Summary
दांत सतहों पर गठित Biofilms अत्यधिक जटिल और लगातार सहज और exogenous पर्यावरणीय चुनौतियों, जो अपनी वास्तुकला मिलाना फिजियोलॉजी और transcriptome को उजागर कर रहे हैं. हम एक Toolbox विकसित करने के लिए संरचना, संरचनात्मक संगठन और मौखिक biofilms के जीन की अभिव्यक्ति, जो biofilm अनुसंधान के अन्य क्षेत्रों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है की जांच.
Protocol
1. कदम 1 - bioassays
biofilm विधि दांत किराए के रूप में hydroxyapatite की डिस्क (हेक्टेयर) का उपयोग करता है (क्लार्कसन क्रोमैटोग्राफी उत्पाद, Inc, दक्षिण Williamsport, फिलीस्तीनी अथॉरिटी, संयुक्त राज्य अमेरिका, सतह क्षेत्र = 2.7 ± 0.2 2 सेमी) लार के साथ लेपित (अधिग्रहीत पतली झिल्ली की उपस्थिति की नकल उतार), रखा एक ऊर्ध्वाधर स्थिति 4, 5, 8.
- बायोकेमिकल Assays.
- biofilms या तो (i) 9 sonication द्वारा homogenized या (ii) जैव रासायनिक 8 assays के लिए बरकरार रखा है . homogenized biofilms निलंबन बायोमास के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (सूखी वजन), कुल प्रोटीन, अकार्बनिक, और बाह्य और intracellular polysaccharides / संरचना सामग्री (Lemos एट अल में विवरण देखें. ओरल 8 Biofilms के फिजियोलॉजी अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल). बरकरार biofilms उनके मानक glycolytic पीएच ड्रॉप, एसिड हत्या, प्रोटॉन पारगम्यता और एफ ATPase गतिविधि assays (Lemos एट अल में विवरण देखने के लिए, मौखिक 8 Biofilms के फिजियोलॉजी अध्ययन करने के लिए प्रोटोकॉल) का उपयोग करके शारीरिक प्रतिक्रियाओं के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.
- Transcriptome विश्लेषण.
- मानक सीडीएनए माइक्रोएरे और RT-qPCR प्रोटोकॉल (जैसे http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) विशिष्ट रोगज़नक़ों (जैसे एस अपरिवर्तक) के transcriptome प्रतिक्रिया के निर्धारण के लिए संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है विभिन्न विकासात्मक चरणों 6, 7, 10, 11 पर विभिन्न पर्यावरण चुनौतियों और चिकित्सीय को biofilms के भीतर . 1) शाही सेना (biofilm आबादी और ईपीएस मैट्रिक्स की उपस्थिति की विषम प्रकृति के कारण), गुणवत्ता, और 2) डाटा खनन और व्याख्या (कारण: उपकरण बॉक्स में, हम दो तरीकों कि दंत biofilms के transcriptome विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हैं शामिल बड़े डेटा सेट माइक्रोएरे द्वारा उत्पन्न).
- शाही सेना के अलगाव. Biofilms से निकाले शाही सेना की गुणवत्ता के मुद्दे का पता, हम एक अनुकूलित शाही सेना अलगाव और बैक्टीरियल कोशिकाओं से शुद्धि ईपीएस अमीर 12 मैट्रिक्स (http://dx.doi.org/10.1016/j में enmeshed के लिए विशेष रूप से विकसित प्रोटोकॉल का उपयोग ab.2007.03.021). इस प्रोटोकॉल आरएनए वफ़ादारी (RIN) संख्या 8.5 की तुलना में में अधिक है, जो दोनों RT-qPCR और प्रोटीन (उदाहरण के लिए, 11 6, देखें) का उपयोग transcriptome विश्लेषण के लिए इष्टतम माना जाता है प्रदान करता है.
- मानक सीडीएनए माइक्रोएरे और RT-qPCR प्रोटोकॉल (जैसे http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) विशिष्ट रोगज़नक़ों (जैसे एस अपरिवर्तक) के transcriptome प्रतिक्रिया के निर्धारण के लिए संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है विभिन्न विकासात्मक चरणों 6, 7, 10, 11 पर विभिन्न पर्यावरण चुनौतियों और चिकित्सीय को biofilms के भीतर . 1) शाही सेना (biofilm आबादी और ईपीएस मैट्रिक्स की उपस्थिति की विषम प्रकृति के कारण), गुणवत्ता, और 2) डाटा खनन और व्याख्या (कारण: उपकरण बॉक्स में, हम दो तरीकों कि दंत biofilms के transcriptome विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण हैं शामिल बड़े डेटा सेट माइक्रोएरे द्वारा उत्पन्न).
- इमेजिंग प्रतिदीप्ति. Biofilms के स्ट्रक्चरल संगठन.
- Confocal प्रतिदीप्ति इमेजिंग साहित्य में उपलब्ध प्रोटोकॉल के अधिकांश माइक्रोबियल लेबलिंग पर ध्यान केंद्रित है. biofilm के एक प्रमुख घटक के रूप में ईपीएस के विश्लेषण काफी हद तक किया गया है मौखिक biofilm प्रतिदीप्ति इमेजिंग से जुड़े शोध के क्षेत्र में कुछ अपवादों 5, 13, 14 के साथ, उपेक्षित है. हम एक उपन्यास लेबलिंग तकनीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृश्य और ईपीएस बरकरार biofilms के भीतर एक साथ और बैक्टीरियल कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए विशेष सॉफ्टवेयर विकसित किया है. Amira 5 (व्यक्तित्व इमेजिंग GmbH बर्लिन, जर्मनी) biofilms के 3D पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया है, जबकि COMSTAT (http://www.imageanalysis.dk पर उपलब्ध) और DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) प्रदान मात्रात्मक विश्लेषण.
- Biofilms में ईपीएस बैक्टीरिया के संरचनात्मक संगठन के इमेजिंग. एलेक्सा 647 लेबल Fluor dextran संयुग्म ईपीएस मैट्रिक्स कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. फ्लोरोसेंट लेबल dextran streptococcal glucosyltransferases - Gtfs के लिए एक किताब (विशेष रूप से GtfB और GtfC) के रूप में कार्य करता है, और एक साथ biofilm विकास 11 के पाठ्यक्रम पर exopolysaccharide मैट्रिक्स संश्लेषण के दौरान शामिल कर सकते हैं.
ईपीएस लेबलिंग:- कोट 1 के लिए फिल्टर निष्फल लार के साथ hydroxyapatite डिस्क "Biofilm तैयार" प्रोटोकॉल 8 के बाद .
- पिपेट 24 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से में संस्कृति के माध्यम से 2.8 एमएल, और एक अंधेरे कमरे में ले आओ.
- संस्कृति के माध्यम में dextran संयुग्मित Alexa Fluor 1 सुक्ष्ममापी जोड़ें pipetting द्वारा संस्कृति माध्यम में डाई और मिश्रण नीचे (के बारे में 10 बार).
- लार में लिपटे हा (SHA) (1 घंटे ऊष्मायन के बाद) डिस्क दो बार बाँझ अटल बिहारी बफर में डुबकी - धोने और dextran संयुग्मित Alexa Fluor युक्त मध्यम में उन्हें जगह.
- कवर प्लेट 37 पर एल्यूमीनियम पन्नी और सेते साथ ° सी, 5% सीओ 2. ऊष्मायन समय की अवधि के प्रत्येक प्रयोगात्मक डिजाइन पर निर्भर करता है. fluorescently लेबल dextran सांद्रता में बैक्टीरियल कोशिकाओं के रूप में इस में इस्तेमाल किया दाग नहीं करता है11 कहना है 14 Calcofluor के साथ के रूप में अन्य ईपीएस धुंधला तकनीक, संयोजन में उपयोग किया जा सकता है. .
- जीवाणु लेबलिंग:
- Biofilms में जीवाणु घटकों biofilm गठन के मानक फ्लोरोसेंट न्यूक्लिक दाग एसिड (जैसे 9 SYTO) का उपयोग करते हुए अंत में चिह्नित कर रहे हैं, अन्य प्रतिदीप्ति तकनीक (जैसे प्रजातियों विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी 15 या GFP-व्यक्त कोशिकाओं 16) पाठ्यक्रम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है biofilms में एक या एक से अधिक प्रजातियों के जीवाणु का पता लगाने. चित्रा 2 EPS के साथ - साथ लेबलिंग (लाल) और एक 24 घंटे पुराना एस के एक 3D छवि में बैक्टीरिया / microcolonies (हरा ) से पता चलता है अपरिवर्तक biofilm एक शा डिस्क की सतह पर गठित.
- छवियाँ अधिग्रहण: 5 से 10 पदों पर बेतरतीब ढंग से चुनी गई प्रत्येक biofilm स्कैन है, और z श्रृंखला confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर लेजर द्वारा इन पदों में से प्रत्येक पर ऑप्टिकल सेक्शनिंग द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. हम एक ओलिंप FV दो फोटॉन 1000 खुर्दबीन (ओलिंप, टोक्यो, जापान) x10 के साथ सुसज्जित का उपयोग करें (, संख्यात्मक एपर्चर 0.45, कार्ल Zeiss दूरी 3-4 मिमी काम) पानी या x25 (; एनए 1.05 WD 2 मिमी ओलिंप LPlan एन) विसर्जन उद्देश्यों. उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 810 एनएम है, और 9 SYTO के लिए उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य फिल्टर (बैक्टीरिया) 495/540 OlyMPFC1 फिल्टर है, जबकि Alexa Fluor 647 (ईपीएस) के लिए फिल्टर HQ655/40M-2P फिल्टर. सहेजें और कच्चे छवियों की दुकान.
- Biofilms में ईपीएस बैक्टीरिया के संरचनात्मक संगठन के इमेजिंग. एलेक्सा 647 लेबल Fluor dextran संयुग्म ईपीएस मैट्रिक्स कल्पना करने के लिए प्रयोग किया जाता है. फ्लोरोसेंट लेबल dextran streptococcal glucosyltransferases - Gtfs के लिए एक किताब (विशेष रूप से GtfB और GtfC) के रूप में कार्य करता है, और एक साथ biofilm विकास 11 के पाठ्यक्रम पर exopolysaccharide मैट्रिक्स संश्लेषण के दौरान शामिल कर सकते हैं.
- Confocal प्रतिदीप्ति इमेजिंग साहित्य में उपलब्ध प्रोटोकॉल के अधिकांश माइक्रोबियल लेबलिंग पर ध्यान केंद्रित है. biofilm के एक प्रमुख घटक के रूप में ईपीएस के विश्लेषण काफी हद तक किया गया है मौखिक biofilm प्रतिदीप्ति इमेजिंग से जुड़े शोध के क्षेत्र में कुछ अपवादों 5, 13, 14 के साथ, उपेक्षित है. हम एक उपन्यास लेबलिंग तकनीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दृश्य और ईपीएस बरकरार biofilms के भीतर एक साथ और बैक्टीरियल कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए विशेष सॉफ्टवेयर विकसित किया है. Amira 5 (व्यक्तित्व इमेजिंग GmbH बर्लिन, जर्मनी) biofilms के 3D पुनर्निर्माण के लिए इस्तेमाल किया है, जबकि COMSTAT (http://www.imageanalysis.dk पर उपलब्ध) और DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) प्रदान मात्रात्मक विश्लेषण.
2. चरण 2 - रॉ डेटा इनपुट
कच्चे डेटा फ़ाइल में सीधे जैव रासायनिक और RT-qPCR assays (RDF एमएस एक्सेल फ़ाइल) से कच्चे डेटा इनपुट. डीएनए डेटा के लिए, JCVI (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) Spotfinder या इसी तरह सॉफ्टवेयर में स्कैन स्लाइड के एकल चैनल छवियों को लोड. JCVI विनिर्देशों और तब मैन्युअल रूप से करने के लिए ग्रिड के भीतर सभी स्थानों फिट समायोजित अनुसार एक जगह ग्रिड बनाएँ. हर जगह की तीव्रता मूल्यों उपाय और "MeV." फ़ाइलों में बचाने के लिए और "कच्चे माइक्रोएरे डेटा" में संग्रहीत.
3. कदम 3 - डाटा प्रोसेसिंग
RDF (जैव रासायनिक और RT-qPCR) में कच्चे सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए डेटा को व्यवस्थित करें. उन्हें "डेटा प्रसंस्कृत फ़ाइल" (DPF - एमएस एक्सेल फ़ाइल) में स्थानांतरण. माइक्रोएरे और प्रतिदीप्ति इमेजिंग विश्लेषण के लिए विशेष सॉफ्टवेयर (वर्तमान में उपलब्ध है और कस्टम बनाया) के लिए डेटा की प्रक्रिया करने के लिए उपयोग किया जाता है.
- माइक्रोएरे डेटा:
- चरण 2 डेटा सामान्य विशेष सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कदम (में कच्चे प्रोटीन डेटा संग्रहीत) में उत्पन्न कच्चे डेटा सबमिट करें. JCVI माइक्रोएरे डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर MIDAS (http://www.tm4.org/midas.html) का उपयोग कर डेटा सामान्यकरें. डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ LOWESS का प्रयोग करें और मानक विचलन नियमितीकरण, में स्लाइड को दोहराने के विश्लेषण द्वारा पीछा किया. सामान्यीकृत डेटा युक्त फ़ाइलों को स्टोर. इस चरण (कच्चे डेटा फ़ाइलों और सामान्यीकृत डेटा तैयार फ़ाइलें), एक सार्वजनिक उपयोग डेटाबेस (जैसे NCBI जीन एक्सप्रेशन (भू) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo पर सर्वग्राही डेटाबेस) में जमा माइक्रोएरे डेटा, और भविष्य में संदर्भ के लिए परिग्रहण संख्या रिकॉर्ड.
- प्रतिदीप्ति इमेजिंग डेटा
- Biofilm संरचना मात्रा का ठहराव.
- मात्रात्मक डेटा biofilms के प्रत्येक संरचनात्मक घटक (ईपीएस और बैक्टीरिया) के लिए इसी COMSTAT और नव विकसित DUOSTAT, जो स्क्रिप्ट के रूप में MATLAB में 5.1 लिखा गया द्वारा की गणना है. कच्चे प्रतिदीप्ति छवियों सॉफ्टवेयर में अपलोड कर रहे हैं और के रूप में निम्नानुसार विश्लेषण हैं:
- COMSTAT का प्रयोग करने के लिए बायोमास, मोटाई, परत वितरण और अन्य पैरामीटर, जो यों और biofilms के Tridimensional संरचना (http://www.imageanalysis.dk पर मैनुअल देखें) विशेषताएँ गणना.
- DUOSTAT EPS और बैक्टीरिया (या अलग माइक्रोबियल प्रजातियों और / या बाह्य घटकों) जैसे दो biofilm घटकों, सह स्थानीयकरण की गणना का प्रयोग करें:
- MATLAB में 5.1 DUOSTAT के पथ, और खुले छवि फ़ोल्डर जो दो biofilm घटकों के चित्र शामिल हैं सेट.
- दो चैनलों है कि और सहसंबद्ध विश्लेषण किया जाएगा चुनें. दो छवि के ढेर भी समान पिक्सेल आकार सभी तीन आयामों में (x, y, z), और प्रत्येक ढेर में छवियों के एक ही नंबर होना चाहिए.
- आदमी के अनुसार प्रत्येक चैनल के लिए थ्रेसहोल्ड सेट करेंCOMSTAT के ual. सॉफ्टवेयर आपरेशन अंतरफलक (http://www.imageanalysis.dk पर DUOSTAT पुस्तिका वीडियो आलेख देखें) में अनुदेश का पालन करें. DPF में प्राप्त डेटा इनपुट. 4.4 चित्रा में उदाहरण देखें.
- तीन आयामी पुनर्निर्माण biofilms.
- biofilms के तीन आयामी वास्तुकला Amira कल्पना का उपयोग है. प्रतिदीप्ति सॉफ्टवेयर में "कच्चे छवियाँ फ़ोल्डर" में संग्रहीत छवियों को आयात करें, और voltex और आईएसओ सतह प्रतिपादन का उपयोग करने के लिए biofilms में घटकों में से प्रत्येक के लिए 3 डी renderings बनाने (देखें http://www.amira.com पर Amira पुस्तिका प्रलेखन / / मैनुअल और रिलीज notes.html). चित्रा 4.4 पर उदाहरण देखें.
- मात्रात्मक डेटा biofilms के प्रत्येक संरचनात्मक घटक (ईपीएस और बैक्टीरिया) के लिए इसी COMSTAT और नव विकसित DUOSTAT, जो स्क्रिप्ट के रूप में MATLAB में 5.1 लिखा गया द्वारा की गणना है. कच्चे प्रतिदीप्ति छवियों सॉफ्टवेयर में अपलोड कर रहे हैं और के रूप में निम्नानुसार विश्लेषण हैं:
- Biofilm संरचना मात्रा का ठहराव.
4. चरण 4 - डेटा विश्लेषण
जैव रासायनिक, RT-qPCR और DPF में COMSTAT - DUOSTAT assays से मात्रात्मक डेटा के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए तैयार हैं. सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद किया जाता है, रेखांकन और / या तालिकाओं का निर्माण किया जा सकता है ("प्रतिनिधि परिणाम" अनुभाग देखें).
1. माइक्रोएरे डेटा का उपयोग करते हुए संगठन सॉफ्टवेयर माइक्रोएरे डेटा Visualizer (MDV).
जटिलता और बड़े डेटा के उत्पादन के कारण सेट जब प्रोटीन और कई प्रयोगात्मक शर्तों का उपयोग, हम एक डेटा खनन और संगठन के नाम माइक्रोएरे डेटा (MDV) Visualizer 7 सॉफ्टवेयर डिजाइन (http://www.oralgen.lanl.gov/ पर उपलब्ध है) .
वर्ग भविष्यवाणी के लिए एक cutoff 0.001 के पी मान के साथ और वर्ग तुलना करने के लिए सांख्यिकीय BRB ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) विश्लेषण का उपयोग करने के बाद, डेटा उत्पन्न प्रस्तुत किया जा सकता है है MDV करने के लिए, के रूप में अनुसरण करें:
- एक्सेल का प्रयोग, BRB MDV टैब - सीमांकित पाठ फ़ाइलों में डेटा परिवर्तित. निकालें सभी पत्र है कि जीन लोकस टैग संख्या के साथ आते हैं, उदाहरण के लिए: SMU.1423c, अक्षर 'ग' हटाएँ.
- MDV खोलें. फ़ाइल जाओ, और चुनें "एनोटेशन स्रोत का चयन करें". "फ्लैट फ़ाइल" चुनें. जब संवाद बॉक्स के साथ प्रस्तुत, ब्राउज़ करें बटन का उपयोग करने के लिए फ़ाइलें है कि जीन नाम, जीन (जाओ) आंटलजी संख्या, मार्ग, और कार्यात्मक वर्गीकरण डेटा के लिए एनोटेशन होते हैं चुनने.
- फ़ाइल जाओ, और 1 मद से फ़ाइलों की प्रत्येक आयात. फ़ाइलों की प्रत्येक विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक शर्तों का प्रतिनिधित्व करता है. अगर वहाँ विश्लेषण के लिए, उदाहरण के लिए एकाधिक शर्तों के दो अलग - अलग (1 उपचार और 2) उपचार और नियंत्रण (वाहन) 4 आइटम के लिए जाना.
- इस मामले में, संभव तुलना है, (बी) 2 उपचार बनाम नियंत्रण; और (सी) उपचार 1 बनाम उपचार 2 (ए) उपचार 1 बनाम नियंत्रण (विभिन्न व्यक्त जीनों 1 के इलाज के लिए कारण के लिए):. काम कर परिकल्पना के आधार पर, जीन के विभिन्न सेट का चयन किया जा सकता है.
- की तुलना में केवल विभिन्न व्यक्त जीनों का चयन करें (अनन्य जीन केवल उपचार 1 से प्रभावित). इस मामले में, सेट कार्य मेनू से घटाएँ समारोह का उपयोग करें. तुलना बी से जीन एक से घटाना और परिणाम को बचाने. फिर, परिणामी डेटा से सी घटाना. एक ही कार्रवाई करने के लिए केवल बी में जीन (अद्वितीय केवल 2 उपचार द्वारा प्रभावित जीन) को पाने के लिए किया जा सकता है है.
- केवल ए और बी दोनों में पाया जीन का चयन करने के लिए, केंद्रीय सेट कार्य मेनू से समारोह का उपयोग करने के लिए ए और बी की तुलना के लिए परिणाम गठबंधन है, और परिणाम को बचाने. फिर परिणाम डेटा से सी घटाना.
- इन कार्यों visualized किया जा वेन आरेख, MDV है, जो अधिक सहज ज्ञान युक्त है में विशेष रुप से प्रदर्शित का उपयोग कर सकते हैं और परिकल्पना संचालित डेटा संगठन की सुविधा. वेन आरेख डेटा निर्गम स्क्रीन में प्रदर्शित किया जाएगा (चित्रा 3 और वीडियो लेख में स्क्रीन देख).
- टैब - सीमांकित पाठ फाइल करने के लिए डेटा को बचाने के के लिए, फ़ाइल के लिए जाना और निर्यात का चयन करें.
- निर्यात टैब - सीमांकित पाठ फ़ाइलें. उन्हें खोलें Excel का उपयोग कर, और MDV से तालिकाओं और / या एक ग्राफिकल प्रदर्शन के लिए गुप्त में डेटा निर्गम (4.2 आंकड़े, 4.3 और वीडियो लेख देखें) का आयोजन.
5. प्रतिनिधि परिणामों
यहाँ हम कैसे विश्लेषणात्मक उपकरण बॉक्स में एकाधिक चर और प्रयोगात्मक शर्तों के साथ एक biofilm अध्ययन के विभिन्न assays को एकीकृत का एक उदाहरण प्रदान करते हैं.
प्रायोगिक मामले:
स्ट्रैपटोकोकस स्टार्च और biofilm विकास के दौरान 7 sucrose के जवाब में transcriptome अपरिवर्तक की गतिशीलता.
पृष्ठभूमि:
आहार और मेजबान लार amylase और streptococcal glucosyltransferases साथ स्टार्च और sucrose के बातचीत और एस के गठन और डाह में वृद्धि कर सकता incre द्वारा biofilms भीतर अपरिवर्तकexopolysaccharides संश्लेषण, चीनी चयापचय और 11 acidogenicity asing. यह जटिल बातचीत मेजबान रोगज़नक़ आहार रोगजनक दंत क्षय रोग संबंधित biofilms के गठन मिलाना सकता है. हम एक व्यापक जैव रासायनिक और transcriptomic विश्लेषण (पूरे जीनोमिक रूपरेखा सहित) आयोजित करने के लिए आगे कैसे एस समझ अपरिवर्तक 7 amylase की उपस्थिति में biofilm विकास के अलग चरणों में स्टार्च और sucrose का जवाब.
विश्लेषणात्मक उपकरण बॉक्स के लिए हमें विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों और समय के अंक के तहत गठित biofilms के जैव रासायनिक और आणविक assays को एकीकृत करने में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. समग्र डेटा का उपयोग कर उत्पादन विश्लेषणात्मक उपकरण बॉक्स चित्रा 4 में क्रमिक रूप से तरीके (4.1 से 4.4) में प्रस्तुत किया है. यह उल्लेखनीय है कि प्रमुख ध्यान केंद्रित करने के लिए यहाँ टूल बॉक्स और डेटा की व्याख्या और चर्चा की उपयोगिता के बजाय प्रदर्शित करने के लिए है.
- जैव रासायनिक और RT-qPCR assays के संयोजन आगे डीएनए विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक शर्तों का चयन करें. प्रारंभ में, हम 6 अलग sucrose और 5 अलग स्टार्च और sucrose संयोजनों का परीक्षण एस द्वारा biofilms के विकास के लिए कार्बोहाइड्रेट के इष्टतम सांद्रता का चयन करें हमारे में इन विट्रो मॉडल का उपयोग अपरिवर्तक . साथ ही हमें तीन अघुलनशील exopolysaccharides (ऊंचा) राशि और biofilms में gtfB (बढ़ाया) अभिव्यक्ति (अघुलनशील glucan के संश्लेषण के लिए जिम्मेदार) के आधार पर विशिष्ट सांद्रता (चित्रा 4.1 में प्रकाश डाला) के चयन में निर्देशित bioassays से डेटा निर्गम की जांच करने की क्षमता .
- माइक्रोएरे विश्लेषण. आहार कार्बोहाइड्रेट के चयनित सांद्रता (तीन) biofilms रूप इस्तेमाल किया गया है, जो विशिष्ट biofilms के विकास की प्रक्रिया के विभिन्न चरणों को दर्शाती समय अंक पर हटा दिया गया. biofilms (3 प्रयोगात्मक समूहों और 4 समय अंक में विभाजित) BRB ऐरे उपकरण और MDV के साथ पूरे जीनोमिक रूपरेखा (सीडीएनए प्रोटीन) के संयोजन द्वारा transcriptome विश्लेषण के अधीन थे.
शाही सेना निकाला था और biofilm से विशिष्ट प्रोटोकॉल 12 का उपयोग कर शुद्ध, और तब 4 विश्लेषणात्मक उपकरण बॉक्स के कदम प्रक्रिया के माध्यम से विश्लेषण माइक्रोएरे अधीन है. 4.2 चित्रा दिखाता है कि कैसे MDV हमारे काम परिकल्पना है कि sucrose और स्टार्च संयोजन विशिष्ट transcriptional एस बढ़ाया डाह (cariogenic संभावित) के साथ जुड़े प्रतिक्रिया triggers के अनुसार ब्याज की जीन का चयन करने में मदद की biofilms भीतर अपरिवर्तक. कच्चे BRB ArrayTools (4.2a चित्रा) द्वारा उत्पन्न डेटा MDV वेन आरेख (चित्रा 4.2b) का उपयोग करके संसाधित किया गया था. इस अध्ययन में, हमारी परिकल्पना से संबंधित जीन के समूह में विभिन्न प्रकार से की तुलना में व्यक्त कर रहे हैं उन (0.5% + sucrose% 1 बनाम 1% sucrose स्टार्च) और बी (0.5% + 1% स्टार्च sucrose बनाम 0.5% sucrose), लेकिन तुलना सी में जीन (0.5% sucrose बनाम 1% sucrose) (चित्रा 4.2a और 4.2b) नहीं है. 4.2c चित्र में दिखाया गया है, MDV बहुत विश्लेषण किया जा जीन की कुल संख्या को कम करने और एक ही समय में और संयोजन में sucrose स्टार्च के प्रभाव को सीधे संबंधित नहीं जीनों फ़िल्टर बाहर. MDV डेटा उत्पादन भी एक ग्राफिकल स्टार्च में विभिन्न व्यक्त जीनों में से प्रत्येक के कार्यात्मक वर्ग (ऊपर और नीचे विनियमित) द्वारा आयोजित डेटा दिखाने के प्रदर्शित करने के लिए परिवर्तित कर दिया गया + sucrose - biofilms प्रत्येक में (बनाम biofilms sucrose हो) 4-समय अंक (4.3 चित्रा). MDV सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता के अनुकूल और सुविधा खनन / बड़े और जटिल डेटा का संगठन हमारे माइक्रोएरे प्रयोगों से सेट है. - Biofilm इमेजिंग Concomitantly, biofilms के संरचनात्मक संगठन COMSTAT - DUOSTAT - Amira का उपयोग विश्लेषण किया गया था उपकरण बॉक्स में शामिल हैं (3 डी पुनर्निर्माण और स्टार्च के मात्रात्मक विश्लेषण का एक उदाहरण देखें + 4.4 चित्रा में biofilm sucrose हो, यह भी देख सकते वीडियो लेख). आकारिकी, वितरण और EPS और microcolonies के संरचनात्मक संबंध Amira द्वारा 3D सतह प्रतिपादन का उपयोग visualized किया जा सकता है. चयनित क्षेत्र की समाप्ति दृश्य उत्पन्न किया जा सकता है, जो बैक्टीरिया ईपीएस microscale में विशिष्ट संरचनात्मक संबंधों (4.4 चित्रा) दिखाता है. इसके अलावा, confocal छवियों के एक ही सेट / बायोमास microcolony माप, स्थानिक वितरण और बैक्टीरिया कोशिकाओं और एक साथ ईपीएस के colocalization लिए COMSTAT DUOSTAT द्वारा संसाधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, डिस्क की सतह से तरल पदार्थ चरण के लिए ईपीएस और बैक्टीरिया के ऊर्ध्वाधर वितरण तीन आयामी confocal biofilm COMSTAT - DUOSTAT छवियों का उपयोग कर के प्रत्येक ऑप्टिकल अनुभाग से गणना की थी (ग्राफ में 4.4 चित्रा, वीडियो लेख देखें). डेटा biofilms गहराई भर में बैक्टीरिया (ग्रीन लाइन) की तुलना में EPS के उच्च अनुपात (लाल रेखा) दिखाते हैं. इसके अलावा, बैक्टीरियल कोशिकाओं के अधिकांश ईपीएस (नीली रेखा) के साथ जुड़े रहे हैं biofilm के मध्य और बाहरी परत में, विशेष रूप से. इस अवलोकन इंगित करता है कि स्टार्च और sucrose में हो biofilms exopolymers में विशेष रूप से समृद्ध हैं, जो enmeshing हैं () बैक्टीरियल कोशिकाओं के सबसे के साथ निकट संपर्क में, ऐसे संरचनात्मक संगठन स्थिरता और 13 biofilms के सामंजस्य को बढ़ाता है. तीन आयामी renderings और confocal छवियों के मात्रात्मक माप biofilm की संरचना है, जो जैव रासायनिक और डाटा जीन की अभिव्यक्ति पूरक (स्टार्च में एस अपरिवर्तक + sucrose - बड़े हो biofilms द्वारा GtfB प्रकार के संश्लेषण अघुलनशील-glucan बढ़) के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान (के लिए अतिरिक्त उदाहरण देखते हैं 5, 6, 11, 13).
विश्लेषणात्मक उपकरण - बॉक्स हमें सहायता प्राप्त करने, संगठित करने और विभिन्न bioassays, जो कैसे एस के एक व्यापक विश्लेषण प्रदान से डेटा को एकीकृत अपरिवर्तक आहार मेजबान मौखिक गुहा में पाया बातचीत का एक परिणाम के के रूप में जटिल पर्यावरण परिवर्तन का जवाब (क्लेन एट अल में विवरण देखने के लिए, 2009 11.; क्लेन एट अल 2010 , 7).
चित्रा 1 Biofilm विश्लेषण के लिए विश्लेषणात्मक उपकरण बॉक्स के प्रवाह चार्ट .
चित्रा 2 Biofilms में ईपीएस और बैक्टीरिया के Confocal प्रतिदीप्ति इमेजिंग. ईपीएस (लाल) और बैक्टीरिया / गोलाणु अपरिवर्तक शा डिस्क की सतह पर गठित biofilm के तीन आयामी प्रतिपादन में microcolonies (हरा) के साथ - साथ दृश्य.
चित्रा 3. माइक्रोएरे डेटा खनन और माइक्रोएरे डेटा (MDV) Visualizer सॉफ्टवेयर का उपयोग संगठन. वेन आरेख सुविधा का प्रयोग करें ब्याज की जीन का चयन करें, और जीन नाम और कार्यात्मक वर्ग एनोटेशन के अलावा द्वारा पीछा किया.
4.1 चित्रा biofilm गठन के एस द्वारा मूल्यांकन. जैव रासायनिक (A) assays और RT-qPCR (बी) का उपयोग अपरिवर्तक . आईएनएस (अघुलनशील exopolysaccharides) gtfB अभिव्यक्ति के पैटर्न के साथ अच्छी तरह से डेटा सहसंबंधी, और biofilms के बायोमास के साथ. 1% से कम sucrose अधिकतम आईएनएस गठन के लिए एकाग्रता, gtfB और SHA सतह पर biofilm संचय अभिव्यक्ति था, जबकि 0.5% sucrose इष्टतम biofilm विकास के लिए आवश्यक न्यूनतम एकाग्रता इन विट्रो मॉडल में था हमारी का उपयोग कर एस . अपरिवर्तक 0.5% sucrose की उपस्थिति में विकसित कोशिकाओं + 1% स्टार्च उच्चतम बायोमास झुकेंगे, और अन्य biofilms, जो बढ़ाया gtfB अभिव्यक्ति (बी 2) के साथ सहसंबद्ध की तुलना में अधिक आईएनएस प्रस्तुत. इन कार्बोहाइड्रेट सांद्रता आगे transcriptome विश्लेषण के लिए चुना गया.
4.2 चित्रा माइक्रोएरे डेटा MDV सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में BRB ऐरे उपकरण का उपयोग विश्लेषण . एक) के रूप में विभिन्न प्रकार से प्रत्येक (ए, बी या सी) की तुलना और समय BRB - ऐरे उपकरण का उपयोग करने के लिए मूल्यांकन बिंदु में व्यक्त पाया जीन की संख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं. ख) माइक्रोएरे डेटा Visualizer (MDV) वेन आरेख का उपयोग करने के लिए ब्याज की जीन का चयन करें. ग) जीन MDV विश्लेषण के अनुसार चयनित.
4.3 चित्रा एस. अपरिवर्तक जीन विभिन्न स्टार्च में व्यक्त + कार्यात्मक वर्ग द्वारा आयोजित विभिन्न समय अंक पर sucrose biofilms (बनाम sucrose biofilms). जीन एनोटेशन लॉस एलामोस राष्ट्रीय प्रयोगशाला (www.oralgen.lanl.gov) द्वारा या एक ही वेबसाइट पर उपलब्ध साहित्य प्रकाशित द्वारा उपलब्ध कराई गई जानकारी पर आधारित हैं.
4.4 चित्रा तीन आयामी प्रतिपादन और स्टार्च की COMSTAT DUOSTAT विश्लेषण + sucrose - biofilm.
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Discussion
इस प्रस्तुति में, हम विश्लेषणात्मक उपकरण बॉक्स (ईपीएस / बैक्टीरिया इमेजिंग और माइक्रोएरे डेटा / खनन प्रसंस्करण), और विभिन्न प्रणाली में एकीकृत assays के बहुमुखी प्रतिभा और उपयोगिता के दो महत्वपूर्ण घटक का प्रदर्शन किया. जाहिर है, इन विट्रो मॉडल में एक का उपयोग विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों के जवाब में टूल बॉक्स biofilms जैव रसायन, वास्तुकला और जीन अभिव्यक्ति के विभिन्न पहलुओं की व्यापक (तुलनात्मक) और एक साथ विश्लेषण में मदद की 7 की गतिशील और जटिल परिवर्तन को ध्यान में रखते हुए संरचनात्मक, एस द्वारा संगठन शारीरिक और transcriptome की प्रतिक्रियाओं biofilms में अपरिवर्तक (और अन्य रोगज़नक़ों), एक एकीकृत विश्लेषण के लिए आगे समझ कैसे biofilms मौखिक गुहा में pathogenicity मिलाना मदद कर सकता है. वर्तमान में हम प्रजातियों विशिष्ट लेबलिंग और विश्लेषणात्मक उपकरण बॉक्स में metagenomic / metaprotemic विश्लेषण शामिल कर रहे हैं, जो हमारे biofilm मिश्रित प्रजातियों मॉडल में और अधिक विस्तार में जटिल पारिस्थितिक बातचीत और संरचनात्मक परिवर्तन की जांच करने की क्षमता में वृद्धि होगी 5.
इसके अलावा, इस उपकरण (और सभी bioassays) Add-ons के साथ लचीला upgradeable है, है (जैसे metaproteome और हार्ड सतह विश्लेषण, प्रगति में), और / अनुकूलित किया जा सकता है मौखिक biofilm अनुसंधान के बाहर अनुप्रयोगों के लिए संशोधित. उदाहरण के लिए, MDV अन्य biofilm से संबंधित अलग उपभेदों (उत्परिवर्ती) के तुलनात्मक transcriptome जैसे या चिकित्सात्मक एजेंटों के जवाब में कई प्रयोगात्मक शर्तों की तुलना के लिए पूरे जीनोम की रूपरेखा का उपयोग क्षेत्रों के लिए विशेष रूप से मददगार हो सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों MDV के विकास के लिए डॉ. गैरी Xie और हरबर्ट ली धन्यवाद देना चाहूंगा. हम भी डीआरएस धन्यवाद. सिमोन ड्यूआर्टे, रेमिरो Murata, जॅ-Gyu Jeon, जैकलिन Abranches, और अपने उपकरण बॉक्स के विश्लेषणात्मक घटकों के लिए तकनीकी और वैज्ञानिक योगदान के लिए सुश्री स्टेसी ग्रेगोइरे. इस अध्ययन USPHS अनुसंधान अनुदान DE018023 द्वारा दंत चिकित्सा और craniofacial रिसर्च राष्ट्रीय संस्थान से हिस्से में समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | |
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | |
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | |
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus Corporation |
References
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