Summary
mStrawberry OP9 hücreleri ko-kültür tüm ES-türetilen döl tam değerlendirme için izin verir.
Abstract
In vivo ve embriyonik lethalities ile uğraşmak zorunda kalmadan, hematopoez dahil erken genleri tanımlamak için ulaşılması zor olan hücre popülasyonlarının çalışılırken, hematopoetik hücre kaderinin doğru ES hücrelerinin in vitro farklılaşması yararlıdır . OP9 stromal hücre hattı M-CSF fonksiyonel eksikliği osteopetrosis mutant farelerin calvaria türetilen ES/OP9 ko-kültür sisteminin ilk olarak makrofajların aşırı üretim olmadan, hematopoetik döl üretmek için dizayn edilmiştir. In vitro ES/OP9 ko-kültür sisteminde erken hematopoetik gelişimi özetlemek amacıyla kullanılabilir. OP9 stromal hücrelerinin kültüre, ES hücreleri FLK-1 + hemangioblasts, hematopoetik atalarıdır ve nihayet olgun, terminal farklılaşmış soy farklılaşırlar. Standart ES/OP9 ko-kültür protokolü OP9 hücrelerinin konfluent tabakası üzerine ES hücrelerinin yerleştirme gerektirir; OP9 hücreleri kirlenmesine neden olan, eski kaldırmak için yanı sıra, periyodik replating adımları. Ayrıca, mevcut protokolleri sadece süspansiyon bulundu hematopoetik hücrelerin değerlendirilmesi ve farklılaşma her gün ES-kökenli döl değerlendirilmesi için optimize edilmiş değildir. Ancak, adımları ve sadece süspansiyon hücrelerinin hasat replating bir potansiyel ES-kökenli döl ve hematopoietik hücreleri gelişmekte olan büyük bir bölümünü özlüyor. Bu sorun, nakavt ES hatları ile ilgili hematopoetik kusurları karakterize etmek için çalışırken ele almak önem kazanmaktadır. Burada downstream deneyleri OP9 hücre kirlenmesine neden ortadan kaldırılması için izin veren bir değiştirilmiş ES / mStrawberry OP9 ko-kültür, açıklar. Bu yöntem, embriyo içinde gözlenen hematopoetik farklılaşma desen daha doğrudan karşılık gelen bir hematopoetik farklılaşma desen, tam bir değerlendirme için, eş-kültür her gün tüm ES-türetilen döl verir.
Protocol
1. ES hücrelerinin hazırlanması
- Özellikle hücre hattı için standart protokole göre, Kültür ES hücrelerinin. Gün 0 mStrawberry OP9 hücreleri üzerine plakası için yeterli ES hücrelerinin hazırlamak için emin olun (ES hücreleri Gün 0 cm 2 başına 1x10 ^ 3 hücre kaplama olacak)
2. OP9 hücrelerin hazırlanması
- Büyüyen mStrawberry OP9 hücreleri önce OP9 büyüme ortamı hazırlamak
OP-9 Hücre Kültürü OrtaHisse senedi Final kons. Hacim (ml) aMEM 39,5 FBS (OP-9 test) % 100 % 20 10 L-glutamin 100X (200mm) 2mm 0,5 50ml
4 ° C ve bir hafta içinde hazırlık Mağaza - MStrawberry OP9 hücreleri korumak için, medya, 2 günde değişti olmalıdır ve hücreler (% confluency 70-90 altkültürü) confluency ulaşan hücrelere önce pasajlandı olmalıdır. bu adipositlere farklılaşma sonucu olarak mStrawberry OP9 hücre kültürlerinde% 90 confluency hiç ötesinde büyüdü. Şekil 3'e bakın.
- PBS (veya tripsin-EDTA ile PBS + 1x% 0.1 ile 1x) ile 2X yıkama hücreleri tarafından Altkültür hücreleri
- 37 ° önceden ısıtılmış% 0.1 tripsin-EDTA ° C 5 dakika boyunca (veya hücreleri ayırarak kadar)
- Hücreleri müstakil, OP-9 büyüme orta ekleyin. 50ml konik tüp hücreleri aktarın.
- Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de Pelet hücreleri supernatant atın.
- Taze mStrawberry OP9 büyüme ortamı içinde süspanse edin hücreleri
- 10 4 hücre / cm 2, en az yoğunlukta Plaka hücreleri
- Grow için gerekli ko-kültür ES hücreleri (0. Gün, Gün 5, ya da deney 8.Gün / 9) gün önce 3 gün başlayan confluency mStrawberry OP9 hücreleri
3. ES / mStrawberry OP9 Co-kültür
- Co-kültür farklılaşmasını ortamı hazırlayın
Hisse senedi Son Hacim (ml) aMEM 39,5 FBS % 100 % 20 10 L-glutamin 200mm 2mm 0,5 50ml - mStrawberry OP9 hücreleri (Gün -3)
- DAİMA Gün -3 OP9 hücreleri konfluent ko-kültür Günü 0 mStrawberry OP9 hücrelerinin katmanları var, böylece Altkültür. Bkz: Şekil 4b. Gün 0 'confluency için 1x10 4 / cm 2 Levha mStrawberry OP9 hücreleri. Gün 5 ve eş-kültür devamı için 8 / 9 Gün altkültürü ekstra hücrelere emin olun.
- ES / mStrawberry OP9 ko-kültür Set-Up (Gün 0)
- 2x ES hücreler PBS ile yıkayın
- Önceden ısıtılmış% 0.25 'lik tripsin-EDTA, inkübasyon ES hücrelerinin Trypsinize 5min @ 37 ° C
- Co-kültür farklılaşmasını medya hücreleri ekle
- Pelet ES hücreleri 400xg az, 5-7dk, RT. Süpernatant atın
- Co-kültür farklılaşmasını medyada yeniden süspanse hücre
- MStrawberry OP9 hücreleri medya kaldırma
- MStrawberry OP9 şişeler Co-kültür farklılaşmasını Medya ekle
- MStrawberry OP9 hücreleri balona Plaka 1x10 3 ES hücre / cm 2. 37 ° hücreleri ° C'de,% 5 CO 2 nem ile.
- mStrawberry OP9 hücreleri (2. Gün)
- Altkültür mStrawberry OP9 konfluent ko-kültür 5. Gün mStrawberry OP9 hücrelerinin katmanları var. 5. Gün confluency için 1x10 4 / cm 2 Levha mStrawberry OP9 hücreleri (adım 3.2 'deki gibi). Gün 8 / 9, gerekirse (adım 2.2 'de olduğu gibi) için altkültürü ekstra hücrelere emin olun.
- ES / mStrawberry OP9 ko-kültür (Gün 3)
- Co-kültür dikkatlice orta kaldırmak ve Co-kültür farklılaşması orta taze ile değiştirin
ES / mStrawberry OP9 ko-kültür (5. Gün)
- PBS ile 2x ortak kültürler dikkatlice yıkayın
- Önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA içeren hücreleri Trypsinize
- Co-kültür farklılaşmasını medya ile şişeyi kapalı hücreler yıkayın
- 400xg Pelet hücreleri, 7dk, RT supernatant atın
- Hücrelere Co-kültür farklılaşmasını Medya ekle hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve tek hücre süspansiyonu sağlamak için 21-gauge bluntended iğne kullanın
- Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Gün 0 ES hücre sayısı 100-150 kat artış olması gerekir.
- Ynt tohumu 6.48x10 4 / cm 2 - birleşmiş, mStrawberry OP9 hücreler yeni bir katmana 7.76x10 4 / cm 2 ko-kültür hücreleri
- 5. Gün Tahliller-ko-kültür hücreleri Kalan flow sitometri analizi, cytopreps (30K hücreleri), ChIP testleri, vb.
- ES / mStrawberry OP9 ko-kültür (Gün 8 / 9 ve 12 Gün)
- Şişeyi ayırt medyayı çıkartın ve saklayın. Süspansiyon hematopoietik hücreleri çıkarmak için PBS ile yıkayın tek tabaka 1x hematopoetik hücreler dışarı atmak.
- Önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA ile yapışık hücrelere Trypsinize
- ES farklılaşma medya ile balon kapalı hücre yıkayın ve süspansiyon = bulunan hematopoietik hücreleri eklemek
- 400xg Pelet hücreleri, 7dk, RT supernatant atın
- Co-kültür farklılaşmasını medya veya PBS hücrelere ekleyin. Hücreleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak tek hücre süspansiyonu Sayısı hücrelerin sağlamak için 21-gauge bluntended iğne kullanın.
- Co-kültür, 12 gün sonra tekrar yeni bir katman üzerine Gün 8 ya da 9 birleşik, mStrawberry OP9 hücreleri yeniden tohumlama ko-kültür hücreleri tarafından daha olgun hematopoietik atalarıdır değerlendirmek ve 14 gün süreyle devam edilebilir. Ynt tohumu gün tahlil için gerekli hücre kurtarma dayalı optimize edilmiş hücre sayısı.
- ES-kökenli döl (Gün 1-14) değerlendirilmesi. ES-türetilmiş döl mStrawberry negatif hücreler (ES-türetilmiş döl) sıralama akış eş-kültür her günü değerlendirilebilir.
- Şişeyi ayırt medyayı çıkartın ve saklayın. PBS ile yıkayın tek tabaka 1x süspansiyon hematopoietik hücreleri çıkarmak için. Hematopoetik hücreler dışarı atmak değil.
- Önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA ile yapışık hücrelere Trypsinize
- Co-kültür farklılaşmasını medya ile yıkayın ve şişeyi kapalı hücre süspansiyon bulunan hematopoietik hücrelere
- 400xg Pelet hücreleri, 7dk, RT. Süpernatant atın
- 21-gauge bluntended iğne sayısı ile yeniden süspanse hücreleri
- ES-kaynaklı döl (mStrawberry negatif hücreler) mStrawberry olumlu OP9 hücreleri sıralanır akışı olabilir. ES-kaynaklı döl sonra flow sitometri analizi, cytopreps, ChIP testleri, vb ile karakterize edilebilir
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Şekil 1. ES / mStrawberry OP9 Co-kültür Sistemi laboratuar model hematopoetik geliştirme in vitro ES hücre ko-kültür sistemi kullanır. Konfluent mStrawberry OP9 hücrelerinin bir katman üzerine yerleştirildiği zaman, bu ko-kültür sisteminde, ES hücreleri, gün5 hemangioblasts içine ayırt. Co-kültür ilerledikçe, hematopoietik öncüleri terminal farklılaşmış hematopoetik soy 14. Gün görünür, Gün 8 mevcuttur. Gerekli de mStrawberry OP9 hücrelerinin yeni konfluent katmanları üzerine ES-kökenli döl Pasajlanması zaman Oklar farklılaşma gün göstermektedir.
Şekil 2. Uygun ES hücre Farklılaşma. Embriyonik kök hücrelerin, Gün 0 'mStrawberry OP9 konfluent tabakası üzerine numaralı seribaşı. ES-türetilmiş döl ES-kökenli döl tanımlanmış bir sınır ile bir hücre kümesi gibi görünen veya bir girdap desen oluşmaya başlayan farklılaşma 3. Gün görünür hale başlar. Gün 5 hücre loca yığılmış olarak endotel ve hematopoetik soy için ortak mezodermal habercisi Hemangioblasts, görünmelidir. Co-kültür beş gün daha uzun süreler için, ES-türetilen döl hematopoetik hücre kümeleri gibi görünmelidir. Iki ila dört hücreli kümeler, 6 / 7 Gün görünmelidir ve co-kültür Günü 8 / 9 tarafından büyük bir hücre kümeleri içine büyümek. Diğer ES türetilen döl sıkıca yapışık stromal hücre katmanı bağlı bulunmaktadır.
Şekil 3. Bu ko-kültür Başarısız ES hücre farklılaşması. Sonuçları uygunsuz ES hücre farklılaşması yansıtmaktadır. ES-kaynaklı döl 5. Gün bir girdap desen görünmüyor nasıl unutmayın. Bir girdap desen hücrelerin yokluğunda yanlış hemangioblast oluşumu gösterir. Hemangioblast düzgün geliştirmek değilseniz, sonra ko-kültür bodur hematopoetik soy farklılaşma neden olacaktır. Uygunsuz hemangioblast oluşumu ile birlikte kültürler atılmalıdır.
Şekil 4. mStrawberry OP9 hücre kültürleri (A) mStrawberry OP9 hücre pasajlandı.Confluency 70-90%. (B) uygun farklılaşması için, ES hücreleri ve ES-türetilen döl mStrawberry OP9 hücrelerinin aşırı konfluent bir tabaka üzerine yerleştirilir.
Şekil 5. Temsilcisi ES / mStrawberry OP9 Co-kültür akış profili. ES-kökenli döl mStrawberry negatif hücreler ve mStrawberry OP9 hücrelerden sıralaması akışı olabilir. mStrawberry negatif hücre kapısı geleneksel bir ES/OP9 ko-kültür kullanılarak tespit edildi.
Discussion
Eş-kültür Gün 5 Flk1 + hemangioblasts üretiminde mStrawberry OP9 hücreleri sonuçları konfluent katman üzerinde ES hücrelerinin doğru farklılaşma. Hemangioblasts Şekil 1'de görüldüğü gibi hücre loca gibi yığılı görünmelidir. Co-kültür geri kalanı için, görünür ES-türetilen döl hematopoetik hücre kümeleri (Şekil 1) olarak görünmelidir. Gün6 7 / 03:58 hücre kümeleri görünmelidir ve co-kültür Günü 8 / 9 büyük bir hücre kümeleri (yapışık ve süspansiyon) içine büyümeye. Diğer ES türetilen döl sıkıca yapışık stromal hücre katmanı içinde bağlı bulunmaktadır.
Protokolde yer olmasa da, FBS ES büyüme ortamı, mStrawberry OP9 büyüme ortamı ve ES / mStrawberry OP9 farklılaşma medya kullanılan ön test için kritik öneme sahiptir. Düzgün serum ko-kültür uygun mStrawberry OP9 hücrelerinin büyüme yanı sıra, ES hücreleri düzgün farklılaşma farklılaşma Gün 5 kadar emin olmalıdır test edilmiştir. MStrawberry OP9 hücrelere ek olarak, alternatif olarak veya OP9 hücreleri (7.8x10 4 hücre / cm 2) confluency ekim öncesinde, 8000 rad, ışınlanmış olabilir. OP9 hücreleri ışınlanması downstream deneyleri OP9 hücre kirlenmesine neden olan, neredeyse tamamen ortadan kaldırılması için eski sağlar yanı sıra, tekrarlanan replating adımları ortadan kaldırılması için izin verir.
OP9 hücreleri CMV organizatörü (pRRLsin CMV vektör, UCLA vektör çekirdek) kontrolü altında bir lentiviral vektör ifade mStrawberry 3ug/mL OP9 hücreleri uyum mStrawberry protein ifade etmek için tasarlanmıştır.
Standart ES/OP9 ko-kültür protokolleri yanı sıra, OP9 hücreleri hücre geçit kirlenmesine, eski azaltmak amacıyla, bir konfluent katmanı OP9 hücreleri üzerine bir gün 5 replating adım ES hücrelerinin yerleştirilmesi gerektirecektir. Ayrıca, sadece süspansiyon bulundu hematopoetik hücreler ES-kökenli döl değerlendirilmesi için kaldırılır. Ancak, bir replating sadece süspansiyon hücrelerinin adım ve hasat ile bir potansiyel, gelişmekte olan önemli sayıda ES-kaynaklı hematopoetik hücreler özlüyor. Bu sorun, nakavt ES hatları ile ilgili hematopoetik kusurları karakterize etmek için çalışırken ele almak önem kazanmaktadır. Bu sorunu aşmak için amacıyla laboratuvar OP9 hücreleri mStrawberry ifade kullanımı yoluyla değiştirilmiş bir ko-kültür kullanılır. Bu tüm ES döl 5 gün devam eden ko-kültür transfer olmasını sağlar, aşağı testleri için tüm ES-türetilen döl hasat için. Bu değişiklik, değerlendirme ve karakterizasyonu, insan ve fare ES hatları türetilen hematopoietik döl yararlı araçlar sağlar.
Çeşitli aşamalarında, ilkel ve kesin hematopoez Bu ES-mStrawberry OP9 ko-kültür modeli özetlediği. Hematopoetik gelişiminin erken evrelerinde incelerken, birçok kişi, ES hücre hemangioblast gelişimini değerlendirmek, BL-CFC (koloni oluşturan hücre Patlamaya gibi) testi kullanır. BL-CFC testinin erken hematopoetik gelişimi araştıran yararlı bir araçtır hemangioblast değerlendirilmesi yanı sıra, daha yetişkin hematopoetik soy sağlar mStrawberry-ES, ko-kültür sistemleri artış yardımcı programı sergiler.
Için, HoxB4, aşırı ekspresyonunun gibi, belki de gerekli ek faktörler hematopoietik kök hücrelerinin in vitro repopulating uzun vadeli elde etmek için, geleneksel OP9/ES ve EB farklılaşma protokolleri kullanarak Önceki iş göstermiştir. Ek iş mStrawberry negatif, ES-kökenli nüfus sıralaması doğru hematopoietik kök hücreleri içeren olup olmadığını değerlendirmek için gereklidir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz U. Ganapati mStrawberry OP9 hücre hattı kurulması ve test için teşekkür ederiz. Ayrıca, ko-kültür ile H. Shafifor ona yardım teşekkür ederim. HP, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (F31HL087714) (HP) bir arkadaş grubu tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmanın içeriği yalnızca yazarın sorumluluğundadır ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) mutlaka resmi görüşlerini temsil etmemektedir. UCLA Sitometrisi Core Tesis NIH (CA-16.042 ve AI-28.697), Jonsson Kanser Merkezi, UCLA AIDS Enstitüsü ve UCLA Tıp Okulu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OP-9 Cell Maintenance Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Omega Scientific | FB01 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-C I | 200nM |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
| ES/OP-9 Cell Differentiation Medium Stock Components | |||
| aMEM | Invitrogen | 12571-063 | |
| FBS | Hyclone | SH30070 | Pre-Tested |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200mM |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-031-CV | |
| Trypsin-EDTA | Stem Cell Technologies | 07901 | |
References
- Baron, M. H.
- Baron, M. H. Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation. Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).
- Baron, M. H., Fraser, S. T. The specification of early hematopoiesis in the mammal. Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis. Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).
- Ganapati, U. Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression. Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).
- Hogan, B. Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1994).
- Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture. Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).
- Nakano, T. Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro. Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).
- Nakano, T. In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis. Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).
- Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture. Science. 265, 1098-1098 (1994).
- Turksen, K. Embryonic stem cells : methods and protocols. , Humana Press. Totowa, N.J. (2002).
