Summary
एक तेजी से, मानव त्वचा से व्यवहार्य वयस्क उपकला स्टेम कोशिकाओं को अलग की मजबूत तरीका में वर्णित है. विधि त्वचा मैट्रिक्स कोलेजन के enzymatic पाचन, बाल follicles और एकल कक्ष सेल संस्कृति के लिए निलंबन या ऊतक के टुकड़े के अलगाव की तोड़ के बाद का इस्तेमाल.
Abstract
सभी स्वयं renewing के ऊतकों के homeostasis वयस्क स्टेम सेल पर निर्भर है. के रूप में undifferentiated स्टेम कोशिकाओं असममित प्रभागों से गुजरना है, वे बेटी कोशिकाओं है कि स्टेम सेल phenotype और पारगमन amplifying (टीए कोशिकाओं) कोशिकाओं है कि स्टेम सेल आला से विस्थापित हो, तेजी से प्रसार से गुजरना और टर्मिनली ऊतक जनसंख्या फिर से बढ़ा अंतर बनाए रखने के उत्पन्न करते हैं.
उपकला स्टेम कोशिकाओं इन विट्रो proliferative संभावित में एक उच्च और के रूप में साइकिल चालन के धीमी गति से 1-3 vivo में कोशिकाओं लेबल बनाए रखने के साथ कोशिकाओं के रूप में किया गया है epidermis, बाल कूप, और आंत में पहचान की है. वयस्क, ऊतक विशेष स्टेम कोशिकाओं ऊतकों जिसमें वे सामान्य शारीरिक कारोबार के दौरान 4-5 तनाव के समय के दौरान के रूप में अच्छी तरह के रूप में रहते के उत्थान के लिए जिम्मेदार हैं . इसके अलावा, स्टेम सेल आमतौर पर बहु - शक्तिशाली माना जाता है, 6 ऊतक के भीतर अनेक प्रकार की कोशिकाओं को जन्म दे की क्षमता रखने. उदाहरण के लिए, कृंतक बाल कूप स्टेम कोशिकाओं epidermis, वसामय ग्रंथियों, और बाल रोम 7-9 उत्पन्न कर सकते हैं. हम पता चला है कि मानव बाल कूप उभाड़ना क्षेत्र से स्टेम कोशिकाओं एक्ज़िबिट 10 बहु - संभावनाओं.
स्टेम सेल जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक महत्वपूर्ण उपकरण, विकासात्मक जीव विज्ञान, भेदभाव, tumorigenesis और उनके संभव चिकित्सीय उपयोगिता के लिए के अध्ययन के लिए इन विट्रो प्रणाली में एक के रूप में उनकी उपयोगिता के कारण बन गए हैं. यह संभावना है कि वयस्क उपकला स्टेम कोशिकाओं बहिर्जनस्तरीय dysplasias, monilethrix, Netherton सिंड्रोम, Menkes रोग, वंशानुगत बाह्यत्वचालयन bullosa और 11-13 alopecias जैसे रोगों के इलाज में उपयोगी हो जाएगा. इसके अतिरिक्त, जला घाव, पुराने घावों और अल्सर जैसे अन्य त्वचा की समस्याओं को स्टेम सेल से संबंधित 14,15 उपचारों से लाभ होगा . एक pluripotent (आईपीएस कोशिकाओं) राज्य 16,17 में वयस्क कोशिकाओं के reprogramming के लिए क्षमता को देखते हुए, मानव त्वचा में आसानी से सुलभ है और विस्तार योग्य वयस्क स्टेम सेल रोग के एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रेरण और बहाव थेरेपी के लिए कोशिकाओं का एक महत्वपूर्ण स्रोत प्रदान कर सकता है मधुमेह और पार्किंसंस रोग.
Protocol
1. मानव त्वचा से उपकला स्टेम सेल निकालें
- उपकला स्टेम कोशिकाओं को अलग करने की प्रक्रिया शुरू करने से पहले संबंधित medias और अभिकर्मकों (Table1 देखें) तैयार करने की जरूरत है.
- नया रूप प्रक्रियाओं या पंच बायोप्सी से ताजा वयस्क मानव खोपड़ी त्वचा एकत्र किया जाता है, तो DMEM 10% / FBS / (4 मिलीग्राम / एमएल) रातोंरात Dispase 4 डिग्री सेल्सियस में सेते 2-4 घंटा के लिए 37 पर ऊष्मायन ° सी भी प्रभावी है. त्वचा टुकड़े 1 सेमी की एक अधिकतम चौड़ाई के लिए घुसना एंजाइम के लिए अनुमति होना चाहिए.
- एक निष्फल पेट्री डिश में त्वचा का स्थानांतरण करने के लिए, त्वचा से त्वचा की सतह के पास बाल शाफ्ट लोभी और दृढ़ता से और सुचारू रूप से खींच द्वारा प्रत्येक बाल खींच. टेलोजन एक विदारक खुर्दबीन के नीचे अपने आकारिकी पर आधारित मंच पर रोम का चयन करें, बाहर उभाड़ना क्षेत्र में कटौती (चित्रा 1 ए) 15 एमएल निष्फल ट्यूब में हस्तांतरण के रोम. ऐनाजेन रोम भी अगर कूप के 1 / 3 ऊपरी कट बाल कूप "उभाड़ना" क्षेत्र (चित्रा 1 बी) प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- समय - समय मिलाते के साथ कमरे के तापमान पर 15-20 मिनट के लिए 0.05% (GIBCO) trypsin EDTA और Versene (0.53 मिमी EDTA 4Na, GIBCO) (1:1) का एक मिश्रण में पृथक कूप टुकड़े सेते जोड़ने, 4 एमएल DMEM 10 + % FBS प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, 800 rpm पर 5 मिनट के लिए नीचे स्पिन. वैकल्पिक रूप से, कूप ऊतक टुकड़ा explants संस्कृति में trypsin पचाने में बिना किया जा सकता है एकल रोम से संस्कृति की कोशिकाओं के लिए रखा.
- ध्यान से सतह पर तैरनेवाला त्यागें (~ 0.2-0.5 एमएल बचाने के लिए कोशिकाओं को खोने से बचने के) और 1 एमएल EGF (keratinocyte मध्यम) के बिना, KCM में फिर से निलंबित.
2. संस्कृति प्राथमिक उपकला स्टेम सेल
- संवर्धन से पहले उपकला स्टेम कोशिकाओं, सी का इलाज mitomycin 3T3 J2 कोशिकाओं (फीडर कोशिकाओं) निम्नलिखित के रूप में तैयार किया जाना चाहिए. 3T3-J2 कोशिकाओं DMEM में इलाज से पहले 10% FBS साथ सुसंस्कृत हैं. संवर्धन मीडिया निकालें और सेल पीबीएस के साथ दो बार धोने, 15μg एमएल / 37 पर 2 घंटा के लिए सीरम के बिना DMEM mitomycin सी ° सी, 5% सीओ 2 के साथ सेल का इलाज. Mitomycin सी युक्त DMEM निकालें और पीबीएस के साथ दो बार धोने के लिए, कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए तैयार हैं. (Mitomycin सी इलाज 3T3 J2 कोशिकाओं को भी पहले से तैयार किया जा सकता है और संग्रहीत -80 पर ° सी. पिघलना और बीज संवर्धन प्राथमिक उपकला स्टेम कोशिकाओं के एक दिन पहले की कोशिकाओं, 37 पर सेते डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 150,000-200,000. 6 अच्छी तरह से थाली के 3T3 J2 अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं की सिफारिश की है.
- बीज पृथक mitomycin पर बाल कूप 1.5 कदम से स्टेम सेल 37 पर रातोंरात EGF बिना KCM में 3T3 J2 कोशिकाओं सी इलाज डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, EGF युक्त KCM के लिए अगले दिन बदल. कक्ष 37 में बड़े हो रहे हैं ° सी एक उमस भरे माहौल में 5% से युक्त सीओ 2 . सभी keratinocytes KCM युक्त EGF के साथ हर 2 दिनों तंग आ चुके हैं और 14-20 दिनों के लिए हो. सेल खुर्दबीन के तहत हर दिन की जाँच करें. बाल कूप स्टेम कोशिकाओं कालोनियों (2A चित्रा) के रूप में होगा. बाल कूप explants 10-14 दिन (चित्रा 2B) के बाद outgrowths बनेगी.
3. पारित होने उपकला स्टेम सेल
- पीबीएस के साथ कोशिकाओं को एक बार धोएं. Versene उपचार (आरटी के लिए पूर्व - गरम) द्वारा 3T3 J2 फीडर कोशिकाओं निकालें. सेते संस्कृति Versene में 5 मिनट के लिए dished, फिर धीरे से मिलाने और बंद फीडर कोशिकाओं aspirate.
- बाल कूप स्टेम कोशिकाओं या तो Versene या पीबीएस एक समय के साथ धोएं.
- पूर्व गर्म जोड़ें (37 ° सी, महत्वपूर्ण) (2X) trypsin - EDTA और 37 पर सेते ° सी 7 मिनट या उससे अधिक समय यदि बाल कूप स्टेम सेल को अलग के लिए आवश्यक के लिए. अब और नहीं की तुलना में 15 मिनट सबसे अच्छा है.
- KCM w / ओ जोड़ें EGF trypsin बंद करो, धीरे से ऊपर विंदुक और नीचे करने के लिए कोशिकाओं को फैलाने के लिए, 200g में नीचे स्पिन, 5 मिनट.
- EGF, और mitomycin सी इलाज 3T3 J2 कोशिकाओं परत पर फिर से थाली गणना के बिना पुनः निलंबित KCM के साथ कोशिकाओं.
4. उपकला स्टेम कोशिकाओं अमर
प्राथमिक कोशिकाओं, यहां तक कि वयस्क स्टेम सेल, धारावाहिक और संस्कृति में पारित होने के महीनों के बाद senescence तक पहुँचने. प्राथमिक स्टेम कोशिकाओं की अमरता इस समस्या को दूर करने के लिए एक प्रभावी तरीका है.
- प्राथमिक फीडर परत पर 1 बीतने पर उपकला स्टेम कोशिकाओं (~ 350.000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह से थाली की) (3T3-J2) और 2 दिनों के लिए संस्कृति प्लेट.
- संस्कृति PA317 LXSN 16E6E7 सेल लाइन प्राथमिक DMEM 10% FBS युक्त के साथ उपकला स्टेम कोशिकाओं के बोने के बाद एक दिन. (यह लाइन amphotropic retrovirus LXSN16E6E7 जो HPV16 E6 और E7 खुला पढ़ने फ्रेम encodes का उत्पादन है, और जो stably संक्रमित और कई प्रकार की कोशिकाओं को अमर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है).
- PA317 LXSN 16E6E7 mitomycin सी (3T3-J2 कोशिकाओं के साथ समान प्रोटोकॉल) के साथ 2 घंटे के लिए सेल लाइन समझो. जोड़ें mitomycin सी EGF साथ KCM में 6 दिनों के लिए PA317 LXSN 16E6E7 सेल प्राथमिक उपकला स्टेम कोशिकाओं के लिए लाइन, सह संस्कृति का इलाज. EGF मीडिया के साथ हर 2 दिनों के ताजा KCM नवीनीकृत.
- 3T3 J2 निकालें और PA317 LXSN 16E6E7 Versene के साथ सेल. जोड़ें mitomycin सी इलाज 3T3 J2 NHP कोशिकाओं (neomycin, hygromycin, puromycin प्रतिरोधी, ~ अच्छी तरह से प्रति 200,000 कोशिकाओं) उपकला स्टेम कोशिकाओं के लिए. कक्ष 0.2 G418 (Gibco) मिलीग्राम / एमएल के तहत जोड़ने के लिए चयन कर रहे हैंitional दिन 6. EGF हर 2 दिनों मीडिया के साथ ताजा G418 युक्त KCM नवीनीकृत.
जीवित उपकला स्टेम कोशिकाओं को स्टेम सेल अमर हो जाएगा. प्राथमिक उपकला स्टेम कोशिकाओं जो PA317 LXSN 16E6E7 सेल के साथ नहीं सह सुसंस्कृत हैं की एक अच्छी तरह G418 चयन के लिए एक नियंत्रण के रूप में सेट किया जाना चाहिए, यह अच्छी तरह से में सभी कक्षों के चयन के 6 दिन बाद G418 द्वारा मारे होना चाहिए.
5. प्रतिनिधि परिणाम
त्वचा उपकला स्टेम कोशिकाओं और अमर उपकला स्टेम कोशिकाओं के प्रारंभिक बीतने तंग छोटे (चित्रा 2A) keratinocytes फीडर कोशिकाओं से घिरा मिलकर कालोनियों के रूप में. यदि परिभाषित की खुराक के साथ सीरम मुक्त मीडिया में एक फीडर परत के बिना, सुसंस्कृत, स्टेम कोशिकाओं को फैलाने और फार्म नहीं तंग कालोनियों (वे एकल कक्षों और छोटे समूहों के रूप में विकसित). अमर उपकला स्टेम कोशिकाओं> निरंतर पारित होने के 12 महीनों के लिए एक स्थिर phenotype बनाए रखने के लिए, लेकिन प्राथमिक कोशिकाओं की तुलना में तंग कालोनियों के रूप में खड़ा है. वे लंगर स्वतंत्र कालोनियों नरम अगर assays में फार्म नहीं है, यह दर्शाता है है कि इन कोशिकाओं को कैंसर कोशिकाओं की विशेषताओं अमर पास नहीं है. दोनों को प्राथमिक और उपकला स्टेम कोशिकाओं अमर बाल कूप स्टेम सेल मार्कर व्यक्त 15 cytokeratin (चित्र 3A), और epidermal, बाल कूप और वसामय प्रजातियों (चित्रा 3B - डी) में अंतर करने में सक्षम हैं.
चित्रा 1 बाल plucked. Dispase इलाज त्वचा से तोड़ के बाद, बालों के रोम या तो टेलोजन बालों के नीचे कोशिकाओं के आसपास की एक गेंद के साथ क्लब (ए) बाल, या (बी) के बालों की लंबाई आसपास उपकला के एक आस्तीन के साथ ऐनाजेन बाल के रूप में दिखाई देते हैं. टेलोजन उभाड़ना क्षेत्र में एक अलग शब्द के भागों सूक्ष्म काटना क्षेत्र रूपों, जबकि ऐनाजेन उभाड़ना कम अलग है. ऐनाजेन बल्ब मैट्रिक्स keratinocytes, कि और भी अलग सुसंस्कृत हो सकते हैं पारगमन amplifying कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व शामिल है.
चित्रा 2. स्टेम सेल संस्कृतियों. (ए) त्वचा फार्म तंग उपकला कालोनियों (ई द्वारा निर्दिष्ट) जब कोशिकाओं (एफ द्वारा नामित) के एक फीडर परत के साथ KCM में सुसंस्कृत से उपकला स्टेम कोशिकाओं. (बी) बाल कूप explants उपकला outgrowths को जन्म दे. टेलोजन उभाड़ना क्षेत्र (टी द्वारा निर्दिष्ट) डिश के लिए जुड़ा हुआ है और फीडर कोशिकाओं के साथ उपकला कोशिका कॉलोनी घिरा हुआ है.
चित्रा 3. स्टेम सेल भेदभाव. (ए) स्टेम सेल कालोनियों जैसे 15 cytokeratin के रूप में में उपकला मार्करों की अभिव्यक्ति बनाए रखें. (बी) उपकला स्टेम कोशिकाओं त्वचा बाल कूप के रूप में K6Hf अभिव्यक्ति द्वारा निर्धारित वंश के साथ भेदभाव किया जा सकता है है. (सी) कोशिकाओं de-epidermalized या हवा तरल इंटरफ़ेस में dermis अन्य matrices पर संवर्धित किया जा सकता है और cornified परत, बारीक परत और spinous परत के साथ एक स्तरीकृत epidermis के रूप में होगा. (डी) स्टेम कोशिकाओं तेल लाल सकारात्मक ग्लोबुलेस साथ वसामय वंश के साथ प्रेरित किया जा सकता है.
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Discussion
सेल निष्कर्षण और संस्कृति वर्णित विधियों आश्चर्यजनक सतही और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं. हम व्यक्तियों की एक व्यापक आयु सीमा के पार विरासत में मिला त्वचा 18 दोष के साथ रोगियों सहित दर्जनों से उपकला स्टेम सेल संस्कृतियों उत्पन्न किया है. यह सबसे अच्छा है ऊतक फसल के दिन की प्रक्रिया शुरू है, लेकिन कोशिकाओं को बर्फ पर मीडिया में कई दिनों के लिए व्यवहार्य, रहेगा अगर जरूरत रातोंरात शिपिंग की सुविधा. बेकार नया रूप त्वचा एकल कक्ष निलंबन के रूप में सेल निकासी के लिए व्यवहार्य रोम के सैकड़ों पैदावार. खोपड़ी का एक घूंसा बायोप्सी से जैसे सीमित ऊतक, के लिए, explant संस्कृतियों और अधिक प्रभावी हो सकता है, के बाद से वहाँ trypsinization और centrifugation में सेल घटाने के लिए कम मौका है हो सकता है. Explant संस्कृतियों के लिए, सबसे महत्वपूर्ण पहलू ऊतक पकवान करने के लिए टुकड़ा का लगाव है. जब तक outgrowths 10-14 दिनों में दिखाई देते हैं सिर्फ ऊतक और न्यूनतम हेरफेर को कवर मीडिया की छोटी मात्रा के अलावा सिफारिश की है.
वयस्क त्वचा से उपकला स्टेम कोशिकाओं के एक व्यापक आवेदन कर सकता है. संवर्धित त्वचा कोशिकाओं को जला रोगियों और पुराने घावों के लिए नैदानिक आवेदन में पहले से ही कर रहे हैं. अब चुनौती पसीना ग्रंथियों और बालों के साथ एक बेहतर त्वचा समकक्ष बनाने बन गया है. बालों के उत्थान के लिए त्वचा स्टेम कोशिकाओं के संभावित उपयोग के रोमांचक संभावना है.
जैसा कि पहले उल्लेख किया है, वयस्क कोशिकाओं में एक आदिम pluripotent राज्य प्रेरित करने की क्षमता भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 16,17 के उपयोग के बिना संभावित सेल आधारित चिकित्सा के लिए एक महत्वपूर्ण प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है. हालांकि, इस प्रक्रिया को अक्षम और संभावित oncogenic है, क्योंकि वायरल vectors के लिए स्टेम सेल के जीन की अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए उपयोग किया जाता है. यदि एक एक वयस्क स्टेम सेल की आबादी के साथ शुरू होता है, यह बहुत दक्षता में वृद्धि कर सकते हैं और स्थिर वायरल transfections pluripotency प्रेरित करने के लिए जरूरत नहीं रहेगी. अस्थि मज्जा स्टेम सेल के प्रत्यारोपण एक सेल आधारित दृष्टिकोण के रूप में उपयोग किया गया है बाह्यत्वचालयन bullosa जैसे गंभीर त्वचा रोगों के इलाज के अलावा 19,20, इन विट्रो में बाह्यत्वचालयन bullosa में कोलेजन 7 दोष का सुधार किया गया है रोगी keratinocytes में हासिल की. 21 एक त्वचा बायोप्सी से उपकला स्टेम कोशिकाओं के अलगाव के इस पहले काम पर विस्तार और व्यक्तिगत सेल ऑटोलॉगस कोशिकाओं का उपयोग चिकित्सा के विकास के लिए संसाधनों को प्रदान कर सकता है.
दिलचस्प यह है कि बाल कूप उभाड़ना क्षेत्र भी अन्य वयस्क स्टेम सेल / पूर्वपुस्र्ष सेल पूल की साइट है. Xu एट अल. 22 इस क्षेत्र से multipotent mesenchymal स्टेम सेल की पहचान की है. Melanocyte व्यापारियों को भी बाल उभाड़ना 23 में रहते हैं . इस प्रकार, बाल कूप अलगाव यहाँ प्रस्तुत विधि आसानी से आगे के प्रयोग के लिए इन अन्य प्रकार की कोशिकाओं को अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम के NIH / NCI R01CA 118,916 अनुदान द्वारा वित्त पोषित है
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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