gélose, pour s'établir à température ambiante pendant 4 heures.
- Remplacer les années Spurr et tourner toute la nuit.
- Dans la matinée, remplacez Spurr et laisser tourner jusqu'à ce que le jour suivant.
- Le lendemain matin Spurr lieu dans des moules en silicone numérotés (Fisher Scientific), juste pour couvrir le fond des moules, puis ajouter des blocs de gélose pour les moules. Incuber à 60 ° C pendant 4 heures
- Après 4 heures, couronner les moules, avec plus de Spurr et incuber à 60 ° C pendant la nuit.
- Si après avoir enlevé les blocs à partir de moules, les blocs sont encore légèrement flexible, le retour aux moules et laisser incuber 2 jours supplémentaires
6. Sectionnement
- Un microtome Ultracut Leica S a été utilisée pour couper des sections 0.5 μ d'épaisseur pour la microscopie optique et 0,1 μ lames minces pour EM transmission.
- Pour la microscopie optique, que les sections ont été coupés, ils ont été placés sur une goutte de dH 2 O, et séché sur un bloc de 52 ° C chaleur. Sections séchées ont ensuite été colorées avec une baisse de 1,0% de bleu de toluidine, borate de sodium à 1% pendant 5-15 secondes. Après coloration, les sections ont été immédiatement lavées sous un jet d'eau, séché, couvert par les médias de montage (KPL), et une lamelle scellés sur l'échantillon.
La grande pertinence de mesurer la formation de modèles dans la levure et autres micro-organismes ont été examinées précédemment 1. On notera en particulier la fonctionnalité accrue des colonies microbiennes organisées par rapport à des communautés désorganisé.
La méthode décrite est une modification d'une méthode pour intégrer de plus grandes colonies spécialisée 2, et une courte description de nos modifications a été publiée 3.
Un exemple de la microscopie optique d'une section à travers le centre d'une colonie de sauvages S. colonie de levures cerevisiae est montré dans la figure 1. Asques, pseudohyphae et la levure ovoïde sont facilement identifiables, et dans la région de la colonie envahir la gélose sous-jacente est également manifeste.
Un exemple d'un microscope électronique d'une souche de laboratoire de la levure (W303 de fond) est montré dans la figure 2. L'image est d'une région de la colonie contenant une fréquence élevée de cellules sporulées.
Figure 1. Microscopie optique d'une colonie de levures sauvages. Cette levure (YPS133) a été isolé récemment de 4 exsudats d'arbres. La colonie a été incubée pendant 6 jours sur YNA moyenne 5 avant la coupe. Flèches indiquent Ouvrez représentant asques, les flèches indiquent remplis représentant ovoïde cellules végétatives, pointes de flèches pleins indiquent des chaînes de cellules allongées (pseudohyphes) et asques.
Figure 2. Microscopie électronique d'une souche de levure de laboratoire. La colonie de SH1020 (W303 fond) a été incubée pendant 6 jours sur milieu YNA avant la coupe 3. L'image montre une région de la section avec une fréquence élevée des asques. Une flèche indique la structure bi-couche du mur de spores.
Figure 3. Quantification de la distribution des cellules sporulées dans les colonies: A) une grille contenant 15 rectangles adjacents empilés le long de leur côté le plus long est superposée à la région centrale de l'image d'une section colonie. La grille est mise à l'échelle, tout en gardant ses proportions constantes, pour ne couvre que le haut et le bas de la colonie. (B & C) La fraction de cellules sporulées dans chaque rectangle par rapport aux cellules totales dans ce rectangle est déterminée par inspection visuelle des images à partir de 4 jours anciens (B) et de 8 jours anciens (C) des colonies. Par exemple, le rectangle en haut de la colonie («1») correspond à la partie gauche du graphique. Moyenne de 4 colonies est montré; les barres d'erreur d'affichage du MST. erreur.
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Discussion
La méthode présentée révèle les structures internes des colonies. Parce que la méthode est efficace pour déterminer les schémas de types de cellule dans une plage de S. souches cerevisiae avec des morphologies différentes colonies, et aussi dans une espèce apparentée S. paradoxus 5, la méthode est également susceptible de travailler sur un large éventail de champignons et autres micro-organismes.
Une étape cruciale pour le succès de la méthode est de s'assurer que toute la colonie, y compris le haut de la colonie, est enfermé dans l'agar dans le protocole. Que les colonies sont entièrement revêtus de l'agar-agar peut être déterminé après sectionnement pour la microscopie optique et coloration au bleu de toluidine. Lorsque les coupes colorées sont vus en microscopie optique, le milieu gélosé est taché légèrement plus foncée que le milieu d'inclusion. Parce rétrécit agar pendant les étapes de déshydratations, afin de récupérer toute la colonie veillez à: 1) ajouter 4-5 gouttes d'agar de façon fiable la couverture de la colonie à l'étape 1.2, et 2) garniture de la gélose que sur les côtés, non pas sur haut et en bas, et seulement assez de garniture pour lui permettre de s'insérer dans des moules à l'étape 1.5.
Une deuxième étape du protocole qui est essentiel pour les sections optimales implique la dureté du bloc d'intégrer à moyen terme. Typiquement blocs sont examinés après une nuit d'incubation, en les retirant des moules. Si les blocs sont encore flexibles quand ont eu lieu entre les deux mains et fléchis, ils ne sont probablement pas assez dur pour le sectionnement. Dans ce cas, ils sont retournés à l'incubateur à la même température pendant 48 heures supplémentaires et retesté comme ci-dessus.
L'importance d'être capable de détecter des modèles de types de cellules au sein des colonies microbiennes, c'est que ces modèles reflètent probablement une organisation fonctionnelle des cellules dans les communautés. En effet, la structuration microbienne peuvent refléter des mécanismes anciens et fondamentaux par lesquels les organismes de la même espèce d'interagir. Avec des méthodes de contrôle de la configuration d'expression génique dans des colonies de 3,6, la capacité à détecter les tendances de la différenciation cellulaire dans ces communautés peut aider à tester les mécanismes potentiels de formation de structures microbiennes.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
La recherche a été financée par le NIH 1R15GM094770.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | |
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | |
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA |
| 2-Dimethyl amin–thanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE |
| Mounting media | KPL Inc | 71-00-16 | |
| Rotating wheel | Ted Pella, Inc. | Pelco 1055 | |
| Microtome | Leica Microsystems | Ultracut S |
References
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