Summary
从小鼠的呼吸道和肺上皮细胞可以分离，气液界面的差异化的呼吸道上皮模式培养。协议是分离，培养，这些细胞暴露卷烟主流烟雾，为了研究这种环境毒素的分子反应。
Abstract
肺上皮细胞可以分离出小鼠的呼吸道及气 - 液界面（ALI）的培养作为一个差异化的呼吸道上皮模型。协议是描述卷烟主流烟雾（CS）隔离和揭露这些细胞，上皮细胞的反应，以研究为CS暴露。该协议由三部分组成：隔离的呼吸道上皮细胞从小鼠气管，气 - 液界面（ALI）作为完全分化的上皮细胞，这些细胞的培养，这些细胞在文化和校准主流CS交付。 ALI的文化系统允许的条件下，更接近于他们比普通的液体培养系统的生理设置的呼吸道上皮细胞的文化。接触到CS分子和肺癌细胞反应的研究是了解环境空气污染对人体健康的影响的关键组成部分。最终，在这方面的研究结果可能有助于了解慢性阻塞性肺疾病（COPD），及其他与烟草有关的疾病，这代表了重大的全球性健康问题的病因。
Protocol
整个协议需要2天从动物组织中的细胞，细胞增殖的5-10天，并在气 - 液界面的细胞分化的一个额外的10-14天的隔离。一个额外的一天所需的细胞暴露和样品的收获。
1。鼠标气管，支气管上皮细胞（MTEC）的分离。
注意：下面描述的所有程序进行了审查和批准机构的动物护理和使用布里格姆与妇女医院/哈佛医学院区委员。
在开始之前：
- 准备含有抗生素火腿的F12媒体。到250毫升火腿的F12（Cellgro）基底媒体添加2.50毫升的100 x青霉素/链霉素（10 2 U/mL-10 2毫克/毫升）溶液和250μL一个1000 X Fungizone解决方案。在4 ° C至4个星期的商店。
- 准备0.15％链霉蛋白酶的解决方案。添加15毫克链霉蛋白酶至10毫升火腿的F12含有抗生素的媒体。做出新的，使用之前保持冰。
- 准备一个干净的工作表面和无菌手术器械，适合于小动物手术，以及层状组织文化细胞隔离罩。所有其他设备被认为是动物细胞培养，包括加湿的CO 2孵化器，寒冷的房间，桌上细胞离心机，倒置显微镜，和一次性塑料吸管和文化制品的标准。
- 准备Ⅰ型胶原溶液（0.02 N醋酸50微克/毫升）。移液器1.0毫升到每12 Transwell小板（康宁）以及胶原蛋白的解决方案。包装在封口膜，让站在一个平坦的表面在室温下过夜。
- 使用市售的小鼠品系（即，C57BL / 6，男性6-8周龄），安乐死批准安乐死的方法，如CO 2，诱导麻醉的小鼠。通常情况下，6小鼠产生足够的细胞（1.5-2.0 × 10 5细胞/鼠标）种子12孔Transwell小板。
- 喷雾用70％乙醇溶液，消毒领域的动物尸体。
- 用干净的手术剪，手术刀，取出气管周围地区的皮肤，暴露气管。打开腹部，切沿胸骨，取出肋骨。删除组织，直到气管年底暴露。
- 到50 mL锥形管含有30毫升火腿的F12媒体含有抗生素，在冰上放置气管。
- 在无菌的板层流罩，气管组织转移到100毫米的无菌培养皿中含有10毫升火腿的F12媒体含有抗生素。
- 用无菌镊子和手术剪，轻轻地剖析结缔组织。
- 气管组织转移到一个新的100毫米的培养皿中含有10毫升火腿的F12媒体含有抗生素冲洗。暴露管腔沿垂直轴切气管。
- 气管转移到0.15％链霉蛋白酶溶液10毫升50毫升试管中孵育4℃过夜° C。
- 第二天，有准备：
- 准备一个DNA酶I溶液。火腿的F12媒体含有抗生素10 mg / mL的牛血清白蛋白（BSA）原液，加2 ml和原油胰腺DNA酶一10毫克设为1毫升分装保存在-20 ° C至18毫升（解冻上使用前的冰）。
- 准备含有20％胎牛血清（FBS），抗生素火腿的F12媒体。至200 ml火腿的F12（Invitrogen）的基底媒体添加50毫升热灭活胎牛血清，2.5毫升的100 x青霉素/链霉素（10 2 U/mL-10 2毫克/毫升）的解决方案，和250μL一个1000 X Fungizone解决方案。
- 准备MTEC基本培养基中含有抗生素。 475.5毫升的DMEM/F12（Cellgro）基本培养基中添加7.5毫升1 M羟乙基解决方案，10毫升200毫米谷氨酰胺的解决方案，2毫升7.5％的碳酸氢钠溶液，5毫升的100 x青霉素/链霉素溶液，500μL，一个1000 X Fungizone解决方案
- 准备MTEC medium/10％胎牛血清。 MTEC基本培养基含有抗生素要45毫升，加入5毫升热灭活胎牛血清。
- 轻轻摇动管（步骤1.8）10-12次，然后让它站立30-60分钟，在4 ° C。
- 添加10毫升火腿的F12媒体含20％胎牛血清和抗生素管和岩石的12倍。
- 准备3月15日毫升含有10毫升火腿的含有20％胎牛血清和抗生素的F12媒体的锥形管。
- 从链霉蛋白酶溶液中取出气管，撇开这个解决方案上的冰。传输气管含火腿的F12键的第一个锥形管和仰拱管的12倍。重复此过程两次。
- 结合三个步骤1.13上清到一个50 mL试管链霉蛋白酶的解决方案。丢弃余下的组织。
- 在1400rpm离心10分钟在4 ° C，并弃上清（390 XG的Eppendorf 5810R离心机配备了一架A - 4 - 62转子）。
- 轻轻重悬颗粒（100〜200μL/气管在1毫升DNA酶溶液）在冰上孵育5分钟。
- 在1400rpm（390 XG）离心5分钟，4 ° C，弃上清。
- 8毫升MTEC含10％胎牛血清的介质中，重悬细胞沉淀
- 盘上Primaria板的细胞悬液（猎鹰）。在37 ° C 95％的空气气氛中，5％CO 2为5小时（注：这是为成纤维细胞的负选择步骤）。
- 从板收集细胞悬液和冲洗，用4毫升MTEC含10％胎牛血清板的两倍。池细胞悬液和洗涤，在50 mL锥形管。
- 节约1毫升cytospin和细胞计数。在台式离心机旋转5分钟5000转（Eppendorf公司5415D）。在剩余的上清液中取出500μL和重新悬浮颗粒。使用100μL的细胞计数采用台盼蓝活体染色方法。保护cytospin分析4等分100μL
- 转速1400rpm（390 XG）余下的15 mL细胞悬液，在4 ° C为10分钟。
2。在气 - 液界面的繁殖和分化的MTEC
准备维甲酸股票方案。原液答：称取在黑暗中的视黄酸（议员300.44克/摩尔）在95％乙醇使一个5毫米的原液。商店在铝箔包裹管在-80 ° C根据需要，准备通过增加库存为50μL，500μL，BSA溶液（100毫克/毫升）和49.5毫升汉克的平衡盐溶液（HBSS）股票溶液B（5微米）。箔包裹于-80 ° C至4个星期的管店。
准备MTEC增殖培养基中含有维甲酸。为45.7毫升MTEC含有抗生素的基础介质，添加2.5毫升热灭活胎牛血清，1毫升维甲酸B股，250μL胰岛素溶液（2 mg / ml的4毫米盐酸胰岛素），250μL的表皮生长因子的解决方案（5微克/ mL的表皮生长因子在含有1 mg / mL的BSA哈佛商学院），200μL，牛垂体提取物（15毫克/毫升含1 mg / mL的BSA在哈佛商学院），50μL，转铁蛋白溶液（5 mg / mL的转含1 mg / mL的BSA在哈佛商学院），50μL霍乱毒素溶液（100毫克/毫升含1 mg / mL的BSA在哈佛商学院）。过滤消毒媒体的最后准备和使用在2天的准备。
- 取出Transwell小板的胶原溶液，让引擎盖下站立5分钟，用PBS洗涤2次。
- 离心后，悬浮细胞沉淀，以方便在适当的音量增殖媒体（500μL）7.5 × 10 4 -1.0 × 10 5细胞，每孔电镀。移液器500μL到Transwell小聚碳酸酯膜插入根尖表面细胞悬液。加入1.5毫升扩散介质基底的Transwell小仓。
- 淹没MTEC文化在37 ° C中含有95％的空气加湿孵化器，5％CO 2为7-10天。
- 等待在不断变化的媒体首次前3天。更改媒体隔日。通过目测和跨上皮细胞电阻测量电极（EVOM Ohmvoltometer，世界精密仪器，萨拉索塔，佛罗里达州）的监视器文化。
- 当细胞出现融合和上皮抵抗力达到1000Ω/ cm 2的细胞是准备在ALI的区分。
- 准备MTEC含有2％NuSerum的基础媒体。 MTEC基本培养基，添加NuSerum到终浓度为2％V / V维甲酸B股加入到终浓度为1 × 10-7中号后方可使用。准备好新鲜，并使用2天之内。
- 允许的细胞分化为10-14天，通过消除根尖媒体和750μL含有2％Nuserum和维甲酸的MTEC基底媒体取代基媒体，。更改基础的媒体和MTEC含2％NuSerum隔日用根尖方。
3。卷烟烟气中培养上皮细胞中的应用
- 揭露Transwell小文化的心尖的一面主流香烟烟雾中使用CS细胞曝光系统（EMI仪器，匹兹堡，宾夕法尼亚州）。仪器的照片，请参阅图1。请参阅特定的试剂和设备的技术规格表。简言之，该仪器由吸烟〜7-8喷香烟，主流烟绘制成一个聚丙烯生产线，是连接到一个通风曝光室蠕动泵。曝光室保持在37℃，循环水，气行，并保持在5％的CO 2的气氛。细胞可以接触到的烟雾使用肯塔基3R4F研究参考的过滤嘴卷烟（烟草研究所，肯塔基大学，肯塔基州列克星敦）。通常情况下，细胞暴露在1-2香烟的烟雾，总颗粒物（TPM）的高产100-200毫克/米3。控制文化暴露于室内空气相当于暴露期。
- TPM是根据制造商的协议，与TE提供- 10C吸烟机（蒂格企业）。简单地说，一个过滤器（Pallflex）被放置在一个行内领先的吸烟腔，一个恒流泵（抽样单位）从取样口取样管上的不锈钢架。流出管连接到燃气表（干式煤气表，ONM61，67，美国设备制造商协会）的抽样单位。该过滤器是权衡前后气体取样。总材料沉积在毫克的过滤器是空气采样量正常化。
- 收获细胞，然后可以在任何时间点（即0-24小时）暴露后的标准单元分析程序（即，西方免疫印迹分析，基因分析等）或显微镜（即焦或电子显微镜）。培养基中还可以分析细胞因子或LDH的释放细胞毒性检测。
4。代表性的成果
扬智成功上皮分离，增殖，并分化产生一个完整的单层与鹅卵石形态。 Transepithelilal细胞性健康文化应约1000-2000Ω/厘米2。图2描绘了一个单层的上皮细胞和纤毛标记染色控制的情况下，香烟烟雾暴露后的小鼠呼吸道上皮细胞。图3显示了健康MTEC文化代表性的电子显微照片，描绘超微结构和纤毛形态。
图1。上皮细胞通过三个阶段，隔离一步，传播阶段，并在气-液界面（计划）的分化阶段所得的制备。种子，在那里他们深层培养增殖到transwells，从小鼠气管上皮细胞分离，然后转换成气 - 液界面，他们完全区分。实验通常是进行连续培养24 日 。画面描绘了一个模型系统主流香烟烟雾中的培养细胞暴露。一个Transwell小阿里文化系统被放置在一个自定义的模块化香烟烟雾中的输送系统，这是温度，湿度和CO 2控制。
图2上皮细胞培养，原子核固定和染色（Hoechst 33258荧光），F -肌动蛋白（绿色; Alexa的福陆公司的488 -标记的鬼笔环肽） 和纤毛标记的乙酰化的α-微管蛋白（红色; Cy3标记标记的二抗）。较低的面板显示图像相当于4小时后，暴露在香烟烟雾（2支香烟，150 毫克 /立方米）的上皮细胞。 （二）测定乳酸脱氢酶（LDH）释放在24小时后暴露在香烟烟雾中的不同剂量表示的培养基。
图3。上皮细胞从小鼠气管上皮分离气-液界面培养区分几个亚型，通过透射电子显微镜（TEM）有纤毛，基底和非纤毛细胞的特点。这些细胞典型假的呼吸道上皮。图标签对应：BB：基体，轴丝，M：线粒体，N：细胞核，S：基板（聚碳酸酯膜），MV：microvili
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Discussion
协议描述小鼠气管上皮细胞的分离，是改编自你等的协议 ，1，和其他修改2-3。至于任何协议，描述细胞的隔离，最关键的环节，以避免细菌或真菌病原体的污染，采用严格的无菌操作技术。第二个关键步骤，以避免成纤维细胞污染的文化，可避免的气管仔细解剖，和阴性选择步骤1.19。文化监控，洗净，和文化传媒补充隔日最初的72小时孵化后，应充分区分文化在大约两个星期，从开始的ALI。
慢性阻塞性肺疾病（COPD），这在很大程度上是由慢性香烟烟雾暴露造成的，继续是一个主要的全球性健康问题 4-7 。慢性阻塞性肺病，特点是累进气流受限，破坏肺泡损失（肺气肿），夸张的炎症反应和香烟烟雾 4-7肺。大量的研究已经使用的肺泡，支气管，和呼吸道上皮细胞系统试图模型肺细胞反应到CS。这些研究中，有许多在上皮细胞或转换线（即，BEAS - 2B）进行，请参阅文献的例子 8-11 。阿里Transwell小文化系统允许的文化时尚，接近其生理倾向，在气道比可以通过提供传统的液体（淹没） 文化 1-3，肺上皮细胞。虽然功能的协议描述了这个系统的应用程序鼠标气管小学文化1，原则上其他主要的上皮细胞可应用于（即鼠标II型上皮细胞，人支气管上皮细胞等）。生活的主流CS应用细胞培养，代表一个模式，或许更接近人类暴露比水香烟烟雾提取物（CSE），这是常见的用于细胞研究的CS 曝光 12-15的应用程序到CS。 CSE代表了主流烟雾，缺乏整体烟雾的许多化学成分的可溶部分。虽然两者CS曝光系统有其局限性，自定义搜索引擎更容易校准的优势，因为一个单一的准备可以用于多个实验，并投加稀释 15-16取得。另一方面，我们在这里包括主流烟雾交付基于TPM的测量量化的方法。澄清的分子和细胞毒素暴露，尤其是CS在这篇文章中体现，将进一步了解空气污染对人体健康的影响，尤其是肺部慢性疾病的病因。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢技术援助和博士Shivraj Tyagi埃梅卡Ifedigbo宝贵的专业知识。我们也感谢哈佛NeuroDiscovery中心与显微镜的帮助。这项工作是支持部分由美国心脏协会授予09PRE2250120 Predoctoral林Hilaire指出，与美国国立卫生研究院拨款，以R01 - HL60234，R01 - HL55330，R01 - HL079904，授予AMK的财。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine |
| Pen/strep | Lonza Inc. | 17-602E | |
| Pronase | Roche Group | 10165921001 | Streptomyces griseus |
| Collagen I | BD Biosciences | 354236 | From rat tail |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 338826-25 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25-100MG | From Bovine Pancreas |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Without Ca++ or Mg++ |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-100ML | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | 200 mM |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 16634-50MG | Bovine Pancreas |
| Apo-transferrin (human) | Sigma-Aldrich | T1147-100MG | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Vibrio Cholerae |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | |
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | |
| Transwell | Corning | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon BD | 353803 | |
| Pallflex membrane | Pall Corporation | EMFAB TX40H120-WW | |
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14"x14"x20" Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2" thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2" size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2’ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector. This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com). |
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References
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