Summary
치아 표면에 형성 Biofilms는 매우 복잡하고 그들의 아키텍처를 조절 상수 타고난 및 외인성 환경 문제, 생리 및 transcriptome에 노출되어 있습니다. 우리는 조성, 구조 조직 및 biofilm 연구의 다른 분야에 적용할 수 있습니다 경구 biofilms의 유전자 발현을 검사하는 도구 상자를 개발했습니다.
Abstract
Biofilms 변수 밀도 및 구성 1, 2의 세포외 매트릭스에 enmeshed 미생물 세포의 높은 동적 조직 및 구조 커뮤니티입니다. 일반적으로, biofilms는 세포 클러스터 (또는 microcolonies)과 복잡한 세포외 기질에서 발생하는 microcolonies의 발전과 안정의 형성에 의해 다음 표면에 초기 미생물의 첨부 파일에서 개발할 수 있습니다. biofilm의 매트릭스 하버 exopolysaccharides (EPS) 및 치과 biofilms의 대부분도 예외 없다, 특히 대부분의 mutans streptococci 3 중재 아르 카리 에스 질환과 관련된 사람. EPS는 등 주로 기판 3으로 자당을 사용 glucosyltransferases 같은 세포외 효소의 방법으로 미생물 (S. mutans의, 핵심적인 기여)에 의해 합성됩니다.
치아 표면에 형성 biofilms의 연구 특히 구강에서 발생하는 복잡한 식단 - 호스트 미생물 상호 작용과 관련된 환경 문제들의 지속적인 노출 때문에 도전하고 있습니다. 이러한 복잡한 상호 작용에 대한 응답으로 구조 조직과 모체의 조성, 생리학 및 transcriptome / biofilm - 세포의 프로테옴 프로파일의 역동적인 변화의 이해는 더 이상 구두 biofilms가 pathogenicity을 조절하는 방법의 현재 지식을 사전 것입니다. 따라서, 우리는 데이터 분석에 대한 사용자 정의 - 만든 소프트웨어를 사용하여 일반적으로 쉽게 구할 수 있고, 새로운 기술을 결합하여, 구조 생화학 및 분자 수준에서 biofilm 분석을 촉진하는 도구 박스 분석을 개발했습니다. 표준 분석 (colorimetric assays, RT - qPCR 및 microarrays)과 소설 형광 기법 (박테리아와 EPS의 동시 라벨)을 경구 biofilm 연구의 복잡한 성격을 해결하기 위해 데이터 분석을위한 특정 소프트웨어와 통합되었습니다.
공구 상자 4 별개지만, 서로 단계 (그림 1)으로 구성되어 있습니다 : 1) Bioassays, 2) 원시 데이터 입력, 3) 데이터 처리, 4) 데이터 분석. 우리는 공구 상자의 유용 성과 유연성을 입증하기 위해 체외 biofilm 모델과 구체적인 실험 조건에서 우리를 사용합니다. biofilm 모델은 간단하고 재현성 및 여러됩니다 것은 하나의 실험의 복제는 동시에 4 5을 수행할 수 있습니다. 또한, 그것은 수 있도록 시간적 평가, 각종 미생물 종의 포함 5 별개의 실험 조건의 영향 평가 (예 : 트리 트먼트 6, 녹아웃의 돌연변이의 비교 대 부모의 변형 5; 탄수화물 가능한 7). 여기, 우리는 microarray 데이터 마이닝 / 조직 (MDV)과 형광 이미징 분석 (DUOSTAT)에 대한 새로운 소프트웨어 (I)를 포함하여 공구 상자를 두 가지 특정 구성 요소를 설명하고, (2) EPS - 라벨 원위치 인치 우리는 또한 공구 상자가 biofilms 분석, 데이터 구성, 통합 및 해석 도와 수있는 방법을 보여주는 실험 사례를 제공합니다.
Protocol
1. 1 단계 - BIOASSAYS
biofilm 방법은 치아의 대리로서 히드록 시아파 타이트의 디스크 (HA)를 사용 (클락슨 크로마 토그래피 제품, 주식 회사, 사우스 윌리엄스 포트, PA, 미국; 면적 = 2.7 ± 0.2 cm 2) 타액과 코팅 (얻은 박막의 존재를 흉내낸), 배치 수직 위치 4, 5, 8인치
- 생화학 Assays.
- biofilms는 sonication 9 균질은 (i) 있거나 (2) 생화학 assays 8 그대로 유지. 균질 biofilms 서스펜션은 총 무기 단백질, 그리고 세포와 세포 다당류 구성 / 콘텐츠 (레모스 외의 내용을 보시려면 여기를 클릭하세요., 구강 Biofilms 8 생리학을 공부하는 프로토콜.)는 (드라이 무게) 바이오 매스의 결정에 사용될 수 있습니다 그대로 biofilms 표준 glycolytic 산도 드롭, 산 - 살인, 양자의 투자율과 F - ATPase 활동 assays을 (레모스 외의 내용을 보시려면 여기를 클릭하세요., 구강 Biofilms 8 생리학을 공부 프로토콜)를 사용하여 자신의 생리적 반응에 대한 분석을하실 수 있습니다.
- Transcriptome 분석.
- 표준 cDNA microarray 및 RT - qPCR 프로토콜 (예 : http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html)가 특정 병원균 (예 : S. mutans의)의 transcriptome 응답의 결정에 대해 조합에서 사용할 수 있습니다 다양한 발달 단계 6, 7, 10, 11에서 다양한 환경 및 치료 도전 biofilms 이내. RNA 품질 (때문에 biofilm의 인구 및 EPS 매트릭스의 존재의 이기종 자연), 2) 데이터 마이닝 및 해석 (에 의한 1) : 도구 상자에서, 우리는 치과 biofilms의 transcriptome 분석을 위해 중요한 두 가지 방법을 포함 대용량 데이터)는 microarray에 의해 생성된 설정합니다.
- RNA 격리. biofilms에서 추출한 RNA의 품질 문제를 해결하기 위해, 우리는 EPS 풍부한 매트릭스 12 일 (http://dx.doi.org/10.1016/j에 enmeshed 박테리아 세포로부터 RNA 분리와 정화를 위해 특별히 개발된 최적화된 프로토콜을 사용 . ab.2007.03.021). 이 프로토콜은 RT - qPCR 및 Microarrays (예제, 6, 11 참조)를 사용하여 transcriptome 분석을위한 최적의 것으로 간주됩니다 8.5보다 높은 RNA 무결성 번호 (RIN) 제공합니다.
- 표준 cDNA microarray 및 RT - qPCR 프로토콜 (예 : http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html)가 특정 병원균 (예 : S. mutans의)의 transcriptome 응답의 결정에 대해 조합에서 사용할 수 있습니다 다양한 발달 단계 6, 7, 10, 11에서 다양한 환경 및 치료 도전 biofilms 이내. RNA 품질 (때문에 biofilm의 인구 및 EPS 매트릭스의 존재의 이기종 자연), 2) 데이터 마이닝 및 해석 (에 의한 1) : 도구 상자에서, 우리는 치과 biofilms의 transcriptome 분석을 위해 중요한 두 가지 방법을 포함 대용량 데이터)는 microarray에 의해 생성된 설정합니다.
- 이미징 형광. biofilms의 구조 조직입니다.
- 문학에서 사용할 수있는 공촛점 형광 이미징 프로토콜의 대부분은 미생물의 라벨에 중점을 둡니다. biofilm의 주요 구성 요소로서 EPS의 분석은 크게 몇 가지 예외가 5, 13, 14, 형광 이미징을 포함한 구강 biofilm 연구에서 무시되었습니다. 우리는 새로운 라벨 기술과 재현성 시각화 동시에 그대로 biofilms 이내 EPS 및 세균성 세포 부량위한 특정 소프트웨어를 개발했습니다. COMSTAT (http://www.imageanalysis.dk에서 사용할 수 있음) 및 DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk)가 제공하는 동안 Amira 5 (비세 이미징 GmbH를, 베를린, 독일), biofilms의 3D 재건에 사용됩니다 정량 분석.
- biofilms의 EPS - 박테리아의 구조 조직의 이미징. 알렉사 플루어 647 - 분류 dextran 공액은 EPS 매트릭스를 시각화하는 데 사용됩니다. 형광 - 라벨 dextran은 glucosyltransferases - Gtfs 구균에 대한 입문서 (특히 GtfB 및 GtfC) 역할을하고, 동시에 biofilm 개발 11 과정을 통해 exopolysaccharide 매트릭스 합성 중에 포함될 수 있습니다.
EPS 분류 :- "Biofilm 준비"프로토콜 8 다음 1H에 대한 필터 살균 타액과 함께 코트를 히드록 시아파 타이트 디스크.
- 피펫 2.8 24 잘 접시의 각 잘 문화 매체의 ML, 그리고 어두운 방에 가져다.
- 문화 매체에 dextran 복합 알렉사 플루어 1 μm의 추가, 최대 pipetting하여 문화 매체에 염료를 섞어 아래로 (약 10 배).
- 침 - 코팅 HA (SHA) 디스크 (1 H 보육 후) 두 번 살균 AB의 버퍼를 찍어 - 세척 및 dextran 복합 알렉사 플루어를 포함하는 매체에서 그들을 놓으십시오.
- 37 알루미늄 호일과 부화로 판 ° C 5 % CO 2를 커버. 배양 시간의 기간은 각각의 실험 설계에 따라 달라집니다. 찬란 표시 dextran은이 사용되는 농도에서 박테리아 세포를 얼룩하지 않습니다11 말한다. 등 Calcofluor 14 같은 다른 EPS - 얼룩 기술은, 조합에서 사용할 수 있습니다.
- 박테리아 라벨 :
- biofilms의 박테리아의 구성 요소가 얼룩 표준 형광 핵산 (예 : SYTO 9)를 사용하여 biofilm 형성의 끝에 표시되며 다른 형광 기법을하는 것은 (예를 들어 종의 특정 형광 라벨이 표시된 항체 15 GFP - 표현 세포를 16) 물론 사용할 수 있습니다 biofilms에서 하나 이상의 박테리아 종을 감지. 그림 2는 24 - H 오래된 S.의 3D 이미지를 동시 EPS의 라벨 (적색) 및 박테리아 / microcolonies (녹색)을 보여줍니다 mutans의 biofilm은 SHA 디스크의 표면에 형성.
- 이미지 수집 : 각 biofilm가 5-10 무작위로 선택된 위치에서 스캔하고, Z 시리즈는 표준 프로토콜을 사용 공촛점 현미경을 스캐닝 레이저하여 이러한 위치의 각 광학 sectioning에 의해 생성됩니다. 우리는 올림푸스 FV 1000 두 광자 X10을 갖춘 현미경 (올림푸스, 도쿄, 일본)를 사용 (; 수치 구경 0.45, 칼 자이스 혈구 거리를 3~4mm 작업) 물 또는 x25 (;, NA 1.05 WD 2mm 올림푸스 LPlan N)을 침지 목표. 여기 파장 810 nm의이며, 알렉사 플루어 647 (EPS)에 대한 필터가 HQ655/40M-2P 필터 동안 SYTO 9 방출 파장 필터 (박테리아), 540분의 495 OlyMPFC1 필터입니다. 저장하고 원시 이미지를 저장합니다.
- biofilms의 EPS - 박테리아의 구조 조직의 이미징. 알렉사 플루어 647 - 분류 dextran 공액은 EPS 매트릭스를 시각화하는 데 사용됩니다. 형광 - 라벨 dextran은 glucosyltransferases - Gtfs 구균에 대한 입문서 (특히 GtfB 및 GtfC) 역할을하고, 동시에 biofilm 개발 11 과정을 통해 exopolysaccharide 매트릭스 합성 중에 포함될 수 있습니다.
- 문학에서 사용할 수있는 공촛점 형광 이미징 프로토콜의 대부분은 미생물의 라벨에 중점을 둡니다. biofilm의 주요 구성 요소로서 EPS의 분석은 크게 몇 가지 예외가 5, 13, 14, 형광 이미징을 포함한 구강 biofilm 연구에서 무시되었습니다. 우리는 새로운 라벨 기술과 재현성 시각화 동시에 그대로 biofilms 이내 EPS 및 세균성 세포 부량위한 특정 소프트웨어를 개발했습니다. COMSTAT (http://www.imageanalysis.dk에서 사용할 수 있음) 및 DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk)가 제공하는 동안 Amira 5 (비세 이미징 GmbH를, 베를린, 독일), biofilms의 3D 재건에 사용됩니다 정량 분석.
2. 2 단계 - RAW 데이터 입력
직접 원시 데이터 파일에 생화학 및 RT - qPCR assays (RDF - MS Excel 파일)에서 입력 원시 데이터입니다. microarrays 데이터에 대해, JCVI Spotfinder (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) 또는 이와 유사한 소프트웨어에 스캔한 슬라이드 단일 채널 이미지를로드합니다. JCVI 사양하고 수동으로 격자 내의 모든 장소에 맞게 조정에 따라 자리 격자를 만듭니다. 각 지점의 강도 값을 측정하고 ". mev"파일에 저장하고 "원시 Microarray 데이터"에 저장됩니다.
3. 3 단계 - 데이터 처리
통계 분석을 위해 RDF에 원시 데이터를 (생화학 및 RT - qPCR) 구성합니다. "데이터 처리 파일"(- MS Excel 파일 DPF)에 그들을 전송합니다. microarray 및 형광 이미징 분석을 위해, 특정 소프트웨어 (현재 사용 가능하며 맞춤 제작)는 데이터를 처리하는 데 사용됩니다.
- Microarray 데이터 :
- 특정 소프트웨어를 사용하여 데이터 정규화 단계를 2 단계 ( "원시 Microarrays 데이터"에 저장)에 생성된 원시 데이터를 제출한다. JCVI microarray 데이터 분석 소프트웨어 마이다스 (http://www.tm4.org/midas.html)를 사용하여 데이터를 정상화. 인 - 슬라이드 복제 분석에 의해 다음, 기본 설정 LOWESS 및 표준 편차 regularization을 사용합니다. 정규화된 데이터를 포함하는 파일을 저장합니다. 이 단계 (원시 데이터 파일 및 정규화된 데이터 파일 준비)에서 공개 Access 데이터베이스 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo에서 예 NCBI 유전자 표현 옴니버스 (GEO) 데이터베이스)에 보증금 microarray 데이터 그리고 나중에 참조할 수 있도록 가입 번호를 기록합니다.
- 형광 영상 자료
- Biofilm 구조 부량.
- biofilms의 각 구조 요소 (EPS 및 세균)에 해당하는 정량 데이터는 COMSTAT와 MATLAB 5.1에서 스크립트로 작성되었습니다 새로 개발된 DUOSTAT에 의해 계산됩니다. 원시 형광 이미지는 소프트웨어에 업로드 다음과 같이 분석됩니다
- 바이오 매스, 두께, 층 분포 및 계량 및 biofilms의 tridimensional 구조 (http://www.imageanalysis.dk에서 설명서를 참조) 특징 다른 매개 변수를 계산하기 위해 COMSTAT를 사용합니다.
- 이러한 EPS 및 세균 (또는 다른 미생물 종 및 / 또는 세포 구성 요소)과 같이 두 개의 biofilm 구성 요소의 공동 현지화을 계산 DUOSTAT을 사용
- MATLAB 5.1 DUOSTAT의 경로, 두 biofilm 구성 요소의 이미지를 포함 열고 이미지 폴더를 설정합니다.
- 상관 및 분석 될 두 개 채널을 선택합니다. 두 이미지 스택은 또한 세 가지 차원에서 동일한 픽셀 크기 (X, Y, Z), 각 스택의 이미지 같은 번호가 있어야합니다.
- 사람에 따라 각 채널에 대해 임계값을 설정COMSTAT의, 무슨. 소프트웨어 작업 인터페이스 (; http://www.imageanalysis.dk에서 DUOSTAT 매뉴얼 동영상 문서를 참조)의 지시 사항을 따르십시오. 입력 DPF로 얻은 데이터를. 그림 4.4 예제를 참조하십시오.
- 입체 biofilms 재건.
- biofilms의 입체 구조는 Amira를 사용하여 시각입니다. 소프트웨어에 "RAW 이미지 폴더 '에 저장 형광 이미지를 가져오기 및 (http://www.amira.com에서 Amira 설명서를 참조 biofilms의 구성 요소 각각의 3 차원 렌더링을 만들 수 voltex 및 ISO - 표면 렌더링을 사용하여 / 문서 / 매뉴얼 및 릴리스 - notes.html). 그림 4.4에 대한 예제를 참조하십시오.
- biofilms의 각 구조 요소 (EPS 및 세균)에 해당하는 정량 데이터는 COMSTAT와 MATLAB 5.1에서 스크립트로 작성되었습니다 새로 개발된 DUOSTAT에 의해 계산됩니다. 원시 형광 이미지는 소프트웨어에 업로드 다음과 같이 분석됩니다
- Biofilm 구조 부량.
4. 4 단계 - 데이터 분석
DPF의 생화학, RT - qPCR 및 COMSTAT - DUOSTAT의 assays에서 양적 데이터는 통계 분석을 위해 준비가되어 있습니다. 통계 분석을 수행 후, 그래프 및 / 또는 테이블 ( "대표 결과"섹션을 참조) 구축하실 수 있습니다.
1. 소프트웨어 Microarray 데이터 Visualizer (MDV)를 사용 Microarray 데이터 조직입니다.
microarrays 여러 실험 조건을 사용하면 복잡하고 큰 데이터의 출력으로 인해 세트, 우리는 (http://www.oralgen.lanl.gov/에서 가능) Microarray 데이터 Visualizer (MDV) 7이라는 데이터 마이닝과 조직 소프트웨어를 설계 .
클래스에 대한 예측 0.001의 컷오프 P 값과 클래스 비교 BRB - ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html)를 사용하여 통계 분석을 수행 후 생성된 데이터를 제출하실 수 있습니다 MDV하기 위해 다음과 :
- Excel을 사용하여, MDV 탭으로 구분된 텍스트 파일에 BRB 데이터를 변환합니다. 진 로커스 태그 번호와 함께 모든 문자를 제거합니다, 예를 들면 다음과 같습니다 SMU.1423c는 "C"문자를 삭제합니다.
- MDV를 엽니다. 파일 이동, 그리고 "해설 소스를 선택합니다"를 선택하십시오. "플랫 파일"을 선택하십시오. 대화 상자가 나타 때, 유전자 이름, 유전자 온톨로지 (GO) 번호, 경로 및 기능 분류 데이터에 대한 주석 포함하는 파일을 선택할 수있는 찾아보기 버튼을 사용합니다.
- 파일 이동 및 항목 1 일부터 각 파일을 가져옵니다. 파일의 각 분석을 위해 실험 조건을 나타냅니다. 여러 조건이 분석을 위해, 예를 들어이있다면 두 개의 트리 트먼트 (치료 1, 2) 및 제어 (차량) 항목을 4로 이동합니다.
- 이 경우에는 가능한 비교는 다음과 같습니다 (A) 치료 1 대 제어 (치료 1 인한 differentially 표현 유전자에 대한), (B) 치료 2 대 제어하며, (C) 치료 1 대 치료 2. 작업 가설에 따라 유전자의 다른 세트를 선택할 수 있습니다.
- 비교 differentially 표현에만 유전자를 선택 (고유 유전자는 치료 1 영향). 이 경우에는 설정 기능 메뉴에서 빼기 기능을 사용하십시오. 에서 비교 B의 유전자를 빼기, 그리고 결과를 저장합니다. 그런 다음 결과 데이터에서 C를 뺍니다. 동일한 작업은 B에서만 유전자 (단 치료 2 영향을받는 독특한 유전자)를 얻기 위해서 할 수 있습니다.
- A와 B 모두에서 검출에만 유전자를 선택하려면, 비교 A와 B에 대한 결과를 결합하고, 결과를 저장하는 설정 기능 메뉴에서 연방 기능을 사용하십시오. 그런 다음 결과 데이터에서 C를 뺍니다.
- 이러한 행동은 더 직관적이다 MDV에 특색 벤 다이어그램을 사용하여 시각 수 있으며, 가설 기반 데이터 조직을 용이하게하실 수 있습니다. 벤 다이어그램의 데이터 출력 (그림 3 및 비디오 문서에 나와있는 화면보기 참조) 화면에 표시됩니다.
- 탭으로 구분된 텍스트 파일에 데이터를 저장하려면, 파일 이동 및 내보내기를 선택합니다.
- 탭으로 구분된 텍스트 파일을 내보냅니다. 그들 Excel을 사용하여 열고 그래픽 디스플레이로 위장 테이블 및 / 또는 MDV에서 데이터 출력을 (그림 4.2, 4.3 및 비디오 문서를 참조) 정리.
5. 대표 결과
여기서 우리는 분석 도구 박스가 여러 변수와 실험 조건 biofilm 연구의 다양한 assays을 통합하는 방법의 예를 제공합니다.
실험 경우 :
biofilm 개발 7 중 녹말과 자당에 대한 응답으로 transcriptome 연쇄상 구균의 mutans의 역학.
배경 :
호스트 타액 아밀라아제와 구균 glucosyltransferases과식이 녹말과 자당의 상호 작용 S.의 형성과 독성을 강화 수 incre로 biofilms 이내 mutansexopolysaccharides 합성, 설탕 대사와 acidogenicity 11 asing. 이 복잡한 호스트 병원체 - 다이어트 상호 작용은 치과 카리 에스 질병에 관련된 병원성 biofilms의 형성을 조절 수도 있습니다. 우리는 더 S.하는 방법을 이해하는 포괄적인 생화학과 transcriptomic 분석 (전체 게놈 프로 파일링 포함) 실시 mutans는 아밀라아제 7 면전에서 biofilm 개발의 별개의 단계에 녹말과 자당에 응답합니다.
분석 도구 박스는 다양한 실험 조건과 시간에 따라 포인트 형성 biofilms의 생화학 및 분자 assays 통합으로 우리를 돕기 위해 사용되었습니다. 분석 도구 - 상자를 사용하여 전체 데이터 출력은 그림 4에서 순차적 방식 (4.1-4.4)에서 제공됩니다. 여기의 주요 초점은 도구 박스의 유틸리티보다는 데이터 해석과 토론을 입증하는 것입니다 주목할만한 것입니다.
- 추가 microarrays 분석을위한 실험 조건을 선택 생화학 및 RT - qPCR assays를 결합. 처음에, 우리는 S.으로 biofilms 개발을위한 탄수화물의 최적 농도를 선택합니다 6 독특한 자당 5 가지 녹말과 자당의 조합을 테스트 우리의 시험 관내 모델을 사용 mutans. biofilms에 불용성 exopolysaccharides의 (높은) 금액과 gtfB의 (강화된) 표현 (불용성 글루칸 합성에 대한 책임)에 따라 세 특정 농도를 (그림 4.1 강조 표시) 선택으로 우리를 안내 bioassays에서 동시에 데이터 출력을 검사하는 기능 .
- Microarray 분석.식이 탄수화물의 선택 (세명) 농도가 biofilms를 형성하는 데 사용되었다, biofilms 개발 프로세스의 다양한 단계를 반영하는 구체적인 시간 지점에서 제거되었습니다. biofilms (3 실험 그룹과 4 시간 지점에서 나눈 값) BRB - 배열 도구 및 MDV로 전체 게놈 프로 파일링 (cDNA microarrays)를 결합하여 transcriptome 분석의 대상이되었다.
RNA가 추출 및 biofilm 특정 프로토콜 12을 사용하여 정제, 다음 분석 도구 박스의 4 단계 프로세스를 통해 분석을 microarray를 받게되었다. MDV는 자당과 녹말 조합 S.의 향상된 독성 (cariogenic 가능성)과 관련된 구체적인 transcriptional 응답을 트리거 우리의 작업 가설에 따라 관심의 유전자를 선택하는 데 도움 방법은 그림 4.2 설명 biofilms 이내 mutans. BRB - ArrayTools (그림 4.2a)에 의해 생성되는 원시 데이터는 MDV는 벤 다이어그램 (그림 4.2b)를 사용하여 처리되었습니다. 본 연구에서는, 우리의 가설에 관련된 유전자의 그룹 differentially 비교 표현들이다 (0.5 % 자당 + 1 % 전분 대 1 % 자당)와 B (0.5 % 자당 + 1 % 전분 대 0.5 % 자당), 하지만 비교 C의 유전자 (0.5 % 자당 대 1 % 자당) (그림 4.2a 및 4.2b). 그림 4.2c에 나타난 MDV 크게 분석하는 유전자의 총 수를 감소함과 동시에 직접 조합 자당과 녹말의 영향으로 관련이없는 유전자 필터링 아웃. MDV 데이터 출력도 전분에 differentially 표현 유전자 각각의 기능을 클래스 (최대 - 아래 - 규제)에 의해 조직 데이터를 보여주는 그래픽 디스플레이로 변환 + 자당 - biofilms (대 자당 - 성장 biofilms) 각 4 시간 점 (그림 4.3). MDV 소프트웨어는 사용자 친화적이고 대규모 복잡한 데이터 마이닝 / 조직 우리 microarray 실험에서 세트를 촉진합니다. - . 참고; Biofilm 이미징 Concomitantly, biofilms의 구조적 조직 COMSTAT - DUOSTAT - Amira를 사용하여 분석 되었음 (전분의 3D 재건과 정량 분석의 예제를 참조하십시오 + 그림 4.4 자당 - 재배 biofilm 도구 박스에 포함되어 동영상 기사). 형태, 유통 및 EPS와 microcolonies의 구조 관계 Amira하여 3D 표면 렌더링을 사용하여 시각하실 수 있습니다. 선택 영역의 클로즈업 전망은 microscale에서 박테리아 - EPS 특정 구조 관계 (그림 4.4) 설명하는, 생성할 수 있습니다. 또한, 공촛점 이미지의 동일한 세트는 바이오 매스 / microcolony 측정, 세균 세포와 동시에 EPS의 공간적 분포와 colocalization에 대한 COMSTAT - DUOSTAT하여 처리할 수 있습니다. 예를 들어, 디스크 표면에서 유체 상에 EPS와 세균의 수직 분포는 COMSTAT - DUOSTAT 사용하는 3 차원 공촛점 biofilm 이미지의 각 광학 부분에서 계산 (그림 4.4 그래프를,. 비디오 기사를 참조). 데이터는 biofilms 깊이를 통해 박테리아 (녹색 라인)보다 EPS 높은 비율 (레드 린)를 보여줍니다. 또한 세균성 세포의 대부분은 특히 biofilm의 중앙과 바깥쪽 레이어에서 EPS (블루 린)과 연결되어 있습니다. 이 관측은 녹말과 자당의 성장 biofilms가 exopolymers 특히 풍부 나타냅니다, 이것은 (enmeshing 아르세균성 세포의) 대부분 가까이 접촉, 이러한 구조 조직은 biofilms 13 안정성과 cohesiveness을 향상시킵니다. 3 차원 렌더링 및 공촛점 이미지의 양적 측정 (전분의 S.의 mutans + 자당 - 성장 biofilms로 GtfB 유형 불용성 - 글루칸 합성 증가) 생화학 및 유전자 표현 데이터를 보완 biofilm의 구조에 대한 추가 정보를 제공합니다 (추가 예제 5 참조를 위해, 6, 11, 13).
분석 도구 - 박스는 어떻게 S.의 포괄적인 분석을 제공 다른 bioassays에서 데이터를 얻을 정리하고 통합하는 우리를 지원 mutans가 (..; 클라인 외 2010 년 7 클라인 외의 내용을 보시려면 여기를 클릭하세요, 2009 11) 구강에서 발견 다이어트 - 호스트 상호 작용의 결과로 복잡한 환경 변화에 대응할 수 있습니다.
그림 1. Biofilm 분석을위한 도구 - 상자 분석의 흐름 차트.
그림 2. Biofilms의 EPS 및 박테리아 공촛점 형광 이미징. EPS (적색)과 세균 / SHA 디스크 표면에 형성 연쇄상 구균의 mutans의 biofilm의 3 차원 렌더링 microcolonies (녹색)의 동시 시각화.
그림 3. Microarray 데이터 마이닝 및 Microarray 데이터 Visualizer (MDV) 소프트웨어를 사용하여 조직입니다. 관심 유전자를 선택하고 유전자 이름과 기능 수준의 주석을 추가하여 다음에 벤 다이어그램 기능을 사용하지 않습니다.
그림 4.1. S.하여 biofilm 형성 평가 생화학 assays (A) 및 RT - qPCR (B)를 사용 mutans. INS (불용성 exopolysaccharides) 데이터 gtfB 표현식의 패턴과 잘 상관 관계, 그리고 biofilms의 바이오 매스와. 0.5 % 자당이 최적의 biofilm 개발을 위해 필요한 최소 농도가 체외 모델에서 우리를 사용했습니다 반면 1 % 자당 최대 INS 형성에 대한 농도, SHA 표면에 gtfB 표현과 biofilm 축적했다. S. 0.5 % 자당의 존재 재배 mutans 세포가 + 1 %의 전분은 가장 높은 바이오 매스를 굴복하고, 향상된 gtfB 표현 (B2)과 상관 기타 biofilms,보다 더 많은 기능을 제공. 이러한 탄수화물의 농도가 더욱 transcriptome 분석을 위해 선택되었다.
그림 4.2. MDV 소프트웨어와 함께 BRB - 배열 도구를 사용하여 Microarray 데이터 분석. A) differentially 각 비교 (A, B 또는 C)와 BRB - 배열 도구를 사용하여 평가 시점의 표현으로 감지 유전자의 개수를 나타냅니다. B) Microarray 데이터 Visualizer (MDV)는 관심의 유전자를 선택 벤 다이어그램을 사용합니다. C) 진스는 MDV 분석에 따라 선택.
그림 4.3. S. mutans의 유전자가 differentially 전분 표현 + 기능 클래스를 주최하는 다양한 시간 지점에서 자당 - biofilms (대 자당 - biofilms). 유전자 주석은 로스 알 라모스 국립 연구소 (www.oralgen.lanl.gov) 또는 동일한 웹 사이트에서 구할 수 출판 문학에서 제공하는 정보를 기반으로합니다.
그림 4.4. 전분의 세 차원 렌더링 COMSTAT - DUOSTAT 분석 + 자당 - biofilm.
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Discussion
이 프레 젠 테이션에서, 우리는 분석 도구 - 박스 (EPS / 세균 이미징 및 microarray 데이터 마이닝 / 처리) 시스템에 통합된 다양한 assays의 다목적 및 유용의 두 중요한 구성 요소를 보여주었다. 분명히, 공구 상자 체외 모델을 사용하여 다양한 실험 조건에 대한 응답으로 biofilms 생화학, 아키텍처 및 유전자 발현의 다양한 측면의 종합적인 (비교) 및 동시 분석을 촉진. 7의 역동적이고 복잡한 변경을 고려 S.에 의해 구조적 조직, 생리학 및 transcriptome 답변 biofilms의 mutans (및 기타 병원균), 통합 분석은 더욱 biofilms이 구강에 pathogenicity를 조절 방법을 이해하기 위해 도움을 줄 수 있습니다. 우리는 현재 우리의 혼합 종 biofilm 모델에서 자세히 복잡한 생태 상호 작용 및 구조 변화를 조사하는 능력을 향상시킬 분석 도구 박스의 종 특정 라벨링 및 metagenomic / metaprotemic 분석을 통합하고 있습니다. 5
(; 진행 등 metaproteome 및 하드 표면 분석) 및 경구 biofilm 연구 이외의 적응 / 어플 리케이션을 위해 수정할 수 있습니다 또한이 도구 (모든 bioassays)는 추가 기능과 유연한 업그레이 드가됩니다. 예를 들어, MDV는 독특한 (돌연변이) 종자의 비교 - transcriptome이나 치료 대리인에 대한 응답으로 여러 실험 조건의 비교를 위해 전체 - 게놈 프로 파일링를 사용하여 다른 biofilm 관련 분야에 특히 도움이 될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
저자 MDV의 발전을 위해 박사 게리 샤오와 허버트 리에게 감사를 표합니다. 우리는 또한 DRS 감사합니다. 시몬 두아르테, 라미 무라타, 재 - Gyu 전, 재클린 Abranches 및 공구 상자의 분석 구성 요소에 대한 자신의 기술과 과학에 대한 기여 미스 스테이시 그레 고아. 이 연구는 치과와 Craniofacial 연구의 국립 연구소에서 USPHS 연구 부여 DE018023에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | |
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | |
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | |
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus Corporation |
References
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