Summary
Биопленки образуются на поверхности зубов, являются очень сложными и подвергаются постоянной врожденной и экзогенных экологических проблем, которые модулируют их архитектуре, физиологии и транскриптом. Мы разработали инструментарий для изучения состава, структурной организации и экспрессии генов устных биопленок, которые могут быть адаптированы к другим областям биопленки исследований.
Protocol
1. ШАГ 1 - биопробы
Биопленки метод использует диски гидроксиапатита (ГА) в качестве суррогатной зуба (Кларксон хроматографии Products, Inc, Южной Уильямспорт, Пенсильвания, США; площадь поверхности = 2,7 ± 0,2 см 2) покрытый слюной (имитируя наличие приобрел пленку), размещаемых в вертикальном положении, 4, 5, 8.
- Биохимические анализы.
- Биопленки либо (я) гомогенизированные ультразвуком 9 или (II) сохранены для биохимических анализов 8. Гомогенизированные подвески биопленки могут быть использованы для определения биомассы (сухой вес), общий белок, неорганических и внеклеточных и внутриклеточных полисахаридов Состав / содержание (подробности см. в Лемос и соавт., Протоколы по изучению физиологии Устные Биопленки 8). Нетронутым биопленки могут быть проанализированы для своих физиологических реакций с использованием стандартных гликолитических рН-капля, кислотно-убийства, протонной проницаемости и F-АТФазы анализов деятельности (подробности см. в Лемос и соавт., Протоколы по изучению физиологии Устные Биопленки 8).
- Транскриптома анализа.
- Стандартный кДНК микрочипов и РТ-КПЦР протоколов (например http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) может быть использован в комбинации для определения транскриптома-ответ конкретных патогенных микроорганизмов (например, С. mutans) в пределах биопленки на различные экологические и терапевтических задач на различных стадиях развития 6, 7, 10, 11. В ящик для инструмента, мы включили два метода, которые имеют решающее значение для транскриптом анализ зубов биопленки: 1) качество РНК (из-за гетерогенный характер биопленки населения и наличие EPS-матрица), и 2) анализ данных и интерпретация (из-за большой набор данных, порожденных микрочипов).
- РНК изоляции. Чтобы решить вопрос качества РНК извлекается из биопленки, мы используем оптимизированный протокол, разработанный специально для РНК выделения и очистки от бактериальных клеток запуталась в EPS богатых матрицы 12 (http://dx.doi.org/10.1016/j . ab.2007.03.021). Этот протокол обеспечивает целостность РНК номер (РИН) выше, чем 8.5, которая считается оптимальной для транскриптом анализа с использованием как RT-КПЦР и Microarrays (примеры см. 6, 11).
- Стандартный кДНК микрочипов и РТ-КПЦР протоколов (например http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) может быть использован в комбинации для определения транскриптома-ответ конкретных патогенных микроорганизмов (например, С. mutans) в пределах биопленки на различные экологические и терапевтических задач на различных стадиях развития 6, 7, 10, 11. В ящик для инструмента, мы включили два метода, которые имеют решающее значение для транскриптом анализ зубов биопленки: 1) качество РНК (из-за гетерогенный характер биопленки населения и наличие EPS-матрица), и 2) анализ данных и интерпретация (из-за большой набор данных, порожденных микрочипов).
- Флуоресценции. Структурная организация биопленки.
- Большинство протоколов конфокальной флуоресцентной визуализации имеющиеся в литературе сосредоточена на микробную маркировки. Анализ EPS в качестве основного компонента биопленки в значительной степени пренебрегали в устной исследования биопленки с участием флуоресценции, за редким исключением 5, 13, 14. Мы разработали методику новой маркировки и специальное программное обеспечение для воспроизводимых визуализации и количественной оценки EPS и бактериальные клетки одновременно в пределах нетронутыми биопленки. Амира 5 (Visage изображений GmbH, Берлин, Германия) используется для 3D-реконструкцию биопленок, в то время КОМСТАТ (продается в http://www.imageanalysis.dk) и DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) обеспечивают количественного анализа.
- Изображений структурной организации EPS-бактерий в биопленки. Alexa Fluor 647-меченого декстрана сопряженных используется для визуализации EPS-матрицы. Меченных флуоресцентными декстран служит грунт для стрептококковой glucosyltransferases-Gtfs (в частности, GtfB и GtfC), и могут быть одновременно включены в экзополисахарида синтеза матрицы в течение биопленки развития 11.
EPS маркировке:- Пальто гидроксиапатита диски с фильтром стерилизовать слюны в течение 1 ч, после "биопленки Препарат" протокол 8.
- Пипетка 2,8 мл культуральной среды в каждую лунку 24 луночного, и довести до темной комнате.
- Добавить 1 мкМ декстрана сопряженных Alexa Fluor в культуральной среде, смешать краску в культуральной среде с помощью пипетки вверх и вниз (примерно в 10 раз).
- Dip-мытье слюной покрытием HA (SHA) диски (после 1 ч инкубации) два раза в стерильном буфере AB и поместите их в среде, содержащей декстран сопряженных Alexa Fluor.
- Обложка пластинки с алюминиевой фольгой и инкубировать при температуре 37 ° C, 5% СО 2. Продолжительность инкубационного периода зависит от каждого эксперимента. Флуоресцентно меченого декстрана не окрашивает бактериальных клеток в концентрациях, используемых в этом качествеговорят 11. Другие ЭПС-окрашивание методы, такие как с Calcofluor 14, могут быть использованы в комбинации.
- Бактерии маркировке:
- Бактерии компонентов в биопленки помечены в конце биопленки с использованием стандартных флуоресцентных нуклеиновой кислоты пятна (например, SYTO 9); другие флуоресценции методов (например, конкретные виды люминесцентных меченых антител 15 или GFP-клеток, экспрессирующих 16) можно, конечно, используется для обнаружения одного или нескольких видов бактерий в биопленки. На рисунке 2 показан одновременной маркировки EPS (красный) и бактерии / микроколоний (зеленый) в 3D-изображение 24-х старых С. mutans биопленки образуются на поверхности диска ССЗ.
- Изображения приобретения: Каждый биопленки сканируется на 5 до 10 случайно выбранных позиций, а серии Z генерируются оптического секционирования на каждой из этих позиций лазерной сканирующей конфокальной микроскопии с использованием стандартных протоколов. Мы используем Olympus FV 1000 двухфотонного микроскопа (Olympus, Токио, Япония), оснащенных x10 (Carl Zeiss, числовая апертура 0,45; рабочее расстояние 3-4 мм) или x25 (Olympus LPlan N; Н. А. 1,05; WD 2 мм) воды погружение целей. Возбуждения длина волны 810 нм, а длина волны излучения фильтр для SYTO 9 (бактерий) 495/540 OlyMPFC1 фильтр, а фильтр для Alexa Fluor 647 (EPS) является HQ655/40M-2P фильтр. Сохранить и хранения необработанных изображений.
- Изображений структурной организации EPS-бактерий в биопленки. Alexa Fluor 647-меченого декстрана сопряженных используется для визуализации EPS-матрицы. Меченных флуоресцентными декстран служит грунт для стрептококковой glucosyltransferases-Gtfs (в частности, GtfB и GtfC), и могут быть одновременно включены в экзополисахарида синтеза матрицы в течение биопленки развития 11.
- Большинство протоколов конфокальной флуоресцентной визуализации имеющиеся в литературе сосредоточена на микробную маркировки. Анализ EPS в качестве основного компонента биопленки в значительной степени пренебрегали в устной исследования биопленки с участием флуоресценции, за редким исключением 5, 13, 14. Мы разработали методику новой маркировки и специальное программное обеспечение для воспроизводимых визуализации и количественной оценки EPS и бактериальные клетки одновременно в пределах нетронутыми биопленки. Амира 5 (Visage изображений GmbH, Берлин, Германия) используется для 3D-реконструкцию биопленок, в то время КОМСТАТ (продается в http://www.imageanalysis.dk) и DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) обеспечивают количественного анализа.
2. ШАГ 2 - RAW ДАННЫХ
Входной необработанные данные из биохимических и РТ-КПЦР анализов непосредственно в сырье файла данных (RDF-файл MS Excel). Для микрочипов данных, нагрузка одноканального изображения отсканированных слайдов в JCVI Spotfinder (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) или аналогичное программное обеспечение. Создать месте сетки по JCVI спецификаций, а затем вручную настроить, чтобы соответствовать все места в сетке. Измерьте интенсивность значения каждого пятна и сохранить в ". МэВ" файлы и хранятся в "Исходные данные Microarray".
3. ШАГ 3 - ОБРАБОТКИ ДАННЫХ
Организация сырые данные (биохимические и РТ-КПЦР) в RDF для статистического анализа. Передача их в "данных, обрабатываемых файлов" (DPF - MS Excel файл). Для анализа изображений микрочипов и флуоресценция, специальное программное обеспечение (в настоящее время в наличии и на заказ) используются для обработки данных.
- Microarray данных:
- Отправить сырые данные, полученные на шаге 2 (хранится в "Исходные данные Microarrays") для нормализации данных шаг, используя специальное программное обеспечение. Нормализация данных с помощью микрочипов JCVI анализа данных программное обеспечение MIDAS (http://www.tm4.org/midas.html). Используйте LOWESS и стандартные отклонения регуляризации с настройками по умолчанию, а затем в слайд повторить анализ. Хранить файлы, содержащие нормированных данных. На этом этапе (исходных файлов данных и файлов данных нормированы в состоянии готовности), депозитные микрочипов данных в базу данных доступа (например, NCBI экспрессии генов Omnibus (GEO) базы данных в http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo), и записать регистрационный номер, для дальнейшего использования.
- Флуоресценции данных
- Биопленка структуры количественной оценке.
- Количественные данные, соответствующие каждой структурной составляющей (EPS и бактерий) биопленок рассчитывается путем КОМСТАТ и недавно разработанный DUOSTAT, которые были написаны как скрипт в MATLAB 5.1. Сырья флуоресцентные изображения, загруженные в программном обеспечении и проанализировать следующим образом:
- Используйте КОМСТАТ для расчета биомассы, толщина слоя распределения и других параметров, которые характеризуют количество и трехмерную структуру биопленки (см. руководство по http://www.imageanalysis.dk).
- Используйте DUOSTAT для расчета со-локализация двух биопленки компонентов, таких как EPS и бактерий (или разных видов микроорганизмов и / или компонентов внеклеточного):
- Настройка пути DUOSTAT в MATLAB 5.1 и открывать папки изображений, которые включают изображения двух компонентов биопленки.
- Выберите два канала, который будет коррелировать и анализировать. Две стопки изображения также должны иметь одинаковые размеры пикселя во всех трех измерениях (х, у, г), и то же количество изображений в каждом стеке.
- Настройка пороговых значений для каждого канала в соответствии с человекаUAL из КОМСТАТ. Следуйте инструкциям в интерфейсе работы программного обеспечения (см. видео статьи; DUOSTAT руководство в http://www.imageanalysis.dk). Входные данные, полученные в DPF. См. пример на рисунке 4.4.
- Трехмерная реконструкция биопленки.
- Трехмерной архитектуры биопленки визуализируется использованием Амира. Импорт флуоресценции изображений, хранящихся в "Raw Папка Images" в программное обеспечение, а также использовать Voltex и изо-поверхности рендеринга для создания 3-D визуализации каждого из компонентов в биопленки (см. Амира руководство в http://www.amira.com / документации / пособий и отпустить-notes.html). См. пример на рисунке 4.4.
- Количественные данные, соответствующие каждой структурной составляющей (EPS и бактерий) биопленок рассчитывается путем КОМСТАТ и недавно разработанный DUOSTAT, которые были написаны как скрипт в MATLAB 5.1. Сырья флуоресцентные изображения, загруженные в программном обеспечении и проанализировать следующим образом:
- Биопленка структуры количественной оценке.
4. ШАГ 4 - АНАЛИЗ ДАННЫХ
Количественные данные биохимических, RT-КПЦР и КОМСТАТ-DUOSTAT анализы в DPF готовы для статистического анализа. После статистического анализа выполняется, графики и / или таблицы может быть построена (см. "Результаты представитель" раздел).
1. Microarray организации данных с помощью программного обеспечения Microarray данных Visualizer (МДВ).
Из-за сложности и вывода больших массивов данных при использовании микрочипов и нескольких экспериментальных условиях, мы разработали программное обеспечение интеллектуального анализа данных и организации под названием Microarray данных Visualizer (МДВ) 7 (доступны на http://www.oralgen.lanl.gov/) .
После проведения статистического анализа с использованием BRB-ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) со значением отсечки Р 0,001 для класса прогнозирования и для класса сравнения, данные, полученные могут быть представлены для MDV, следующим образом:
- Использование Excel, конвертировать данные в BRB MDV с разделителями табуляции текстовых файлов. Удалить все письма, которые приходят с Номер тэга Локус генов, например: SMU.1423c, удалить букву "с".
- Открытое MDV. Переход к файлу, и выберите "Select Аннотация Источник". Выберите «плоский файл». Сталкиваясь с диалогового окна, используйте кнопки Обзор, чтобы выбрать файлы, которые содержат аннотации для генной имя, Джин Онтология (ГО) номер, путь, и функциональной классификации данных.
- Переход к файлу, а импорт каждого из файлов из пункта 1. Каждый из файлов представляет экспериментальные условия для проведения анализа. Если Есть несколько условий для анализа, например, две различные процедуры (лечение 1 и 2) и контроля (транспортного средства) перейти к пункту 4.
- В этом случае, возможно сравнения: (А) лечение 1 по сравнению с контрольной (для генов, дифференциально экспрессирующихся в результате лечения 1); (Б) лечение 2 против контроля, и (C) лечение 1 vs лечения 2. В зависимости от рабочей гипотезы, различный набор генов могут быть выбраны.
- Выберите только гены разному экспрессируются в сравнении (уникальные гены, пострадавшим от лечения 1 только). В этом случае воспользуйтесь функцией вычитания из меню функций множества. Вычтите из сравнения генов B от и сохранить результат. Затем вычитаем С от полученных данных. Те же действия можно сделать, чтобы получить только гены B (уникальные гены, пострадавшим от лечения 2 только).
- Чтобы выделить только гены обнаружены в А и Б, используйте Союза функцию из меню Функции множества объединить результаты для сравнений и В, и сохранить результат. Затем вычитаем C из результата запроса.
- Эти действия могут быть визуализированы использованием диаграммы Венна, Лучшее в MDV, которая является более интуитивным, а также облегчает гипотеза управляемой организации данных. Диаграммы Венна выходных данных будут отображаться на экране (см. экран на рисунке 3 и видео статьи).
- Чтобы сохранить данные с разделителями табуляции текстовых файлов, перейдите в меню Файл и выберите Экспорт.
- Экспорт с разделителями табуляции текстовых файлов. Открытые их с помощью Excel, а также организовать выход данных от MDV в виде таблиц и / или скрытого для графического дисплея (рис. 4.2, 4.3 и видео статьи).
5. ПРЕДСТАВИТЕЛЬ РЕЗУЛЬТАТЫ
Здесь мы приведем пример того, как аналитический инструмент коробки интегрирует различные анализы биопленки исследования с нескольких переменных и условий эксперимента.
Экспериментальные случае:
Динамика mutans Streptococcus транскриптома в ответ на крахмала и сахарозы в течение биопленки развития 7.
Справочная информация:
Взаимодействий диетического крахмала и сахарозы с принимающими слюнных амилазы и стрептококковой glucosyltransferases может повысить образование и вирулентности S. mutans в пределах биопленки на приращенияasing экзополисахариды синтеза, обмена веществ и сахара acidogenicity 11. Этот комплекс хозяин-патоген-диета взаимодействие может модулировать образование патогенных биопленки, связанные с стоматологических заболеваний кариесом. Мы провели всесторонний биохимических и transcriptomic анализа (в том числе целый профилирования геномной) в целях дальнейшего понять, как С. mutans реагирует на крахмала и сахарозы в различных стадиях развития биопленки в присутствии амилазы 7.
Аналитический инструмент, коробки были использованы, чтобы помочь нам в интеграции биохимические и молекулярные анализы биопленки образуются при различных экспериментальных условиях и временных точках. Общий объем производства данных с использованием аналитических инструментов окна представлен в последовательно образом на рисунке 4 (4,1 до 4,4). Стоит отметить, что основное внимание здесь, чтобы продемонстрировать полезность набора инструментальных средств, а не интерпретации данных и обсуждения.
- Сочетание биохимических и РТ-КПЦР анализы, чтобы выбрать условия эксперимента для дальнейшего анализа микрочипов. Первоначально, мы протестировали 6 различных сахарозы и 5 различных крахмала и сахарозы комбинации, чтобы выбрать оптимальные концентрации углеводов для развития биопленки С. mutans используя нашу модель в пробирке. Способность исследовать одновременно вывода данных из биопробы мы руководствовались при выборе трех конкретных концентраций (выделена на рисунке 4.1) на основе (повышенный) количество нерастворимого экзополисахариды и (расширенный) выражение gtfB (отвечает за синтез нерастворимого глюкана) в биопленки .
- Microarray анализа. Выбран (три) концентрации пищевые углеводы были использованы для формирования биопленок, которые были удалены в определенных временных точках отражающих различные этапы процесса развития биопленки. Биопленок (разделено на 3 экспериментальные группы и 4 временных точках) были подвергнуты анализу транскриптом, объединив весь профилирование генома (кДНК микрочипы), с BRB-Array Инструменты и MDV.
РНК выделяли и очищали с использованием биопленки конкретного протокола 12, а затем подвергается микрочипов анализа через 4 шаг процесса аналитического инструмента-Box. Рисунок 4.2 иллюстрирует, как MDV помогли выбрать гены интерес в соответствии с нашей рабочей гипотезы, что сахароза и крахмал сочетание вызывает специфический транскрипционный ответ связан с повышенной вирулентностью (кариесогенных потенциал) С. mutans в биопленки. Сырые данные, полученные в BRB-ArrayTools (рис. 4.2а) было обработано MDV использованием диаграммы Венна (рис. 4.2b). В данном исследовании группа генов, связанных с нашей гипотезой те разному экспрессируются в сравнении (0,5% сахарозы + 1% крахмала по сравнению с 1% сахарозы) и B (0,5% сахарозы + 1% крахмала по сравнению с 0,5% сахарозы), но не генами в сравнении C (0,5% по сравнению с сахарозой 1% сахарозы) (рис. 4.2а и 4.2b). Как показано на рисунке 4.2c, MDV значительно уменьшается общее число генов, которые будут проанализированы и в то же время отфильтрованные гены непосредственно не связаны с влиянием сахароза и крахмал в комбинации. Выход MDV данные были также преобразованы в графический дисплей, отображающий данные организованного функционального класса каждого из генов, дифференциально экспрессирующихся (вверх и вниз регулируемой) в крахмал + сахароза-биопленок (по сравнению с сахарозой выращенных биопленки), на каждом из 4-х временных точек (рис. 4.3). Программное обеспечение MDV удобна для пользователя и способствовала добыча / организация больших и сложных наборов данных из наших экспериментов микрочипов. - . Биопленка изображений Одновременно структурной организации биопленки была проанализирована с помощью КОМСТАТ-DUOSTAT-Амира, включенных в ящик для инструментов (см. пример 3D-реконструкции и количественного анализа крахмала + сахароза выращенных биопленки на рисунке 4.4, см. также видео статьи). Морфология, распределение и структурные отношения EPS и микроколоний могут быть визуализированы с использованием 3D рендеринг поверхности Амира. Крупный план вид выбранной области могут быть созданы, что свидетельствует специфических бактерий-EPS структурных связей на микроуровне (рис. 4.4). Кроме того, тот же набор конфокальной изображения могут быть обработаны КОМСТАТ-DUOSTAT для биомассы / микроколония измерений, пространственное распределение и колокализации клетки бактерий и EPS одновременно. Например, вертикальное распределение EPS и бактерий из поверхности диска, чтобы жидкость фазы рассчитывалась по каждой из оптических разделе трехмерных изображений конфокальной биопленки использованием КОМСТАТ-DUOSTAT (график на рисунке 4.4;. См. видео статьи). Данные показывают более высокие пропорции EPS (красная линия), чем бактерии (зеленая линия) по всей глубине биопленки. Кроме того, большинство бактериальных клеток связаны с EPS (синяя линия), особенно в средних и наружных слоев биопленки. Это наблюдение показывает, что биопленки выращенных в крахмала и сахарозы особенно богаты exopolymers, которые хватая (в тесном контакте с-) большая часть бактериальных клеток; такой структурной организации повышает стабильность и сплоченность биопленки 13. Трехмерной визуализации и количественного измерения конфокальных изображений предоставляют дополнительную информацию о структуре биопленки, которая дополняет и биохимических генных данных выражения (увеличение GtfB типа нерастворимых-глюкан синтеза С. mutans в крахмале + сахароза выращенных биопленки) (Дополнительные примеры см. 5, 6, 11, 13).
Аналитический инструмент-Box помогал нам получить, систематизировать и интегрировать данные из различных биопробы, в котором содержится всеобъемлющий анализ того, как С. mutans могут реагировать на сложные изменения в окружающей среде в результате диеты хозяина взаимодействия найдены в полости рта (подробности см. в Кляйн и др., 2009 11,.. Кляйн и др., 2010 7).
Рисунок 1. Блок-схема аналитического инструмента-Box биопленочной анализа.
Рисунок 2. Конфокальной флуоресценции ЭПС и бактерий в биопленки. Одновременная визуализация EPS (красный) и бактерии / микроколоний (зеленый) в трехмерном оказание стрептококками биопленки образуются на поверхности диска ССЗ.
Рисунок 3. Microarray Data Mining и организация Использование Microarray данных Visualizer (MDV) программного обеспечения. Использование функции диаграммы Венна, чтобы выбрать из генов интересов, а также с последующим добавлением имени гена и функциональная аннотация класса.
Рисунок 4.1. Оценка образование биопленки С. mutans с использованием биохимических анализов (А) и RT-КПЦР (B). INS (нерастворимые экзополисахариды) данные хорошо коррелируют с динамикой gtfB выражении, так и с биомассой биопленки. Сахароза на 1% концентрации для максимального формирование INS, gtfB выражения и накопления биопленки на поверхности SHA в то время как 0,5% сахарозы была минимальной концентрации, необходимые для оптимального развития биопленки используя нашу модель в пробирке. С. mutans клеток, выращенных в присутствии 0,5% сахарозы + 1% крахмала, привел к самой высокой биомассой, и представил более INS, чем другие биопленки, что коррелировало с повышенной gtfB выражение (B2). Эти углеводы концентрации были отобраны для дальнейшего транскриптом анализа.
Рисунок 4.2. Microarray данные анализа с использованием BRB-Array инструменты в сочетании с программным обеспечением MDV. а) представлять число генов определяется как разному экспрессируются в каждой сравнения (A, B или C) и момент времени оцениваются с помощью BRB-Array Tools. б) Microarray данных Visualizer (МДВ) с помощью диаграммы Венна для выбора генов, представляющих интерес. в) Гены выбраны в соответствии с анализом MDV.
Рисунок 4.3. С. mutans генов, дифференциально экспрессирующихся в крахмале + сахароза-биопленок (по сравнению с сахарозой, биопленки), на различных временных точках организована функционального класса. Гена аннотации основаны на информации, предоставленной в Лос-Аламосской национальной лаборатории (www.oralgen.lanl.gov) или по литературе доступны на том же сайте.
Рисунок 4.4. Трехмерная визуализация и КОМСТАТ-DUOSTAT анализа крахмала + сахароза-биопленки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этой презентации мы показали два важных компонентов аналитического инструмента-Box (EPS / бактерий визуализации и анализа данных микрочипов / обработки), универсальность и полезность различных анализов интегрированы в систему. Очевидно, ящик для инструментов способствовало всеобъемлющего (сравнительная) и одновременного анализа различных аспектов биопленки биохимии, архитектуры и экспрессии генов в ответ на различных экспериментальных условиях с использованием в модельных лабораторных условиях. 7 Учитывая динамичные и сложные изменения структурной организации, физиологических и транскриптом ответы С. mutans (и других патогенов) в биопленках, комплексный анализ может помочь понять, как дальше биопленки модулировать патогенности в полости рта. Мы в настоящее время включения видоспецифические маркировки и метагеномных / metaprotemic анализа в аналитический инструмент-Box, которая повысит способность исследовать более подробно комплексного экологического взаимодействия и структурные изменения в нашей смешанных видов биопленки модели 5.
Кроме того, этот инструмент (и все биопробы) является гибкой, с возможностью расширения с надстройками (например metaproteome и с твердым покрытием анализа; в процессе), и может быть адаптирована / модифицирована для применения вне устного исследования биопленки. Например, МДВ может быть особенно полезным и для других биопленки областях, связанных с использованием целого генома профилирования для сравнения нескольких экспериментальных условиях, таких как сравнительно-транскриптом различных (мутант) штаммов или в ответ на терапевтических агентов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-ра Гэри Се и Герберта Ли за развитие MDV. Мы также благодарим д-ра. Симоне Дуарте, Рамиро Murata, Дже-Гю Чон, Жаклин Abranches, и г-жа Грегуар Стейси за их техническим и научным вкладом в аналитические компоненты набора инструментальных средств. Это исследование было поддержано частично USPHS Исследовательский грант DE018023 из Национального института стоматологических и черепно-лицевых исследований.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Syto 9 | Invitrogen | S34854 | |
| Syto 60 | Invitrogen | S11342 | |
| Dextran conjugated alexa 647 | Invitrogen | D22914 | |
| Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope | Olympus Corporation |
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R.
- Leme, P. aes, Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. ury The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight. J Dent Res. 85, 878-887 (2006).
- Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries. J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).
- Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms. J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).
- Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms. BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).
- Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development. PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).
- Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms. Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).
- Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol. J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).
- Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).
- Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development. Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).
- Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).
- Xiao, J., Koo, H. Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms. J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).
- Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque. Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).
- Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r, Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms. Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).
- Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >, Crielaard, W. Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms. J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).
