Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Summary

Diş yüzeylerinde oluşan Biyofilmler, son derece karmaşık ve kendi mimari modüle doğuştan sabit ve dışsal çevre sorunlarına, fizyoloji ve transcriptome maruz. Bileşimi, yapısal organizasyon ve oral biyofilmlerin biyofilm araştırmanın diğer alanlara adapte olabilen gen ekspresyonu, incelemek için bir araç kutusu geliştirdi.

Abstract

Biyofilmler, son derece dinamik, değişken yoğunluklu ve ^{kompozisyon 1,} 2, ekstraselüler matriks ağına düşmüştür mikrobiyal hücrelerin düzenli ve yapılandırılmış topluluklar . Genel olarak, biyofilm hücre kümeleri (veya mikrokoloniler) ve karmaşık bir matriks meydana gelen mikrokoloniler daha da geliştirilmesi ve istikrar oluşumu takip eden bir yüzey üzerine ilk mikrobiyal eklenti gelişir. Biyofilm matrisler liman exopolysaccharides (EPS), ve diş biyofilm çoğunluğu bir istisna vardır; özellikle çürük hastalığı, çoğunlukla mutans streptokok ³ aracılı ile ilgili olanlar. EPS öncelikle ³ substrat olarak sakaroz kullanılarak glucosyltransferases gibi ekstrasellüler enzimler, mikroorganizmalar tarafından sentezlenen (S. mutans, önemli katkıda).

Diş yüzeylerinde oluşan biyofilm çalışmaları özellikle oral kavite meydana gelen karmaşık diyet-host-mikrobiyal etkileşimi ile ilgili çevre sorunlarına karşı sürekli maruz kalma nedeniyle karşı karşıya olduğu zorluklardır. Bu karmaşık etkileşimler yanıt yapısal organizasyon ve matriks kompozisyonu, fizyoloji ve transcriptome / biyofilm hücrelerinin proteom profili dinamik değişiklikleri daha iyi anlaşılması sözlü biyofilm patojenite modüle nasıl mevcut bilgi daha önceden. Bu nedenle, biz, ısmarlama yazılım ile veri analizi için yaygın olarak bulunan ve yeni teknikleri bir araya getirerek, yapısal, biyokimyasal ve moleküler düzeyde biyofilm analizi kolaylaştırmak için alet kutusu analitik bir geliştirdik. Standart analitik (kolorimetrik testleri, RT-qPCR ve mikroarray'ler) ve yeni floresans teknikleri (bakteri ve EPS eşzamanlı etiketleme için) oral biyofilm araştırma karmaşık doğası adres veri analizi için özel bir yazılım ile entegre edildi.

Alet kutusu, 4 farklı ama birbirine bağlı adımları (Şekil 1) oluşur: 1) biyoanalizlere, 2) Ham Veri Girişi, 3) Bilgi İşlem, ve 4) Veri Analizi. Biz alet kutusu kullanışlılığı ve esneklik göstermek için, in vitro biyofilm modeli ve özel deneysel koşullar kullandı . Biyofilm modeli, basit, tekrarlanabilir ve birden fazla tek bir deney ^{çoğaltır, aynı anda 4} 5 yapılabilir . Ayrıca, temporal değerlendirme, çeşitli mikrop türlerinin dahil ⁵ farklı deney koşullarının etkilerinin değerlendirilmesi (örneğin tedaviler ^6; nakavt mutantlar karşılaştırılması vs ebeveyn zorlanma ^5; karbonhidrat kullanılabilirlik ⁷⁾ izin verir . Burada, alet kutusu mikroarray veri madenciliği / kuruluş (MDV) ve floresan görüntüleme analizi (DUOSTAT) için yeni yazılım (i) dahil olmak üzere iki belirli bileşenleri, tarif etmek, ve (ii) EPS-etiketleme yerinde. Ayrıca alet kutusu biyofilm analizi, veri organizasyonu, entegrasyon ve yorumlama ile nasıl yardımcı olabilir gösteren deneysel bir durum sağlar.

Protocol

1. ADIM 1 - biyoanalizlere

Biyofilm yöntem diş vekil olarak hidroksiapatit (HA) diskleri kullanır (Clarkson Kromatografi Ürünler A.Ş., Güney Williamsport, PA, ABD; yüzey alanı = 2.7 ± 0.2 cm ²⁾ tükürük ile kaplı (kazanılmış zar varlığı taklit) yerleştirilmiş dik bir konumda ^{4, 5, 8.}

1. Biyokimyasal Tahliller.
   1. Biyofilm sonikasyon ⁹ homojen (i) veya (ii) biyokimyasal testleri ⁸ bozulmadan. Homojenize biyofilm süspansiyon toplam inorganik protein, ve ekstrasellüler ve intrasellüler polisakkaritler kompozisyon / içerik (Lemos ark ayrıntılarını görmek, Oral Biyofilmler ⁸ Fizyolojisi Eğitim Protokolleri), (kuru ağırlık) biyokütle belirlenmesi için kullanılır. Sağlam biyofilm standart glikolitik pH bırak, asit-öldürme, proton geçirgenlik ve F-ATPaz aktivitesi testleri (Lemos ark ayrıntılarını görmek, Oral Biyofilmler ⁸ Fizyolojisi Eğitim Protokolleri) kullanarak kendi fizyolojik yanıtlar için analiz edilebilir.
2. Transcriptome Analizleri.
   1. Standart cDNA mikroarray ve RT-qPCR protokolleri (örneğin http://pfgrc.jcvi.org/index.php/microarray/protocols.html) belirli patojenlere (örn. S. mutans) transcriptome-yanıt belirlenmesi için birlikte kullanılabilir. biyofilm içinde çeşitli gelişim evreleri ^{6, 7, 10, 11,} çeşitli çevre ve terapötik güçlüklere . RNA kalitesi (biyofilm nüfus ve EPS-matrix varlığı heterojen doğası nedeniyle), ve 2) veri madenciliği ve yorumlama (nedeniyle 1): araç kutusu, diş biyofilm transcriptome analizi için kritik iki yöntem büyük veri) mikroarray tarafından oluşturulan ayarlayın.
      • RNA izolasyonu biyofilm den çıkarılan RNA kalite sorunu gidermek için, EPS zengin matris ¹² (http://dx.doi.org/10.1016/j ağına düşmüştür bakteri hücrelerinin RNA izolasyonu ve saflaştırılması için özel olarak geliştirilen optimize edilmiş bir protokol ab.2007.03.021). Bu protokol, RT-qPCR ve Mikroarray'ler (örnekler ^{için, 6,} 11) kullanarak transcriptome analizi için en uygun olarak 8.5 daha yüksek RNA Bütünlük sayısı (RIN), sağlar.
3. Görüntüleme Floresans. Biyofilm yapısal organizasyonu.
   1. Literatürde mevcut konfokal floresan görüntüleme protokolleri çoğu mikrobiyal etiketleme odaklanır. Biyofilm önemli bir bileşeni olarak EPS analizi büyük ölçüde birkaç istisna dışında ^{5, 13, 14,} floresan görüntüleme içeren oral biyofilm araştırma ihmal edilmiştir. Biz, bir roman etiketleme tekniği ve tekrarlanabilir görselleştirme ve eş zamanlı sağlam biyofilm içinde EPS ve bakteri hücrelerinin ölçümü için özel bir yazılım geliştirdik. COMSTAT (http://www.imageanalysis.dk mevcut) ve DUOSTAT (http://www.imageanalysis.dk) sağlarken Amira 5 (Visage Imaging GmbH, Berlin, Almanya), biyofilm 3D rekonstrüksiyon için kullanılan kantitatif analiz.
      1. Biyofilm EPS bakteri yapısal organizasyonu Görüntüleme. Alexa Fluor 647 etiketli dekstran konjuge EPS-matrix görselleştirmek için kullanılmaktadır. Floresan etiketli dekstran streptokok glucosyltransferases-Gtfs için astar (özellikle GtfB ve GtfC) olarak hizmet veren ve aynı anda ¹¹ biyofilm gelişimi boyunca exopolysaccharide matriks sentezi sırasında dahil edilebilir.
         
         EPS etiketleme:
         1. "Biyofilm Hazırlama" protokol ⁸ 1s için filtre ile sterilize edilmiş tükürük ile Coat hidroksiapatit diskler.
         2. Pipet 2.8 kültür ortamı her bir kuyunun 24 kuyucuğu mL ve karanlık bir odada getirmek.
         3. Kültür ortamında dekstran konjuge Alexa Fluor 1 mcM pipetleme kültür ortamı içine boya karışımı ve aşağı (yaklaşık 10 kat).
         4. Tükürük kaplı HA (SHA) diskleri (1 saat inkübasyon sonrasında) iki kez steril AB tampon Dip-yıkama ve dekstran konjuge Alexa Fluor içeren orta koyun.
         5. Kapak, 37 alüminyum folyo ve inkübe plaka ° C,% 5 _CO 2 . Inkübasyon süresi süresi her bir deneysel tasarım bağlıdır. Floresan etiketli dekstran olarak kullanılan konsantrasyonlarda bakteri hücrelerinin leke yapmaz¹¹ söylüyorlar. Calcofluor ¹⁴ gibi diğer EPS-boyama teknikleri, kombinasyon halinde kullanılabilir.
      2. Bakteriler etiketleme:
         1. Biyofilm içinde Bakteriler bileşenleri leke standart floresan nükleik asit (örneğin SYTO 9) kullanarak biyofilm oluşumu sonunda etiketli, diğer floresans teknikleri (örneğin tür spesifik floresan etiketli antikorlar ¹⁵ veya GFP ifade hücreleri ¹⁶⁾ ders için kullanılabilir biyofilm bir veya daha fazla bakteri türlerinin algılar. Şekil 2 24-h eski S. 3D görüntü aynı anda EPS etiketleme (kırmızı) ve bakteri / mikrokoloniler (yeşil) mutans biyofilm SHA disk yüzeyi üzerinde oluşan.
         2. Görüntüler satın alma: Her biyofilm rastgele seçilen 5 ila 10 pozisyonları taranır ve z serisi, standart protokolleri kullanarak konfokal mikroskopi lazer tarama bu pozisyonların her optik kesit oluşturulur. Olympus FV 1000 iki foton x10 ile donatılmış mikroskobu (Olympus, Tokyo, Japonya) (sayısal açıklık 0.45, Carl Zeiss mesafe 3-4 mm) su veya x25 (; NA 1.05 WD 2 mm Olympus LPlan N) daldırma hedefleri. Dalgaboyu 810 nm ve Alexa Fluor 647 (EPS) için filtre HQ655/40M-2P filtre ise SYTO 9 emisyon dalga boyu filtre (bakteriler), 495/540 OlyMPFC1 filtre. Kaydet ve ham görüntüleri depolamak.

2. ADIM 2 - RAW VERİ GİRİŞİ

Ham Veri Dosyası içine doğrudan biyokimyasal ve RT-qPCR testleri (RDF-MS Excel dosyası) Giriş ham veri. Mikroarray'ler veriler için, JCVI Spotfinder (http://pfgrc.jcvi.org/index.php/bioinformatics.html) ya da benzer bir yazılım içine taranmış slaytları tek kanallı görüntüleri yüklemek. JCVI özellikleri ve daha sonra elle ayarlamak ızgara içinde tüm noktalar sığdırmak için uygun bir nokta ızgara oluşturun. Her spot yoğunluk değerleri ölçülür ". MeV" dosyaları kaydedin ve "Ham Mikroarray veri" depolanır.

3. ADIM 3 - BİLGİ İŞLEM

Istatistiksel analiz için RDF (biyokimyasal ve RT-qPCR) ham verileri düzenleyin. "Veri İşlenmiş Dosya" (MS Excel dosyası DPF) içine aktarın. Mikroarray ve floresan görüntüleme analizi için özel bir yazılım (şu anda mevcut ve ısmarlama) verileri işlemek için kullanılır.

1. Mikroarray verileri:
   1. Özel bir yazılım kullanarak veri normalleşme adım adım 2 ("Ham Mikroarray'ler veri" içine saklanır) üretilen ham veri gönderin. JCVI mikroarray veri analiz yazılımı MIDAS (http://www.tm4.org/midas.html) kullanarak veri Normale. -Slayt çoğaltmak analizi ile takip LOWESS ve standart sapma düzenlilestirme varsayılan ayarları ile kullanın. Normalize edilmiş verileri içeren dosyaları saklayın. Bu aşamada (ham veri dosyaları ve normalize edilmiş veri dosyaları hazır), bir kamu erişim veritabanı (örn. NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo Gene Expression Omnibus (GEO) veritabanı) mevduat mikroarray verileri, ve ileride başvurmak için üyelik numaranızı kaydederiz.
2. Floresans görüntüleme verileri
   1. Biyofilm yapısı kantifikasyon.
      1. Biyofilm her yapısal bileşeni (EPS ve bakteriler) karşılık gelen nicel veri COMSTAT ve yeni geliştirilen 5.1 MATLAB komut dosyası olarak yazılmıştır DUOSTAT tarafından hesaplanır. Çiğ floresan görüntüler yazılım yüklenen ve şu şekilde analiz edilmektedir:
         • Biyokütle, kalınlık, katman dağıtım ve diğer parametreleri ölçmek ve tridimensional biyofilm yapısı (http://www.imageanalysis.dk az kılavuzuna bakın) karakterize hesaplamak için COMSTAT kullanın.
         • EPS ve bakteriler (veya farklı mikrobiyal türler ve / veya dışı bileşenler) olarak iki biyofilm bileşenleri, eş-lokalizasyon hesaplamak için DUOSTAT kullanın:
           1. MATLAB 5.1 DUOSTAT yolu ve iki biyofilm bileşenleri görüntüleri içeren açık bir görüntü klasörleri ayarlayın.
           2. Korelasyon ve analiz edilecek iki kanal seçin. Iki görüntü yığınları da aynı piksel boyutlarında üç boyutlu (x, y, z) ve her yığında görüntüler aynı sayıda olması gerekir.
           3. Adama göre her kanal için eşiklerCOMSTAT, cinsel. Yazılım operasyon arayüzü (http://www.imageanalysis.dk az DUOSTAT kılavuzu video makalesine bakın) yönergeleri izleyin. Giriş DPF içine elde edilen veriler. Şekil 4.4 'deki örneğe bakın.
      2. Üç boyutlu biyofilm yeniden yapılanma.
         1. Biyofilm üç boyutlu mimari Amira kullanılarak görüntülendi. Yazılım içine "Ham Görüntüler Klasörü" içine saklanan floresan görüntü alma ve biyofilm bileşenleri her biri 3-D görüntüler oluşturmak için voltex ve iso-yüzey render kullanabilirsiniz (bkz. http://www.amira.com az Amira manuel / belge / manuals-bırak-notes.html). Şekil 4.4 örneğe bakın.

4. ADIM 4 - VERİ ANALİZİ

DPF biyokimyasal, RT-qPCR ve COMSTAT DUOSTAT testlerin nicel verilerin istatistiksel analizi için hazır. Istatistiksel analiz yapıldıktan sonra, grafikler ve / veya tablolar ("Temsilci Sonuçları" bölümüne bakınız) inşa edilebilir.

1. Mikroarray veri organizasyonu yazılım Mikroarray veri görüntüleyici (MDV) kullanarak.

Mikroarray'ler ve birden fazla deneysel koşullar kullanarak karmaşıklığı ve büyük veri çıkış nedeniyle setleri, (http://www.oralgen.lanl.gov/ mevcut) Mikroarray veri görüntüleyici (MDV) ⁷ adında bir veri madenciliği ve organizasyon yazılımı, .

BRB ArrayTools (http://linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools.html) kullanarak, sınıf tahmini için 0.001 'lik bir kesim P değeri ve sınıf karşılaştırma için istatistiksel analizi yaptıktan sonra, oluşturulan veri sunulabilir MDV için izleyin:

1. Excel programını kullanarak, MDV sekme ile sınırlandırılmış metin dosyaları içine BRB verileri dönüştürmek. Gen Odağı Etiketi Numarası ile birlikte gelen tüm harfleri çıkarın; örneğin: SMU.1423c, "c" harfi silin.
2. MDV açın. Dosya gidin, ve "Annotation Kaynak seçin" seçeneğini seçin. "Düz Dosya" yı seçin. Iletişim kutusu ile sunulan zaman, gen adı, Gen Ontoloji (GO) numarası, yolağı ve fonksiyonel sınıflandırma veri açıklama içeren dosyaları seçmek için Gözat düğmelerini kullanın.
3. Dosya gidin ve madde 1 dosyaları her ithalat bağlantısı. Her dosyaları analiz için deneysel koşullar temsil eder. Analiz için, örneğin birden fazla koşul varsa, iki ayrı tedavi (tedavi 1 ve 2) ve kontrol (araç) madde 4 gidin.
4. Bu durumda, olası karşılaştırmalar: (A) tedavisi 1 vs kontrolü (tedavi 1 nedeniyle farklı genlerin), (B) tedavisi 2 vs kontrolü ve (C) tedavisi 1 vs tedavi 2. Çalışma hipoteze göre, genlerin farklı seçilebilir.
5. Karşılaştırıldığında sadece genler farklı ifade seçin (benzersiz genler tek tedavi 1 etkilenen). Bu durumda, Set Fonksiyonları menüden çıkart işlevini kullanabilirsiniz. A dan karşılaştırma B genleri çıkarma ve sonucu kaydedin. Sonra, ortaya çıkan veriler C çıkarın. Aynı eylemleri B (tek tedavi 2 etkilenen benzersiz genler) genlerin almak için yapılabilir.
6. Sadece A ve B hem de tespit edilen genlerin seçmek için, A ve B karşılaştırmalar için sonuçlarını birleştirmek ve sonuç kaydetmek için Set Fonksiyonları menüden Birliği işlevini kullanabilirsiniz. Sonra sonuç veri C çıkarın.
7. Bu eylemler daha sezgisel MDV, özellikli Venn diyagramı kullanarak görüntülenebilmekte ve hipotez odaklı veri organizasyonu kolaylaştırır. Venn diyagramı veri çıkışı (bkz. Şekil 3 ve video makale ekran görünümü) ekranda görüntülenir.
   
8. Sekme ile sınırlandırılmış metin dosyaları, veri kaydetmek için, Dosya menüsüne gidin ve Ver'i seçin.
9. İhracat sekme ile sınırlandırılmış metin dosyalarını. Onları Excel kullanarak açın ve grafik ekran gizli tablo ve / veya MDV veri çıkışı (bkz. Şekil 4.2, 4.3 ve Video makale) organize.

5. TEMSİLCİSİ SONUÇLAR

Burada analitik araç kutusu, bir biyofilm çalışmada çok değişkenli ve deneysel koşullar ile çeşitli testlerin entegre nasıl bir örnek oluşturmaktadır.

Deneysel durumda:

⁷ biyofilm gelişimi sırasında nişasta ve sukroz yanıt transcriptome Streptococcus mutans dinamiği.

Amaç:

Ev sahibi tükürük amilaz ve streptokok glucosyltransferases diyet nişasta ve sukroz etkileşimleri S. oluşumu ve virülans güçlendirebilir artışlarla tarafından biyofilm içinde mutansexopolysaccharides sentezi, şeker metabolizması ve acidogenicity ¹¹ asing. Bu karmaşık konak-patojen-diyet etkileşimi diş çürükleri hastalığı ile ilgili patojen biyofilm oluşumunu modüle olabilir. Biz daha S. nasıl anlamak için kapsamlı bir biyokimyasal ve transcriptomic analizi (tüm genomik profili dahil) yaptı mutans amilaz ⁷ varlığı biyofilm gelişimi farklı aşamada nişasta ve sukroz yanıt verir.

Analitik araç kutusu çeşitli deneysel koşullar ve zaman noktalarında altında oluşan biyofilm biyokimyasal ve moleküler testlerin entegre bize yardımcı olmak için kullanılmıştır. Analitik araç kutusunu kullanarak genel veri çıkışı Şekil 4 sıralı bir şekilde (4,1-4,4) sunulmuştur. Burada temel odak noktası, veri yorumlama ve tartışma alet kutusu yardımcı ziyade göstermek için dikkat çekicidir.

1. Başlangıçta, daha fazla mikroarray'ler analizi için deneysel koşullar seçmek için biyokimyasal ve RT-qPCR deneyleri bir araya getirme. Biyofilm gelişimi için karbonhidrat optimal konsantrasyonlarda S. seçmek için 6 farklı sakkaroz ve 5 farklı nişasta ve sukroz kombinasyonları test in vitro model kullanılarak mutans. Biyofilm içinde çözünmez exopolysaccharides (yüksek) miktarı ve gtfB (gelişmiş) ifadesi (çözünmez glukan sentezini sorumlu) dayalı üç özel konsantrasyonları (Şekil 4.1 vurgulanır) seçerek bize rehberlik biyoanalizlere aynı anda veri çıkışı incelemek yeteneği .
2. Mikroarray analizi. Diyet karbonhidrat seçilen (üç) konsantrasyonları biyofilm oluşturmak için kullanılır, biyofilm geliştirme sürecinin çeşitli aşamalarında yansıtan belirli bir zaman noktaları kaldırıldı. Biyofilmler (3 deney grupları ve 4 kez noktaları bölünmüş) BRB Dizi Araçlar ve MDV ile tüm genomik profili (DNA mikrodizinleri) birleştirerek transcriptome analizine tabi tutulmuştur.
   
   RNA ayıklanır ve biyofilm özel protokol ¹² kullanarak saflaştırılmış ve sonra Analitik Tool-Box 4 adım süreci boyunca analiz mikroarray tabi. Şekil 4.2 MDV sakaroz ve nişasta kombinasyonu, gelişmiş virülans S. (karsinojenik potansiyeli) ile ilgili özel transkripsiyonel yanıt tetikleyen çalışma hipotezi göre faiz genleri seçmek için nasıl yardımcı olduğunu göstermektedir biyofilm içinde mutans. BRB-ArrayTools (Şekil 4.2a) tarafından üretilen ham veri MDV Venn Şeması (Şekil 4.2b) kullanılarak işlendi. Bu çalışmada, grup hipotezine ilgili genlerin farklı karşılaştırma ifade A (% 0.5 sakkaroz +% 1 nişasta vs% 1 sakaroz) ve B (% 0.5 sakkaroz +% 1 nişasta vs% 0,5 'sakaroz), ama karşılaştırma C genler (% 0.5 sakkaroz vs% 1 sakkaroz) (Şekil 4.2a ve 4.2b). Şekil 4.2c de görüldüğü gibi, MDV genlerin analiz edilecek toplam sayısı önemli ölçüde azalır ve aynı zamanda kombinasyon halinde sakaroz ve nişasta etkisi doğrudan ilgili olmayan genlerin süzülmüş-out. MDV veri çıkışı nişasta, her biri farklı ifade edilen genlerin fonksiyonel sınıf (yukarı ve aşağı düzenlenmiş) tarafından organize edilen veriler gösteren bir grafik ekran + sakaroz-biyofilm (vs sakaroz yetişen biyofilm) her 4 kez noktaları (Şekil 4.3). MDV yazılım kullanıcı dostu ve büyük ve karmaşık veri madenciliği / kuruluş mikroarray deneyler ayarlar kolaylaştırdı.
3. Ayrıca bkz; Biyofilm görüntüleme Afrodisias, biyofilm yapısal organizasyonu COMSTAT-DUOSTAT-Amira kullanılarak analiz edildi (nişasta 3D yeniden yapılanma ve kantitatif analiz bir örnek görmek + Şekil 4.4 'de yetişen sakaroz biyofilm alet kutusu dahil Video makale). EPS ve mikrokoloniler morfolojisi, dağılımı ve yapısal ilişki Amira 3D yüzey sunumuna kullanarak görüntülenebilir. Seçilen alanın yakın kez microscale bakteri EPS özgü yapısal ilişkileri (Şekil 4.4) göstermektedir oluşturulabilir. Ayrıca, aynı konfokal görüntüleri COMSTAT biyokütle / microcolony ölçümleri, bakteri hücreleri ve aynı anda EPS mekansal dağılımı ve ko-DUOSTAT tarafından işlenebilir. Örneğin, EPS ve bakterilerin disk yüzeyinde sıvı faz dikey dağıtım COMSTAT DUOSTAT kullanarak üç boyutlu konfokal biyofilm görüntülerin her optik bölümünden hesaplanmıştır (Şekil 4.4 'de grafik, video makalesine bakın). Biyofilm derinliği boyunca bakteri (yeşil hat) daha EPS yüksek oranda (kırmızı çizgi) göstermektedir. Ayrıca, bakteri hücrelerinin çoğu, özellikle biyofilm orta ve dış katmanları, EPS (mavi çizgi) ile ilişkilidir. Bu gözlem, nişasta ve sukroz yetişen biyofilm exopolymers özellikle zengin olduğunu gösterir, (enmeshingbakteri hücreleri) en yakın temas halinde, bu tür yapısal kuruluşun ¹³ biyofilm istikrar ve bütünlük artırır. Üç boyutlu görüntüler ve konfokal görüntülerin nicel ölçümleri (nişasta S. mutans + sakaroz-yetiştirilen biyofilm GtfB-tipi çözünmez-glukan sentezini artan), biyokimyasal ve gen ekspresyonu verileri tamamlar biyofilm yapısı hakkında ek bilgi sağlar (ek ^{örnekler: 5, 6, 11, 13).}
   
   Analitik Aracı-Box nasıl S. kapsamlı bir analiz sağlanan farklı biyoanalizlere, veri almak, düzenlemek ve bütünleştirmek için bize yardımcı mutans (Klein ve ark, 2010 ⁷ ayrıntılarını görmek Klein ve ark, 2009 ^11), oral kavite bulundu diyet-host etkileşimlerin bir sonucu olarak karmaşık çevresel değişikliklere yanıt verebilir .

Şekil 1. Biyofilm Analiz Aracı-Box Analitik akış şeması.

Şekil 2 Biyofilmler EPS ve Bakterilerin Konfokal Floresans Görüntüleme. EPS (kırmızı) ve bakteri / Streptococcus mutans, biyofilm SHA disk yüzeyinde oluşan üç boyutlu render mikrokoloniler (yeşil) aynı anda görselleştirme.

Şekil 3 Mikroarray Veri Madenciliği ve Mikroarray veri görüntüleyici (MDV) Yazılım Kullanımı Örgütü. Ilgi genler seçin ve gen adı ve fonksiyonel sınıf ek açıklama eklenmesi ile takip Venn diyagramı özelliği kullanın.

Şekil 4.1 S. biyofilm oluşumu Değerlendirme biyokimyasal testleri (A) ve RT-qPCR (B) kullanarak mutans. INS (çözünmez exopolysaccharides) veri gtfB ifade deseni ile iyi bir korelasyon, ve biyofilmlerde biyokütle ile. Optimum biyofilm gelişimi için gerekli olan minimum konsantrasyon% 0.5 sakkaroz in vitro model kullanmakta iken% 1 Sakkaroz, maksimum INS oluşumu için konsantrasyon, SHA yüzeyinde gtfB ifade ve biyofilm birikimi S. % 0.5 sakkaroz varlığı yetiştirilen mutans hücreleri +% 1 nişasta, en yüksek biyokütle vermiştir ve gelişmiş gtfB ifade (B2) ile ilişkili diğer biyofilm, daha INS sundu . Bu karbonhidrat konsantrasyonları daha fazla transcriptome analiz için seçilmiştir.

Şekil 4.2. Mikroarray BRB-Dizi Araçları MDV yazılımı ile birlikte kullanarak veri analizi. a) her bir karşılaştırma (A, B veya C) ve BRB-Dizi Araçları kullanılarak değerlendirilmiştir bir zaman noktasında farklı olarak ifade olarak algılanır genlerin sayısı Temsil. b) Mikroarray veri görüntüleyici (MDV) faiz genleri seçmek için Venn şeması kullanarak. c) Genler MDV analiz göre seçilir.

Şekil 4.3 S. mutans genlerin farklı nişasta ifade + fonksiyonel sınıfı tarafından düzenlenen çeşitli noktalarında sakaroz-biyofilmler (vs sakaroz-biyofilm). Gen ek açıklamaları Los Alamos Ulusal Laboratuvarı (www.oralgen.lanl.gov) veya aynı web sitesi mevcut yayınlanmış literatür tarafından sağlanan bilgilere dayanmaktadır.

Şekil 4.4 Üç boyutlu render ve nişasta COMSTAT-DUOSTAT analizi + sakaroz-biyofilm.

Discussion

Bu sunumda, iki kritik bileşenleri Analitik Aracı-Box (EPS / bakteri görüntüleme ve mikroarray veri madenciliği / işleme), sisteme entegre çeşitli testlerin çok yönlülük ve yararlılığını göstermiştir. Açıktır ki, alet kutusu, bir in vitro model kullanarak farklı deneysel koşullar yanıt biyofilm biyokimya, mimari ve gen ekspresyonu çeşitli yönlerini kapsamlı (karşılaştırmalı) ve eş zamanlı analiz ^{kolaylaştırdı.} 7 dinamik ve karmaşık değişiklikler göz önüne alındığında S. yapısal organizasyonu, fizyolojik ve transcriptome yanıtları biyofilim mutans (ve diğer patojenleri), entegre bir analiz, biyofilm oral kavite patojenite modüle nasıl anlamak için yardımcı olabilir . Biz şu anda karışık türler biyofilm modelinde daha ayrıntılı olarak karmaşık ekolojik etkileşimleri ve yapısal değişiklikleri araştırmak için yeteneğini artıracak Analitik Aracı-Box türe özgü etiketleme ve metagenomic / metaprotemic analiz ^içeren 5

(Devam metaproteome ve sert yüzey analizi) ve oral biyofilm araştırma dışında adapte / uygulamalar için modifiye edilebilir Ayrıca, bu aracı (ve tüm biyoanalizlere) eklentileri ile esnek, yükseltilebilir. Örneğin, MDV gibi farklı (mutant) suşları karşılaştırmalı transcriptome ya da tedavi ajanları yanıt olarak birden fazla deneysel koşullar, karşılaştırma için tüm genomu profil kullanarak diğer biyofilm ilgili alanlarda özellikle yararlı olabilir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Syto 9	Invitrogen	S34854
Syto 60	Invitrogen	S11342
Dextran conjugated alexa 647	Invitrogen	D22914
Olympus FV1000 two-photon laser scanning microscope	Olympus Corporation