Summary
Легочная эпителиальных клеток может быть изолирована от респираторного тракта мышей и культивировали при воздушно-жидкостной интерфейс, модель дифференцированных дыхательного эпителия. Протокол описан для выделения, культивирования и разоблачение этих клеток в дыме сигарет, с целью изучения молекулярного ответов на этот экологических токсинов.
Abstract
Легочная эпителиальных клеток может быть изолирована от респираторного тракта мышей и культивировали при воздушно-жидкостной интерфейс (ALI) в качестве модели дифференцированных дыхательного эпителия. Протокол описан для изоляции и разоблачение этих клеток дыме сигарет (CS), с целью изучения эпителиальные клеточные реакции на воздействие CS. Протокол состоит из трех частей: изоляции дыхательных путей эпителиальные клетки мыши трахеи, культивирования этих клеток на воздух-жидкость (ALI) как полностью дифференцированные клетки эпителия, а также доставку калиброванный основной CS этих клеток в культуре. Система АЛИ культуры позволяет культуры эпителия дыхательных в условиях, которые больше напоминают их физиологические настройки по сравнению с обычными системами культуральной жидкости. Изучение молекулярных и легких клеточных реакций на воздействие CS является критически важным компонентом понимания воздействия загрязнения окружающей среды воздуха на здоровье человека. Результаты исследований в этой области в конечном итоге может способствовать пониманию этиологии хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ), а также других связанных с табаком болезней, которые являются основными глобальными проблемами со здоровьем.
Protocol
Общий протокол требует 2-х дней для сотовых выделения из тканей животных, 5-10 дней для пролиферации клеток, а также дополнительные 10-14 дней для клеточной дифференцировки в воздух-жидкость. Дополнительный день требуется для сотовых экспозиции и сбор образцов.
1. Выделение мышью трахеобронхиального эпителиальных клеток (MTEC).
Примечание: все процедуры, описанные ниже, были рассмотрены и одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитетом на Бригам и женской больницы / Гарвардской медицинской школы района.
Перед началом работы:
- Подготовка Хэма F12 Среды, содержащие антибиотики. К 250 мл Хэма F12 базальной СМИ (Cellgro) добавить 2,50 мл 100 X пенициллина / стрептомицина (10 2 U/mL-10 2 мг / мл) раствора и 250 мкл раствора 1000 X Fungizone. Хранить при температуре 4 ° С до 4 недель.
- Приготовьте раствор 0,15% проназы. Добавить в дозе 15 мг проназы до 10 мл F12 СМИ Хэма, содержащие антибиотики. Сделать свежее и держать на льду до использования.
- Подготовка чистую рабочую поверхность и стерильных хирургических инструментов подходит для небольших операции животное, и пластинчатые капот культуры ткани для сотовых изоляции. Все прочее оборудование считается стандартом для животных культуры клеток, включая увлажненные CO 2-инкубаторов, холодная комната, настольный ячейки центрифуг, инвертированный микроскоп, и одноразовые пластиковые пипетки и культуры посуды.
- Подготовка коллагена I решение (50 мкг / мл в 0,02 N уксусной кислоты). Внести по 1,0 мл раствора коллагена в каждую лунку по 12 хорошо transwell пластины (Corning). Заверните в парафильмом и дать постоять ночь на плоской поверхности при комнатной температуре.
- Использование коммерчески доступных мыши штамм (т.е. C57Bl / 6, мужчин 6-8 недель), усыпить мышей использованием утвержденного метода эвтаназии, таких как CO 2-индуцированного наркоза. Как правило 6 мышей даст достаточное количество клеток (1,5-2,0 х 10 5 клеток / мышь), чтобы семена 12-а transwell пластины.
- Спрей туш животных с 70% этанола решение для стерилизации области.
- С чистыми хирургических ножниц и скальпеля, удалить кожу вокруг трахеи области, и подвергать трахеи. Открытый живот, разрезать вдоль грудины и удаления грудной клетки. Удаление ткани до конца трахеи подвергается.
- Место трахеи в 50 мл коническую трубку, содержащую 30 мл Хэма F12 средах, содержащих антибиотики, на льду.
- В стерильных пластинчатые капот потока, передачи ткани трахеи стерильным 100 мм чашки Петри, содержащие 10 мл Хэма F12 средах, содержащих антибиотики.
- Осторожно рассекают соединительной ткани стерильным пинцетом и хирургические ножницы.
- Передача трахеи ткани нового 100 мм чашки Петри, содержащие 10 мл Хэма F12 средах, содержащих антибиотики для полоскания. Вырезать трахеи вдоль вертикальной оси, чтобы разоблачить просвет.
- Передача трахеи на 50 мл пробирку, содержащую 10 мл 0,15% раствора и проназы инкубировать в течение ночи при 4 ° C.
- На второй день, имели легкий:
- Приготовьте раствор ДНКазы я. Для 18 мл F12 СМИ Хэма, содержащие антибиотики добавляют 2 мл 10 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА) маточного раствора и 10 мг сырой поджелудочной ДНКазы I. Сделать 1 мл аликвоты и хранят при температуре -20 ° С (от талых лед перед использованием).
- Подготовка Хэма F12 средах, содержащих антибиотики с 20% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота (ФБС). К 200 мл Хэма F12 базальной СМИ (Invitrogen), добавить 50 мл теплой инактивированной FBS, 2,5 мл 100 X пенициллина / стрептомицина (10 2 U/mL-10 2 мг / мл) раствора, и 250 мкл раствора 1000 X Fungizone .
- Подготовка MTEC щелочной среде, содержащей антибиотики. Чтобы 475,5 мл DMEM/F12 основные средства массовой информации (Cellgro) добавить 7,5 мл 1 М HEPES раствор, 10 мл 200 мМ глутамина решение, 2 мл 7,5% раствор NaHCO 3, 5 мл 100 X пенициллина / стрептомицина раствор, 500 мкл решения 1000 X Fungizone
- Подготовка MTEC medium/10% FBS. Для 45 мл MTEC щелочной среде, содержащей антибиотики, добавляют 5 мл инактивированной тепла FBS.
- Осторожно трубки (из шага 1.8) в 10-12 раз, а затем оставить на 30-60 минут при температуре 4 ° C.
- Добавьте 10 мл Хэма F12 среде, содержащей 20% FBS и антибиотиков для трубы и рока в 12 раз.
- Подготовка 3 15 мл конические пробирки, содержащие 10 мл Хэма F12 среде, содержащей 20% FBS и антибиотики.
- Удалить из трахеи проназы решение, отложив в сторону этого решения на льду. Передача трахеи сначала конической трубки, содержащей F12 Хама и инвертировать трубы 12 раз. Повторите эту процедуру еще два раза.
- Комбинат проназы решение с тремя супернатантах с шага 1,13 в одну 50 мл трубки. Удалите оставшиеся ткани.
- Центрифуга на 1400rpm (390 мкг; Eppendorf 5810R центрифуга оснащена-4-62 ротор) в течение 10 мин при 4 ° С, и отбросить супернатант.
- Аккуратно ресуспендируют осадок в 1 мл раствора ДНКазы (100-200 мкл / трахеи)и инкубировать 5 мин на льду.
- Центрифуга на 1400rpm (390 мкг) в течение 5 мин при 4 ° С, и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют осадок клеток в 8 мл MTEC среде, содержащей 10% FBS
- Пластина клеточной суспензии на пластинах Primaria (Falcon). Инкубировать при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха, 5% СО 2 в течение 5 часов (Примечание: это отрицательный шаг отбора на фибробласты).
- Сбор клеточной суспензии из плит и промыть пластины в два раза с 4 мл MTEC, содержащей 10% FBS. Бассейн суспензии клеток и моет вместе в 50 мл коническую трубку.
- Экономия 1 мл для цитоспина и подсчета клеток. Спина в настольные центрифуги в течение 5 мин при 5000 оборотов в минуту (Eppendorf 5415D). Удалить 500 мкл и ресуспендируют осадок в оставшиеся супернатант. Используйте 100 мкл для подсчета клеток использованием Голубой Трипан жизненно метод окрашивания. Экономия 4 порции по 100 мкл для анализа цитоспина
- Спиновые оставшиеся 15 мл клеточной суспензии при 1400rpm (390 мкг), при 4 ° С в течение 10 мин.
2. Размножение и дифференциация MTEC В воздух-жидкость
Подготовка ретиноевой растворы кислот. Маточного раствора: Взвесьте ретиноевой кислоты в темноте (г-н 300,44 г / моль), чтобы сделать 5 мМ маточного раствора в 95% этанола. Хранить в фольге трубки при температуре -80 ° C. В случае необходимости, подготовить исходный раствор B (5 мкМ) добавлением 50 мкл месте A, 500 мкл раствора BSA (100 мг / мл) и 49,5 мл сбалансированной Хэнка солевом растворе (HBSS). Хранить в фольге трубки при температуре -80 ° С до 4 недель.
Подготовка MTEC распространения среде, содержащей ретиноевой кислоты. До 45,7 мл MTEC базальной среде, содержащей антибиотики, добавить 2,5 мл тепла инактивированной ФБС, 1 мл ретиноевой кислотой Stock B, 250 мкл раствора инсулина (2 мг / мл инсулина в 4 мМ HCl), 250 мкл эпидермального фактора роста решения (5 мкг / мл ЭФР в HBS, содержащего 1 мг / мл BSA), 200 мкл бычьего гипофиза экстракта (15 мг / мл в HBS, содержащего 1 мг / мл BSA), 50 мкл решение трансферрина (5 мг / мл трансферрина в HBS, содержащего 1 мг / мл BSA ), 50 мкл холерного токсина решение (100 мг / мл в HBS, содержащего 1 мг / мл BSA). Фильтры стерилизовать окончательной подготовки и использования средств массовой информации в течение 2 дней подготовки.
- Удалить коллагена решение из плит transwell, дать постоять под капотом в течение 5 минут и смойте с PBS в 2 раза.
- После центрифугирования, ресуспендируют осадок клеток в соответствующий объем распространения средств массовой информации (500 мкл) для облегчения покрытия от 7,5 х 10 4 -1,0 x10 5 клеток на лунку. Внесите 500 мкл суспензии клеток на апикальной поверхности мембраны вставить transwell поликарбоната. Добавить 1,5 мл распространения средств массовой информации к базисной отсеке transwell.
- Инкубируйте погруженных культурах MTEC при 37 ° С в увлажненной инкубатор содержащий 95% воздуха, 5% СО 2 в течение 7-10 дней.
- Подождите три дня, прежде чем изменять СМИ впервые. Изменение средств массовой информации каждый день. Монитор культур путем визуального осмотра и измерения трансэпителиальная сопротивление ячейки с помощью электрода (EVOM Ohmvoltometer, инструменты Всемирного Precision, Сарасоте, штат Флорида).
- Когда клетки появляются сливной и эпителиальных сопротивление достигает 1000 Ω / см 2, клетки готовы дифференцируема в АЛИ.
- Подготовка MTEC базальной средах, содержащих 2% NuSerum. Добавить к NuSerum MTEC щелочной среде до конечной концентрации 2% V / V. Добавить ретиноевой B со кислоты до конечной концентрации 1 х 10 -7 М, прежде чем использовать. Подготовка свежей и употребить в течение 2 дней.
- Разрешить ячейка дифференцировать в течение 10-14 дней, удалив апикальной СМИ и замены базальной среды с 750 мкл MTEC базальной средах, содержащих 2% Nuserum и ретиноевой кислоты. Изменение базальной СМИ и мыть апикальной стороне MTEC, содержащий 2% NuSerum через день.
3. Применение сигаретного дыма в культивированный эпителиальных клеток
- Expose апикальной стороне культур transwell по учету сигаретного дыма использованием воздействия CS клеточной системы (EMI инструменты, Питтсбург, Пенсильвания). См. рисунок 1 для фотографии аппарата. См. Таблицу конкретных реагентов и оборудования для технической спецификации. Короче говоря, аппарат состоит из перистальтического насоса, который курит каждая сигарета в ~ 7-8 затяжек, основываясь в основном потоке дыма в линию полипропилена, который подключен к камере вентилируемые экспозиции. Экспозиции камеры поддерживается на уровне 37 ° С циркулирующей водой, и выдерживают при атмосфере 5% CO 2 на газовой линии. Клетки могут подвергаться воздействию дыма использованием Кентукки 3R4F исследования ссылкой сигарет с фильтром (Табак-исследовательский институт, Университет штата Кентукки, Лексингтон, штат Кентукки). Обычно клетки подвергаются воздействию дыма от 1-2 сигарет, уступая 100-200 мг / м 3 от общего числа твердых частиц (TPM). Контрольные культуры подвергаются воздействию воздуха в помещении за аналогичный период экспозиции.
- TPM измеряется в соответствии с протоколом производителя поставляются с TE-10c курительной машины (Тиг предприятий). Короче говоря, фильтр (Pallflex) помещается в встроенный держатель из нержавеющей стали на отбор проб трубки, ведущие от выборки порт на курение камеры постоянного насоса (единица выборки). Отток трубка соединяет единицы выборки для счетчика газа (сухой метр газа, ONM61, 67, AEM). Фильтр взвешивается до и после взятия проб газа. Всего материала осаждается на фильтре в мг нормированная на общий объем воздуха, отобранного.
- Клетки могут затем быть собраны в любой момент времени (то есть 0-24 часов) после экспозиции для стандартной ячейки процедуры аналитического (то есть, западные иммуноблот анализ, анализ мРНК и т.д.) или микроскопии (то есть, конфокальной и электронной микроскопии). Питательные среды также могут быть проанализированы для цитокинов или ЛДГ выпуска для цитотоксичности.
4. Представитель Результаты
Успешное эпителиальных изоляции, пролиферацию и дифференциацию в АЛИ должно дать нетронутыми монослоя с булыжником морфологии. Transepithelilal сопротивление ячейки здоровых культур должна быть примерно 1000-2000 Ω / см 2. На рисунке 2 представлена монослоем мыши дыхательных эпителиальных клеток, окрашенных для эпителиальных клеток и ресничек маркеры под контролем условиях и после воздействия дыма сигарет. На рисунке 3 показана представитель электронного микроскопа здорового MTEC культур, изображающих ультраструктуры ресничек и морфологии.
Рисунок 1. Подготовка эпителиальные клетки доходов через три фазы, изоляция шаг, распространения стадии, и стадии дифференцировки в воздух-жидкость (схема). Эпителиальные клетки изолированы от мыши трахеи, отобранный на transwells, где они размножаются в условиях погружения в культуру, а затем конвертируются в воздух-жидкость, где они в полной мере дифференцировать. Эксперименты, как правило, проводится на 24-й день непрерывной культуры. Картина изображает модельной системы для воздействия культивируемых клеток в дыме сигареты. Культуры transwell АЛИ система находится внутри пользовательских модульной сигаретного дыма система доставки, которая контролируется по температуре, влажности и CO 2.
Рисунок 2 Эпителиальные культурах клеток фиксировали и окрашивали для ядер (Hoechst 33258), F-актин (зеленый; Alexa Fluor-488-сопряженных фаллоидином). Реснички и маркер ацетилированного α-тубулина (красный; Cy-3-сопряженных вторичные антитела). Нижней панели показывают изображение эквивалентное эпителиальных клеток, взятых через 4 часа после воздействия сигаретного дыма (2 сигарет, 150 мг / м 3). (B), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) выпуск был измерен в базальной среды 24 часов после воздействия различных доз сигаретного дыма, как указано.
Рисунок 3. Воздух-жидкость культурах эпителиальных клеток, выделенных из мышиных эпителия трахеи дифференцироваться в несколько подтипов, что методом просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) имеют характеристики мерцательного, базально-и не-ресничные клетки 1. Эти клетки типичны псевдомногослойный дыхательного эпителия. Рис этикетки соответствуют: BB: базального тела,: аксонемы, м: митохондрии, п: ядро, с: подложки (поликарбонатные мембраны), М. В.: microvili
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол описания изоляции мыши трахеи эпителиальных клеток взята из протоколов Вы и соавт., 1, и другие 2-3 с изменениями. Как и любой протокол описания выделения ячейки, наиболее важным аспектом является то, чтобы избежать загрязнения от бактериальной или грибковой патогенов с помощью строгой асептики. Второй критический шаг, чтобы избежать загрязнения фибробластов культур, которые можно избежать, осторожно рассечение трахеи и негативный отбор, как описано в шаге 1.19. При условии, что культур контролируются, умылся и питательных сред пополняется через день после первого 72-часовой инкубации культур должны полностью отличаться примерно в две недели с начала АЛИ.
Хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), которая во многом вызвана хроническим воздействием сигаретного дыма, по-прежнему являются одной из основных проблем глобального здравоохранения 4-7. ХОБЛ характеризуется прогрессирующим ограничением воздушного потока, разрушительная потеря альвеолярной (эмфизема), и преувеличенные воспалительные реакции в легких, чтобы сигаретный дым 4-7. Большое число исследований используются альвеолярно, бронхов, и дыхательных путей эпителиальных клеточных систем попытаться модель легкого ответы на CS. Многие из этих исследований были проведены в эпителиальные клетки или превращаются линии (то есть, Беас-2b), см., например, 8-11 для примеров. Культуры АЛИ transwell система позволяет культуре легочной эпителиальных клеток в моде, которая ближе к их физиологической ориентации в дыхательные пути, чем тот, который может быть обеспечен обычными жидкости (погруженной) культуры 1-3. Хотя признакам протокол описывает применение этой системы для мыши трахеи первичных культур 1, в принципе других первичных эпителиальных клеток может быть применен (например, мышь Тип II эпителиальных клеток, прав бронхиальных эпителиальных клеток и т.д.). Применение живой основной CS для клеточных культур представляет собой модель, которая, возможно, более приближен воздействия на человека CS, чем применение водной вытяжки дыма сигарет (CSE), который обычно используется в сотовых исследования CS экспозиции 12-15. ЕГЭ представляет растворимой фракции дыме, что не хватает многих химических компонентов целого дыма. Хотя обе системы CS воздействия имеют ряд ограничений, CSE имеет то преимущество, что более легко калибровать, поскольку один препарат может быть использован для нескольких экспериментов, и дозирования достигается путем разбавления 15-16. С другой стороны, мы включаем сюда метод количественной основных доставки дыма на основе TPM измерений. Выяснение молекулярных и клеточных реакций на воздействие токсинов, в частности CS примером в этой статье, будет способствовать дальнейшему пониманию воздействия загрязнения воздуха на здоровье человека, в частности этиологии хронических заболеваний легких.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим Эмека Ifedigbo для оказания технической помощи и доктора Шиврадж Тяги за ценные знания. Мы также благодарим Центр Гарвардского NeuroDiscovery за помощью микроскопии. Эта работа была выполнена при частичной поддержке Американской ассоциации сердца Predoctoral грант 09PRE2250120 к Илер Лам, и NIH гранты, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, присуждена АМК Чой.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ham’s F12 Medium 1X | Cellgro | MT-10-080-CM | With L-glutamine |
| Pen/strep | Lonza Inc. | 17-602E | |
| Pronase | Roche Group | 10165921001 | Streptomyces griseus |
| Collagen I | BD Biosciences | 354236 | From rat tail |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 338826-25 | |
| DNaseI | Sigma-Aldrich | DN25-100MG | From Bovine Pancreas |
| Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605-100 | Fraction V |
| Retinoic Acid | Retinoic Acid | R265-50MG | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Without Ca++ or Mg++ |
| DMEM-F12 | Cellgro | MT-15-090-CM | Without L-Glutamine or HEPES |
| HEPES, 1M in H2O | Sigma-Aldrich | 83264-100ML | |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | 200 mM |
| Amphotericin B (Fungizone) | Fisher Scientific | 1672346 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 16634-50MG | Bovine Pancreas |
| Apo-transferrin (human) | Sigma-Aldrich | T1147-100MG | |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Vibrio Cholerae |
| Epidermal growth factor | BD Biosciences | 354001 | Mouse |
| Bovine pituitary Extract | BD Biosciences | 354123 | |
| NuSerum | BD Biosciences | 355100 | |
| Transwell | Corning | 3401 | 12 mm, 0.4 mm Pore Polycarbonate |
| Primaria 100 mm culture dish | Falcon BD | 353803 | |
| Pallflex membrane | Pall Corporation | EMFAB TX40H120-WW | |
| Smoking Machine | EMI Services | ATCSALI-1 | see Footnote* |
*The cigarette smoking machine is a custom designed and fabricated 14"x14"x20" Dual chambered and water jacketed light tint clear proof 1/2" thick polycarbonate Lexan chamber for cigarette smoke exposure with temperature controlled, water level sensor controlled shut off system. A cigarette smoking/puffing unit is installed for a variable cigarette puffing rates. When the unit is in use, it mimics an incubator in the sense that the temperature, humidity and carbon dioxide are controlled in the system. The system includes: (I) a customized dual chamber/water jacketed unit that maintains a controlled environment for tissue culture experiments. (II) A digital heavy duty, high precision dual pump water temperature circulator system with water level sensor and temperature control (III) A cigarette smoking unit with puffing pump. (IV) A pump cycle sensor control rate cycler (IV) A Stainless steel high precision in-Line filter holder. (V) A Detachable lid mounted 11/2" size axial uniformity cigarette smoke mixing fan. (VI) A medium size water bath with mounting bracket for the water circulator. (VII) A 1/2’ thick Plexiglas tray with brackets for the puff pump and holder for cigarette ash collector. This machine as described can be substituted with similar commercially-available smoking machines such as the kind available from TSE systems (www.tse-systems.com). |
|||
References
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).
- Davidson, D. J. Murine epithelial cells: isolation and culture. J. Cyst. Fibros. 2, Suppl 3. 59-62 (2004).
- Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).
- Rabe, K. F. et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).
- Macnee, W. Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).
- Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective. Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).
- Yao, H., Rahman, I. Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).
- van der Toorn, M. Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).
- Slebos, D. J. Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).
- Kim, H. P. Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1. Autophagy. 4, 887-895 (2008).
- Chen, Z. H. Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease. PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).
- Okuwa, K. In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens. Exp Toxicol Pathol. , Forthcoming (2009).
- St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure. Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).
- Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro. J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).
- Rennard, S. I.
- Shapiro, S. D.
