Summary
mStrawberry OP9 cellen zorgen voor volledige evaluatie van alle ES-afgeleide nakomelingen van co-cultuur.
Abstract
De in vitro differentiatie van embryonale stamcellen tot een lot van hematopoietische cellen is nuttig bij het bestuderen van celpopulaties die moeilijk toegang in vivo en voor het karakteriseren van de vroegste genen die betrokken zijn bij hematopoiese, zonder dat te maken met embryonale letaliteit. De ES/OP9 co-cultuur systeem is oorspronkelijk ontworpen om hematopoietische nakomelingen te produceren, zonder dat de overproductie van macrofagen, zoals de OP9 stromale cellijn is afgeleid van de Calvaria van osteopetrose mutante muizen dat het gebrek aan functionele M-CSF. De in vitro ES/OP9 co-cultuur systeem kan worden gebruikt om de vroege hematopoietische ontwikkeling samenvatten. Wanneer gekweekt op OP9 stromale cellen, ES-cellen differentiëren tot Flk-1 + hemangioblasts, hematopoëtische voorlopercellen, en tenslotte volwassen, terminaal gedifferentieerde lijnen. De standaard ES/OP9 co-cultuur protocol omvat de plaatsing van ES-cellen op een confluente laag OP9 cellen, evenals, periodieke replating stappen om oude te verwijderen, besmetten OP9 cellen. Bovendien, de huidige protocollen betrekking hebben op de evaluatie van alleen de hematopoietische cellen in suspensie en zijn niet geoptimaliseerd voor de evaluatie van ES-afgeleid nakomelingen op elke dag van differentiatie. Echter, met replating stappen en de oogst van slechts een suspensie cellen mist mogelijk een groot deel van ES-afgeleid nageslacht en het ontwikkelen van hematopoietische cellen. Deze kwestie wordt van belang aan te pakken wanneer het proberen om hematopoietische afwijkingen geassocieerd met knock-out-ES lijnen karakteriseren. Hier beschrijven we een gemodificeerde ES / mStrawberry OP9 co-cultuur, die zorgt voor de verwijdering van vervuilende OP9 cellen van stroomafwaarts assays. Deze methode maakt het mogelijk om volledige evaluatie van alle ES-afgeleide nakomelingen op alle dagen van co-cultuur, wat resulteert in een hematopoietische differentiatie patroon, die meer direct overeenkomt met de hematopoietische differentiatie patroon waargenomen binnen de embryo.
Protocol
1. Voorbereiding van de ES-cellen
- Cultuur ES-cellen volgens de standaard protocol voor uw specifieke cellijn. Zorg ervoor dat u voldoende ES cellen voor te bereiden op plaat op van de mStrawberry OP9 cellen voor Dag van 0 (ES-cellen worden uitgeplaat op 1x10 ^ 3 cellen per cm 2 op dag 0)
2. Voorbereiding van de OP9 cellen
- Voordat groeiende mStrawberry OP9 cellen, de voorbereiding van de OP9 groeimedia
OP-9 celcultuurmediumVoorraad Final conc. Volume (ml) aMEM 39,5 FBS (OP-9 getest) 100% 20% 10 L-glutamine 100X (200mm) 2 mM 0.5 50ml
Bewaren bij 4 ° C en te gebruiken binnen een week van voorbereiding - Met het oog op mStrawberry OP9 cellen te behouden, moeten de media worden veranderd om de 2 dagen en cellen moeten voorafgaand aan de cellen te bereiken confluentie (subcultuur bij 70-90% confluentie) worden subcultuur. mStrawberry OP9 celkweken zijn nooit groter geworden dan 90% confluentie, omdat dit zal resulteren in hun differentiatie tot adipocyten. Zie figuur 3.
- Subcultuur cellen door cellen te wassen 2X met PBS (of 1x met PBS + 1x 0,1% met trypsine-EDTA)
- Voeg voorverwarmde 0,1% trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5 minuten (of tot de cellen los)
- Wanneer de cellen hebben losgemaakt, voeg OP-9 groeimedium. Overdracht cellen om een 50 ml conische buis.
- Pellet cellen op 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder supernatans.
- Resuspendeer cellen in verse mStrawberry OP9 groeimedia
- Plaat cellen met een minimum dichtheid van 10 4 cellen / cm 2
- Grow mStrawberry OP9 cellen confluentie vanaf 3 dagen voor dag die nodig zijn voor co-kweken van embryonale stamcellen (dag 0, dag 5, of Day8 / 9 van het experiment)
3. ES / mStrawberry OP9 Co-cultuur
- Bereid Co-cultuur differentiatie media
Voorraad Finale Volume (ml) aMEM 39,5 FBS 100% 20% 10 L-glutamine 200MM 2 mM 0.5 50ml - mStrawberry OP9 cellen (dag -3)
- ALTIJD Subculture OP9 cellen op dag -3, zodat u de samenvloeiing lagen mStrawberry OP9 cellen voor dag 0 van de co-cultuur. Zie Figuur 4b. Plaat mStrawberry OP9 cellen bij 1x10 4 / cm 2 voor confluentie op dag 0. Zorg ervoor dat u subcultuur extra cellen voor dag 5 en dag 8 / 9 voor de voortzetting van de co-cultuur.
- ES / mStrawberry OP9 co-cultuur Set-Up (Day 0)
- Was de ES-cellen 2x met PBS
- Trypsinize ES-cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA, incubeer gedurende 5min @ 37 ° C
- Add Co-cultuur differentiatie media aan cellen
- Pellet ES-cellen in 400xg, 5-7min, RT. Gooi supernatans
- Resuspendeer cellen in co-cultuur differentiatie media
- Verwijder het afdrukmateriaal uit mStrawberry OP9 cellen
- Add Co-cultuur differentiatie media mStrawberry OP9 kolven
- Plaat 1x10 3 ES-cellen / cm 2 tot en met fles mStrawberry OP9 cellen. Incubeer cellen bij 37 ° C, 5% CO 2 met vocht.
- mStrawberry OP9 cellen (dag 2)
- Subcultuur mStrawberry OP9 zodat je samenvloeiing lagen mStrawberry OP9 cellen voor dag 5 van co-cultuur. Plaat mStrawberry OP9 cellen bij 1x10 4 / cm 2 voor confluentie op dag 5 (zoals in stap 3.2). Zorg ervoor dat u subcultuur extra cellen voor Dag 8 / 9, indien nodig (zoals in stap 2.2).
- ES / mStrawberry OP9 co-cultuur (Dag 3)
- Verwijder voorzichtig medium uit co-cultuur en te vervangen door verse Co-cultuur van differentiatie medium
ES / mStrawberry OP9 co-cultuur (Dag 5)
- Zorgvuldig wassen co-culturen 2x met PBS
- Trypsinize cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA
- Was cellen af fles met Co-cultuur differentiatie media
- Pellet cellen 400xg, 7min, RT. Verwijder supernatans
- Add Co-cultuur differentiatie media aan cellen. Gebruik een 21-gauge bluntended naald om cellen hersuspenderen en om te zorgen voor enkele celsuspensie
- Tellen cellen met behulp van een hemocytometer. Moeten 100 tot 150-voudige toename in ES aantal cellen van dag 0.
- Re-seed 6.48x10 4 / cm 2 - 7.76x10 4 / cm 2 co-cultuur cellen op om een nieuwe laag van confluerende, mStrawberry OP9 cellen
- Dag 5 TESTEN-Resterende co-cultuur cellen kunnen worden gebruikt voor flowcytometrie-analyse, cytopreps (30K cellen), ChIP testen, etc.
- ES / mStrawberry OP9 co-cultuur (Dag 8 / 9 en dag 12)
- Verwijder de differentiatie media van kolf en op te slaan. Was monolaag 1x met PBS om hematopoietische cellen te verwijderen in suspensie. Gooi geen uit hematopoietische cellen.
- Trypsinize hechtende cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA
- Was cellen af kolf met ES differentiatie media en toe te voegen aan hematopoietische cellen in suspensie =
- Pellet cellen 400xg, 7min, RT. Verwijder supernatans
- Add Co-cultuur differentiatie media of PBS aan cellen. Gebruik een 21-gauge bluntended naald om cellen hersuspenderen en om te zorgen voor enkele celsuspensie tellen cellen met behulp van een hemocytometer.
- Co-cultuur kan worden voortgezet gedurende 14 dagen naar meer volwassen hematopoietische voorlopercellen te evalueren door het opnieuw zaaien co-cultuur cellen op een nieuwe laag van confluerende, mStrawberry OP9 cellen op dag 8 of 9 en dan weer op dag 12. Re-seed geoptimaliseerde mobiele nummer op basis van de gewenste cel herstel voor dag van de test.
- Evaluatie van de ES-afgeleide nageslacht (Dag 1-14). ES-afgeleide nakomelingen kan worden geëvalueerd op elke dag van co-cultuur door de stroming het uitzoeken mStrawberry negatieve cellen (ES-afgeleid nageslacht).
- Verwijder de differentiatie media van kolf en op te slaan. Was monolaag 1x met PBS om hematopoietische cellen te verwijderen in suspensie. Geen toss uit hematopoietische cellen.
- Trypsinize hechtende cellen met voorverwarmd 0,25% trypsine-EDTA
- Was cellen af fles met Co-cultuur differentiatie media en toe te voegen aan hematopoietische cellen in suspensie
- Pellet cellen 400xg, 7min, RT. Gooi supernatans
- Resuspendeer cellen met 21-gauge naald bluntended en tellen
- ES-afgeleide nageslacht (mStrawberry negatieve cellen) kan stromen gesorteerd van mStrawberry positief OP9 cellen. ES-afgeleide nakomelingen kan vervolgens worden gekenmerkt door flowcytometrie-analyse, cytopreps, ChIP testen, etc.
4. Representatieve resultaten:
Figuur 1. ES / mStrawberry OP9 co-cultuur systeem. Ons laboratorium maakt gebruik van een in-vitro-ES-cel co-cultuur systeem te modelleren hematopoietische ontwikkeling. In deze co-cultuur systeem, ES-cellen differentiëren, in hemangioblasts op Dag 5, bij plaatsing op een confluente laag van mStrawberry OP9 cellen. Als de co-cultuur gaat, hematopoëtische voorlopers aanwezig zijn op dag 8, terwijl de terminaal gedifferentieerde hematopoietische lijnen verschijnen op dag 14. Pijlen geven dag van differentiatie bij passage van de ES-afgeleide nageslacht op nieuwe samenvloeiing lagen van mStrawberry OP9 cellen in dat nodig is.
Figuur 2. Juiste ES celdifferentiatie. ES-cellen worden gezaaid op een confluente laag mStrawberry OP9 op dag 0. ES-afgeleide nageslacht beginnen zichtbaar te worden op dag 3 van differentiatie, met ES-afgeleide nakomelingen uitzien als een cluster van cellen met een bepaalde grens of het begin tot een krans patroon te vormen. Hemangioblasts, die de gemeenschappelijke mesodermale voorloper van de endotheel-en hematopoietische lineages, moet verschijnen als opgestapeld kransen van cellen op dag 5. Voor co-cultuur periodes langer dan vijf dagen, moet ES-afgeleide nageslacht verschijnen als clusters van hematopoietische cellen. Twee tot vier eencellige clusters, op dag 6 / 7, moeten verschijnen en uitgroeien tot grotere cel clusters op dag 8 / 9 van de co-cultuur. Andere ES afgeleid nakomelingen zijn ook gevonden strak gebonden aan de hechtende stromale cellen laag.
Figuur 3. Mislukte ES celdifferentiatie. Resultaten van deze co-cultuur weerspiegelen oneigenlijk ES-cel differentiatie. Merk op hoe de ES-derived nageslacht niet in een krans patroon op dag 5. De afwezigheid van cellen in een krans patroon geeft onjuiste hemangioblast formatie. Als hemangioblast niet goed ontwikkelen, dan bleef co-cultuur zal resulteren in onvolgroeide hematopoietische lijn differentiatie. Co-culturen met oneigenlijke hemangioblast formatie moet worden weggegooid.
Figuur 4. mStrawberry OP9 celculturen. (A) mStrawberry OP9 cel zijn subcultuur op70-90% confluentie. (B) Voor een goede differentiatie, zijn ES-cellen en ES-derived nakomelingen geplaatst op een overdreven samenvloeiing laag van mStrawberry OP9 cellen.
Figuur 5. Vertegenwoordiger ES / mStrawberry OP9 Co-cultuur stromingsprofiel. Alle ES-derived nakomelingen zijn mStrawberry negatieve cellen en kan stromen gesorteerd van de mStrawberry OP9 cellen. mStrawberry negatieve cel poort werd bepaald met behulp van een traditionele ES/OP9 co-cultuur.
Discussion
Een goede differentiatie van ES-cellen op de samenvloeiing laag van mStrawberry OP9 cellen resulteert in de productie van Flk1 + hemangioblasts op dag vijf van co-cultuur. Hemangioblasts moeten als opgestapeld kransen van cellen, zoals waargenomen in figuur 1. Voor de rest van de co-cultuur, moet zichtbaar ES-afgeleide nageslacht verschijnen als clusters van hematopoietische cellen (figuur 1). Bij Day6 / 7 twee tot vier cel-clusters moeten verschijnen en uitgroeien tot grotere cel clusters (zowel aanhanger en in suspensie), op dag 8 / 9 van de co-cultuur. Andere ES afgeleid nakomelingen zijn ook gevonden handen en voeten gebonden in de klevende stromale cellen laag.
Hoewel niet opgenomen in het protocol, is het essentieel om te pre-testen van de FBS gebruikt in de ES groeimedium, de mStrawberry OP9 groei media en de ES / mStrawberry OP9 differentiatie media. Goed getest serum moeten een goede groei van mStrawberry OP9 cellen, maar ook, een goede differentiatie van embryonale stamcellen in co-cultuur zorgen tot Dag 5 van differentiatie. Als alternatief of in aanvulling op mStrawberry OP9 cellen, kan OP9 cellen worden bestraald, op 8000 rad, voorafgaand aan zaaien bij confluentie (7.8x10 4 cellen / cm 2). Bestraling van OP9 cellen die zorgt voor de eliminatie van herhaalde replating stappen, maar ook, zorgt voor bijna volledige eliminatie van oude, vervuilende OP9 cellen van stroomafwaarts assays.
OP9 cellen werden ontworpen om mStrawberry eiwit tot expressie door transduceren OP9 cellen met 3ug/mL van een lentivirale vector die mStrawberry onder de controle van een CMV-promoter (pRRLsin-CMV vector, UCLA vector kern).
Standaard ES/OP9 co-cultuur protocollen leiden tot de plaatsing van ES-cellen op een confluente laag OP9 cellen, evenals, een dag vijf replating stap om te verminderen oude, vervuilende OP9 cellen van cel-passage. Daarnaast worden alleen hematopoietische cellen in suspensie verwijderd voor de evaluatie van ES-afgeleid nageslacht. Echter, met zowel een replating stap en de oogst van slechts een suspensie cellen mist mogelijk een aanzienlijk aantal van de zich ontwikkelende ES-afgeleide hematopoietische cellen. Deze kwestie wordt van belang aan te pakken wanneer het proberen om hematopoietische afwijkingen geassocieerd met knock-out-ES lijnen karakteriseren. Om dit probleem te omzeilen ons lab gebruikt een aangepaste co-cultuur, door het gebruik van mStrawberry-expressie OP9 cellen. Dit zorgt ervoor dat alle ES nakomelingen worden overgebracht naar de voortdurende co-cultuur op dag 5, en voor de oogst van alle ES-afgeleid nageslacht voor downstream-assays. Deze wijziging zorgt voor een handige tools bij de evaluatie en karakterisering van hematopoietische nakomelingen van zowel mens en muis ES lijnen.
Deze ES-mStrawberry OP9 co-cultuur model recapituleert de verschillende stadia primitieve en definitieve hematopoiese. Bij het bestuderen van de vroegste stadia van hematopoietische ontwikkeling, veel mensen gebruik maken van de BL-CFC (Blast-achtige kolonievormende cel) test, die de ontwikkeling van de hemangioblast uit de ES-cel te beoordelen. Terwijl de BL-CFC-test is een nuttig hulpmiddel bij het onderzoek naar vroege hematopoietische ontwikkeling, de mStrawberry-ES co-cultuur systeem vertoont te verhogen nut als het staat voor de beoordeling van hemangioblast, evenals, meer volwassen hematopoietische geslachten.
Eerdere werk met behulp van traditionele OP9/ES en EB differentiatie protocollen heeft aangetoond dat andere factoren misschien wel nodig zijn, zoals overexpressie van HoxB4, om te leiden op lange termijn repopulatie hematopoietische stamcellen in vitro. Meerwerk is nodig om te beoordelen of mStrawberry negatief, gesorteerd ES-afgeleide populaties waar hematopoietische stamcellen bevatten.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken U. Ganapati voor het opzetten en testen van de mStrawberry OP9 cellijn. Bovendien, wij danken H. Shafifor haar hulp bij de co-cultuur. HP wordt ondersteund door een beurs van de National Heart, Lung, and Blood Institute (F31HL087714) (HP). De inhoud van dit werk is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteur en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Heart, Lung, and Blood Institute of van de National Institutes of Health (NIH). De UCLA Flow Cytometry Core Facility wordt ondersteund door het NIH (CA-16042-en AI-28697), de Jonsson Cancer Center, het UCLA Aids Institute, en de UCLA School of Medicine.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
| ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
References
- Baron, M. H.
- Baron, M. H. Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation. Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).
- Baron, M. H., Fraser, S. T. The specification of early hematopoiesis in the mammal. Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).
- Ganapati, U. Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression. Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).
- Hogan, B. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1994).
- Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).
- Nakano, T. Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro. Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).
- Nakano, T. In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis. Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1098 (1994).
- Turksen, K. Embryonic stem cells : methods and protocols. , Humana Press. Totowa, N.J. (2002).
