Summary
mStrawberry OP9 कोशिकाओं सह संस्कृति से सभी ES-व्युत्पन्न संतान का पूरा मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं.
Abstract
एक hematopoietic सेल भाग्य की दिशा में ES कोशिकाओं की इन विट्रो में भेदभाव उपयोगी है जब सेल आबादी है कि vivo में है और जल्द से जल्द hematopoiesis में शामिल जीनों भ्रूण lethalities के साथ सौदा करने के लिए बिना, के लिए निस्र्पक का उपयोग करने के लिए मुश्किल हैं का अध्ययन. ES/OP9 प्रणाली सह संस्कृति मूल मैक्रोफेज के अधिक उत्पादन के बिना hematopoietic संतान, उत्पादन के लिए डिजाइन किया गया था, के रूप में OP9 stromal सेल लाइन osteopetrosis उत्परिवर्ती चूहों कि एम-CSF कार्यात्मक कमी calvaria से ली गई है. इन विट्रो ES/OP9 सह संस्कृति प्रणाली में क्रम में करने के लिए जल्दी hematopoietic विकास पुनरावृत्ति इस्तेमाल किया जा सकता है . जब OP9 stromal कोशिकाओं पर सुसंस्कृत, ES कोशिकाओं Flk-1 + hemangioblasts, hematopoietic progenitors, और अंत में परिपक्व, terminally विभेदित प्रजातियों में अंतर है. मानक प्रोटोकॉल ES/OP9 सह संस्कृति OP9 कोशिकाओं के एक मिला हुआ परत पर ES कोशिकाओं की नियुक्ति की जरूरत पर जोर देता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में, आवधिक replating कदम क्रम में पुराने को हटाने के लिए, OP9 कोशिकाओं contaminating. इसके अलावा, मौजूदा प्रोटोकॉल केवल hematopoietic निलंबन में पाया कोशिकाओं का मूल्यांकन शामिल है अनुकूलित कर रहे हैं और भेदभाव के प्रत्येक दिन पर ES-व्युत्पन्न संतान के मूल्यांकन के लिए नहीं. हालांकि, replating कदम और केवल निलंबन कोशिकाओं की कटाई के साथ एक संभावित ES व्युत्पन्न संतान और hematopoietic कोशिकाओं के विकास का एक बड़ा हिस्सा याद करते हैं. यह समस्या महत्वपूर्ण हो जाता है पता है जब hematopoietic पीटा ES लाइनों के साथ जुड़े दोषों विशेषताएँ की कोशिश कर रहा है. यहाँ हम एक संशोधित / ES mStrawberry OP9 सह संस्कृति, जो बहाव assays से OP9 कोशिकाओं contaminating के उन्मूलन के लिए अनुमति देता है का वर्णन. इस विधि सह संस्कृति के सभी दिनों में सभी ES व्युत्पन्न संतान का पूरा मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है, एक hematopoietic भेदभाव पैटर्न है, जो और अधिक सीधे hematopoietic भेदभाव भ्रूण के भीतर मनाया पैटर्न से मेल खाती है है में जिसके परिणामस्वरूप.
Protocol
1. ES कोशिकाओं की तैयारी
- संस्कृति अपने विशेष सेल लाइन के लिए मानक प्रोटोकॉल के अनुसार ES कोशिकाओं. 0 दिवस के लिए mStrawberry OP9 कोशिकाओं पर थाली करने के लिए पर्याप्त ES कोशिकाओं को तैयार करने के लिए सुनिश्चित करें (ES कोशिकाओं 0 दिवस पर 1x10 ^ 2 सेमी प्रति 3 कोशिकाओं पर चढ़ाया जाएगा)
2. OP9 कोशिकाओं की तैयारी
- बढ़ रही mStrawberry OP9 कोशिकाओं से पहले, OP9 विकास मीडिया तैयार
ओ पी-9 सेल संस्कृति मध्यमस्टॉक अंतिम सान्द्र. वॉल्यूम (एमएल) aMEM 39.5 FBS (ओ पी-9 परीक्षण) 100% 20% 10 एल-glutamine 100X (200mm) 2mm 0.5 50ml
4 में स्टोर डिग्री सेल्सियस और तैयारी के एक सप्ताह के भीतर उपयोग - आदेश में mStrawberry OP9 कोशिकाओं को बनाए रखने के लिए हर 2 दिन, मीडिया बदल जाना चाहिए और कोशिकाओं कोशिकाओं (7-90 confluency% पर उपसंस्कृति) confluency तक पहुँचने के लिए पहले subcultured होना चाहिए. mStrawberry OP9 सेल संस्कृतियों 90 confluency% से परे बड़े हो कभी नहीं के रूप में इस adipocytes में उनके भेदभाव में परिणाम देगा. चित्रा 3 देखें.
- पीबीएस (या पीबीएस + 1x trypsin - EDTA के साथ 0.1% के साथ 1x) के साथ 2X कोशिकाओं द्वारा धोने subculture कोशिकाओं
- 37 में पूर्व गर्म 0.1% trypsin EDTA जोड़ें ° सी के 5 मिनट के लिए (या कक्षों विच्छिन्न करना जब तक )
- जब कोशिकाओं को अलग किया है, ओपी 9-मध्यम विकास जोड़ें. एक 50ml शंक्वाकार ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण.
- 300 XG पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए गोली कोशिकाओं. सतह पर तैरनेवाला त्यागें .
- ताजा mStrawberry OP9 विकास मीडिया में Resuspend कोशिकाओं
- 4 कोशिकाओं 10 / 2 सेमी की एक न्यूनतम घनत्व प्लेट कोशिकाओं
- Confluency mStrawberry OP9 कोशिकाओं 3 दिन शुरू सह संवर्धन ES कोशिकाओं (0 दिन, 5 दिन, या Day8 / प्रयोग के 9) के लिए आवश्यक दिन पहले बढ़ने
3. ES / mStrawberry सह संस्कृति OP9
- सह - संस्कृति भेदभाव मीडिया तैयार
स्टॉक अंतिम वॉल्यूम (एमएल) aMEM 39.5 FBS 100% 20% 10 एल-glutamine 200mm 2mm 0.5 50ml - mStrawberry OP9 कोशिकाओं (-3 दिन)
- हमेशा दिन -3 पर OP9 कोशिकाओं subculture, ताकि आप सह संस्कृति के दिवस 0 लिए mStrawberry OP9 कोशिकाओं की परतों मिला हुआ है. फिगर 4b. प्लेट mStrawberry 0 दिवस पर confluency OP9 1x10 4 / 2 सेमी के लिए कोशिकाओं. 5 दिन और सह संस्कृति की निरंतरता के लिए 8 / 9 दिन के लिए उपसंस्कृति अतिरिक्त कोशिकाओं को सुनिश्चित करें.
- ES / mStrawberry OP9 सह संस्कृति सेट अप (0 दिन)
- ES कोशिकाओं को पीबीएस के साथ 2x धो
- 5min @ 37 के लिए पूर्व गर्म 0.25% trypsin EDTA, सेते साथ ES कोशिकाओं Trypsinize डिग्री सेल्सियस
- कोशिकाओं को सह संस्कृति भेदभाव मीडिया जोड़ें
- गोली 400xg ES कोशिकाओं, 5-7min, आरटी. सतह पर तैरनेवाला त्यागें
- सह - संस्कृति भेदभाव मीडिया में Resuspend कोशिकाओं
- MStrawberry OP9 कोशिकाओं से मीडिया निकालें
- MStrawberry OP9 बोतल के लिए सह - संस्कृति भेदभाव मीडिया जोड़ें
- प्लेट 1x10 3 ES कोशिकाओं mStrawberry OP9 कोशिकाओं की कुप्पी / 2 सेमी. 37 में कोशिकाओं सेते डिग्री सेल्सियस, 5% नमी के साथ सीओ 2.
- mStrawberry OP9 कोशिकाओं (2 दिन)
- Subculture OP9 mStrawberry इतनी है कि आप सह संस्कृति के 5 दिन के लिए mStrawberry OP9 कोशिकाओं मिला हुआ परतों है. प्लेट mStrawberry 5 दिवस पर confluency OP9 1x10 4 / 2 सेमी के लिए कोशिकाओं (3.2 कदम के रूप में) . 8 / 9 दिन यदि आवश्यक हो, (के रूप में 2.2 कदम) के लिए उपसंस्कृति अतिरिक्त कोशिकाओं को सुनिश्चित करें.
- ES / mStrawberry सह संस्कृति OP9 (3 दिन)
- ध्यान से सह संस्कृति से मध्यम हटाने और ताजा भेदभाव सह संस्कृति मध्यम के साथ जगह
ES / mStrawberry सह संस्कृति (5 दिन) OP9
- ध्यान से पीबीएस के साथ 2x सह संस्कृतियों धो
- पूर्व गर्म 0.25% trypsin EDTA के साथ कोशिकाओं Trypsinize
- सह - संस्कृति भेदभाव मीडिया के साथ फ्लास्क बंद कोशिकाओं धो
- 400xg पर गोली कोशिकाओं, 7min, आरटी. सतह पर तैरनेवाला त्यागें
- कोशिकाओं को सह संस्कृति भेदभाव मीडिया जोड़ें. एक 21 गेज bluntended सुई का प्रयोग कोशिकाओं resuspend और एकल कक्ष निलंबन के लिए यह सुनिश्चित
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं को गिन लो. 0 दिवस से ES सेल संख्या में 100-150 गुना वृद्धि होनी चाहिए.
- पुनः बीज 6.48x10 4 / 2 सेमी सेमी 7.76x10 4 / 2 मिला हुआ, mStrawberry OP9 कोशिकाओं की एक नई परत पर सह संस्कृति कोशिकाओं
- 5 दिन assays शेष सह संस्कृति कोशिकाओं प्रवाह cytometry विश्लेषण cytopreps (30K कोशिकाओं), चिप assays, आदि के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है
- ES / mStrawberry सह संस्कृति OP9 (8 / 9 दिन और 12 दिन)
- कुप्पी से भेदभाव मीडिया निकालें और बचाने के लिए. पीबीएस के साथ धो monolayer 1x निलंबन में hematopoietic कोशिकाओं को हटाने. Hematopoietic कोशिकाओं नहीं टॉस करो .
- पूर्व गर्म 0.25% trypsin EDTA के साथ पक्षपाती कोशिकाओं Trypsinize
- ES भेदभाव मीडिया के साथ फ्लास्क बंद कोशिकाओं को धो और hematopoietic = निलंबन में पाया कोशिकाओं को जोड़ने
- 400xg पर गोली कोशिकाओं, 7min, आरटी. सतह पर तैरनेवाला त्यागें
- कोशिकाओं को सह - संस्कृति भेदभाव मीडिया या पीबीएस जोड़ें कोशिकाओं resuspend और एकल कक्ष निलंबन गणना एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए एक 21 गेज bluntended सुई का प्रयोग..
- मिला हुआ है, दिवस 8 या 9 में mStrawberry OP9 कोशिकाओं की एक नई परत पर फिर से बोने सह संस्कृति की कोशिकाओं द्वारा अधिक परिपक्व hematopoietic progenitors और मूल्यांकन तो फिर से 12 दिवस के अवसर पर सह संस्कृति 14 दिनों के लिए जारी किया जा सकता है. पुनः बीज अनुकूलित सेल परख के दिन के लिए आवश्यक सेल वसूली के आधार पर संख्या.
- ES-व्युत्पन्न संतान (1-14 दिन) का मूल्यांकन. ES - व्युत्पन्न संतान mStrawberry नकारात्मक कोशिकाओं (ES - व्युत्पन्न संतान) बाहर छँटाई प्रवाह द्वारा सह संस्कृति के किसी भी दिन पर मूल्यांकन किया जा सकता है.
- कुप्पी से भेदभाव मीडिया निकालें और बचाने के लिए. पीबीएस के साथ धो monolayer 1x निलंबन में hematopoietic कोशिकाओं को हटाने के लिए. Hematopoietic कोशिकाओं टॉस मत करो.
- पूर्व गर्म 0.25% trypsin EDTA के साथ पक्षपाती कोशिकाओं Trypsinize
- धो फ्लास्क बंद सह संस्कृति भेदभाव मीडिया के साथ कोशिकाओं और hematopoietic निलंबन में पाया कोशिकाओं को जोड़ने
- 400xg पर गोली कोशिकाओं, 7min, आरटी. सतह पर तैरनेवाला त्यागें
- 21 गेज bluntended सुई और गिनती के साथ Resuspend कोशिकाओं
- ES - व्युत्पन्न संतान (mStrawberry नकारात्मक कोशिकाओं) प्रवाह mStrawberry सकारात्मक OP9 कोशिकाओं से हल हो सकते हैं. ES - व्युत्पन्न संतान तो प्रवाह cytometry विश्लेषण, cytopreps, चिप assays, आदि द्वारा विशेषता जा सकता है
4. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1. ES / mStrawberry OP9 सिस्टम सह संस्कृति हमारी प्रयोगशाला इन विट्रो ES सेल सह संस्कृति मॉडल hematopoietic विकास के लिए प्रणाली में एक का उपयोग करता है. इस प्रणाली के सह - संस्कृति में, ES कोशिकाओं hemangioblasts में अंतर, Day5 पर, जब mStrawberry OP9 कोशिकाओं का एक मिला हुआ परत पर रखा. सह संस्कृति आय के रूप में, hematopoietic व्यापारियों दिवस 8 में मौजूद हैं, जबकि टर्मिनली विभेदित hematopoietic प्रजातियों 14 दिन से दिखाई देते हैं. तीर भेदभाव के दिनों से संकेत मिलता है जब आवश्यक mStrawberry OP9 कोशिकाओं के नए मिला हुआ परतों पर ES-व्युत्पन्न संतान के passaging.
चित्रा 2. उचित ES सेल भेदभाव. ES कोशिकाओं OP9 mStrawberry 0 दिवस पर मिला हुआ परत पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं. ES - व्युत्पन्न संतान ES-व्युत्पन्न संतान एक परिभाषित सीमा के साथ कोशिकाओं का एक समूह की तरह लग रही है या एक वोर्ल पैटर्न फार्म की शुरुआत के साथ भेदभाव का दिन 3 पर दिखाई बनने शुरू. Hemangioblasts, जो endothelial और hematopoietic प्रजातियों के लिए आम mesodermal अग्रदूत रहे हैं के रूप में 5 दिवस पर कक्षों की whorls ढेर दिखाई देनी चाहिए. पांच दिनों की तुलना सह संस्कृति लंबी अवधि के लिए, ES-व्युत्पन्न संतान hematopoietic कोशिकाओं के समूहों के रूप में प्रकट करना चाहिए. दो से चार celled समूहों, 6 / 7 दिवस पर दिखाई देते हैं, और सह संस्कृति / 8 9 दिन से बड़ा सेल समूहों में बढ़ने चाहिए. अन्य ES व्युत्पन्न संतान भी कसकर पक्षपाती stromal सेल परत करने के लिए बाध्य पाए जाते हैं.
चित्रा 3. इस सह - संस्कृति से असफल ES सेल भेदभाव परिणाम अनुचित ES सेल भेदभाव को दर्शाते हैं. नोट कैसे ES-व्युत्पन्न संतान 5 दिवस पर एक वोर्ल पैटर्न में नहीं दिखाई देते. एक वोर्ल पैटर्न में कोशिकाओं के अभाव अनुचित hemangioblast गठन इंगित करता है. यदि hemangioblast ठीक से विकसित नहीं है, तो जारी रखा सह संस्कृति अवरुद्ध hematopoietic वंश भेदभाव में परिणाम होगा. अनुचित hemangioblast गठन के साथ सह संस्कृतियों का त्याग किया जाना चाहिए.
चित्रा 4. mStrawberry OP9 सेल संस्कृतियों (ए) mStrawberry OP9 सेल पर subcultured हैं70-90 confluency%. (ख) उचित भेदभाव के लिए, ES कोशिकाओं और ES व्युत्पन्न संतान mStrawberry OP9 कोशिकाओं की एक पीढ़ी मिला हुआ परत पर रखा जाता है.
चित्रा 5. प्रतिनिधि / ES mStrawberry OP9 प्रवाह सह संस्कृति प्रोफ़ाइल ES व्युत्पन्न सभी संतान mStrawberry नकारात्मक कोशिकाओं रहे हैं और प्रवाह mStrawberry OP9 कोशिकाओं से हल हो सकते हैं . mStrawberry नकारात्मक सेल फाटक एक पारंपरिक सह संस्कृति ES/OP9 उपयोग निर्धारित किया गया था.
Discussion
MStrawberry OP9 सह संस्कृति के 5 दिवस पर Flk1 + hemangioblasts के उत्पादन में कोशिकाओं के परिणाम मिला हुआ परत पर ES कोशिकाओं के समुचित भेदभाव. Hemangioblasts को प्रकट करना चाहिए के रूप में कोशिकाओं की whorls ढेर, जैसा कि चित्र 1 में मनाया. सह संस्कृति के शेष के लिए, दिखाई संतान ES व्युत्पन्न hematopoietic कोशिकाओं के समूहों (चित्रा 1) के रूप में प्रकट करना चाहिए. 7 / Day6 से कम दो से चार सेल समूहों दिखाई देगा और सह संस्कृति / 8 9 दिन से बड़ा सेल समूहों (दोनों पक्षपाती और निलंबन में) के रूप में विकसित होने चाहिए. अन्य ES व्युत्पन्न संतान भी पाए जाते हैं कसकर पक्षपाती stromal सेल परत के भीतर ही है.
हालांकि प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध नहीं है, यह पूर्व परीक्षण FBS ES मध्यम विकास, mStrawberry OP9 विकास मीडिया और / ES mStrawberry OP9 भेदभाव मीडिया में इस्तेमाल किया के लिए महत्वपूर्ण है. ठीक से परीक्षण सीरम भेदभाव के 5 दिन तक mStrawberry OP9 कोशिकाओं के समुचित विकास के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ES कोशिकाओं के सह संस्कृति में भेदभाव उचित यह सुनिश्चित करना चाहिए. एक विकल्प के रूप में या mStrawberry OP9 कोशिकाओं के अलावा, OP9 कोशिकाओं 8000 rads पर, विकिरणित confluency पर (7.8x10 4 कोशिकाओं / 2 सेमी) बोने से पहले कर सकते हैं ,. OP9 कोशिकाओं के किरणन दोहराया replating चरणों के उन्मूलन के लिए अनुमति देता है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में पुराने के लगभग पूर्ण उन्मूलन के लिए अनुमति देता है, बहाव assays से OP9 कोशिकाओं contaminating.
OP9 कोशिकाओं के लिए एक सीएमवी प्रमोटर के नियंत्रण (वेक्टर pRRLsin - सीएमवी, UCLA वेक्टर कोर) के तहत एक lentiviral वेक्टर व्यक्त mStrawberry 3ug/mL के साथ OP9 कोशिकाओं transducing mStrawberry प्रोटीन व्यक्त इंजीनियर थे.
मानक ES/OP9 सह संस्कृति प्रोटोकॉल एक मिला हुआ परत OP9 कोशिकाओं पर ES कोशिकाओं के स्थान पड़ेगा, के रूप में अच्छी तरह के रूप में, एक दिन में 5 replating कदम क्रम में करने के लिए पुराने को कम करने, सेल के पारित होने से OP9 कोशिकाओं contaminating. इसके अतिरिक्त, केवल hematopoietic निलंबन में पाया कोशिकाओं ES-व्युत्पन्न संतान के मूल्यांकन के लिए हटा रहे हैं. हालांकि, दोनों एक replating कदम है और केवल निलंबन कोशिकाओं की कटाई के साथ एक संभावित विकास की एक पर्याप्त संख्या ES-व्युत्पन्न hematopoietic कोशिकाओं याद करते हैं. यह समस्या महत्वपूर्ण हो जाता है पता है जब hematopoietic पीटा ES लाइनों के साथ जुड़े दोषों विशेषताएँ की कोशिश कर रहा है. आदेश में इस मुद्दे को दरकिनार करने के लिए हमारी प्रयोगशाला mStrawberry OP9 कोशिकाओं व्यक्त करने के उपयोग के माध्यम से एक संशोधित सह संस्कृति, इस्तेमाल किया. यह भरोसा दिलाते हैं कि सभी ES संतान 5 दिन में सह संस्कृति जारी करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, और बहाव assays के लिए सभी ES-व्युत्पन्न संतान की फसल के लिए. इस संशोधन मूल्यांकन और hematopoietic दोनों मानव और माउस ES लाइनों से व्युत्पन्न संतान के लक्षण वर्णन में एक उपयोगी उपकरण प्रदान करता है.
यह ES - mStrawberry OP9 सह संस्कृति विभिन्न चरणों आदिम और निश्चित hematopoiesis मॉडल स्मरण दिलाता है. Hematopoietic विकास के प्रारंभिक चरणों के अध्ययन में, कई लोगों को (कॉलोनी गठन सेल ब्लास्ट की तरह) बीएल सीएफसी परख, जो ES सेल से hemangioblast के विकास का आकलन उपयोग करें. जबकि बीएल-सीएफसी परख एक उपयोगी उपकरण है जब जल्दी hematopoietic विकास जांच, mStrawberry ES-सह संस्कृति प्रणालियों के रूप में वृद्धि उपयोगिता दर्शाती यह hemangioblast के मूल्यांकन के रूप में अच्छी तरह के रूप में, और अधिक वयस्क hematopoietic प्रजातियों के लिए अनुमति देता है.
पिछला पारंपरिक OP9/ES और EB भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग कर काम दिखाया गया है कि अतिरिक्त शायद HoxB4 की overexpression के रूप में आवश्यक हो, आदेश में कारकों दीर्घकालिक प्राप्त करने के लिए इन विट्रो में hematopoietic स्टेम सेल repopulating. अतिरिक्त काम का आकलन है कि mStrawberry नकारात्मक, हल ES-व्युत्पन्न आबादी सच hematopoietic स्टेम सेल होते आवश्यक है.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम mStrawberry OP9 सेल लाइन की स्थापना और परीक्षण के लिए अमेरिकी गणपति धन्यवाद. इसके अतिरिक्त, हम एच. Shafifor सह संस्कृति के साथ उसकी सहायता धन्यवाद. हिमाचल प्रदेश के राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान (F31HL087714) (हिमाचल प्रदेश) से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित है. इस काम की सामग्री केवल लेखक की जिम्मेदारी है और राष्ट्रीय हृदय, फेफड़े और रक्त संस्थान या स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (NIH) के आधिकारिक विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं. UCLA फ्लो Cytometry कोर सुविधा (सीए 16,042 और ऐ - 28,697) एनआईएच, Jonsson कैंसर केंद्र, UCLA एड्स संस्थान, और UCLA स्कूल ऑफ मेडिसिन के द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
| ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
References
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