Summary
Uma maneira rápida e robusta de isolar células-tronco adultas viável epiteliais da pele humana é descrito. O método utiliza a digestão enzimática da matriz de colágeno da pele, seguido por arrancar dos folículos pilosos e isolamento de células em suspensão simples ou fragmentos de tecido para cultura de células.
Abstract
A homeostase de todos os tecidos auto-renovação é dependente das células-tronco adultas. Como células-tronco indiferenciadas sofrer divisões assimétricas, que geram células-filhas que mantêm o fenótipo de células-tronco e trânsito ampliando-cells (células TA) que migram do nicho de células-tronco, são submetidos a rápida proliferação e diferenciação terminal para repovoar o tecido.
Células-tronco epiteliais foram identificados na epiderme, folículo piloso, e intestino como células com alto potencial proliferativo in vitro e como o ciclismo slow-label de retenção de células in vivo 1-3. Adulto, tecido-específicos de células-tronco são responsáveis pela regeneração dos tecidos em que residem durante turnover fisiológico normal, assim como em épocas de estresse 4-5. Além disso, as células-tronco são geralmente consideradas como multi-potentes, possuindo a capacidade de dar origem a vários tipos de células dentro do tecido 6. Por exemplo, roedor cabelos células-tronco do folículo pode gerar epiderme, glândulas sebáceas e folículos pilosos 7-9. Nós mostramos que as células-tronco do humano região bojo folículo piloso apresentam potencialidade multi-10.
Células-tronco tornaram-se uma ferramenta valiosa na pesquisa biomédica, devido à sua utilidade como um sistema in vitro para estudar a biologia do desenvolvimento, diferenciação, tumorigênese e para a sua eventual utilidade terapêutica. É provável que células-tronco adultas do epitélio será útil no tratamento de doenças como displasias ectodérmicas, monilethrix, síndrome de Netherton, doença de Menkes, epidermólise bolhosa hereditária e alopecias 11-13. Além disso, outros problemas de pele, como queimaduras, feridas crônicas e úlceras irá beneficiar de terapias com células-tronco relacionadas 14,15. Dado o potencial para a reprogramação de células adultas em estado pluripotentes (células iPS) 16,17, as células adultas de fácil acesso e expansível-tronco na pele humana pode fornecer uma valiosa fonte de células para a indução e terapia a jusante de uma ampla gama de doenças, incluindo diabetes e doença de Parkinson.
Protocol
1. Extrair células-tronco epiteliais da pele humana
- Antes de iniciar o procedimento de isolar células-tronco epiteliais é preciso preparar os respectivos meios e reagentes (ver tabela 1).
- Frescos adulto pele do couro cabeludo humano de procedimentos facelift ou biópsia com punch é coletado e, em seguida incubar em DMEM FBS / 10% / Dispase (4 mg / mL) durante a noite a 4 ° C. Incubação por 2-4 horas a 37 ° C também é eficaz. Pedaços de pele deve ser uma largura máxima de 1 cm para permitir a enzima para penetrar.
- Transferir a pele em uma placa de Petri esterilizada, retire cada cabelo da pele, segurando o eixo do cabelo perto da superfície da pele e puxando com firmeza e sem sobressaltos. Selecione folículos na fase telógena com base na sua morfologia em um microscópio de dissecação, cortar a região protuberância (Figura 1A) folículos transferência para um tubo de 15 mL esterilizados. Folículos anágenos também pode ser usado se cortado em cima 1 / 3 do folículo para obter folículo piloso "protuberância" região (Figura 1B).
- Incubar os fragmentos folículo isolado em uma mistura de 0,05% de tripsina-EDTA (GIBCO) e Versene (0,53 mM EDTA 4NA, GIBCO) (1:1) para 15-20 minutos em temperatura ambiente com agitação periodicamente, adicionar 4 mL DMEM + 10 FBS% para parar a reação, spin baixo por 5 min a 800 rpm. Alternativamente, explantes folículo fragmento de tecido podem ser colocados em cultura sem tripsina digerir a cultura de células de folículos único.
- Elimine o sobrenadante com cuidado (salvo ~ mL 0,2-0,5 para evitar a perda de células) e re-suspensão em 1 mL KCM (médio queratinócitos), sem EGF.
2. Cultura primária epitelial Células-Tronco
- Antes de cultivar as células-tronco epiteliais, mitomicina C-tratados 3T3-J2 células (células de alimentação) deve ser preparado da seguinte forma. 3T3-J2 células são cultivadas em DMEM com 10% de FBS antes do tratamento. Remova a mídia de cultura de células e lavar duas vezes com PBS, tratar células com mitomicina C 15μg / mL em DMEM sem soro para 2 hr a 37 ° C, 5% CO 2. Remova a mitomicina C contendo DMEM e lavar duas vezes com PBS, as células estão prontas para uso. (Mitomicina C tratados com células 3T3-J2 também pode ser preparado previamente e armazenadas a -80 ° C. Descongele e semente as células um dia antes de cultivo primário de células-tronco epiteliais, incubar a 37 ° C CO, 5% 2. 150.000-200.000 3T3-J2 células por poço da placa 6-bem é recomendado.
- Sementes isoladas células-tronco do folículo de cabelo a partir do passo 1.5 em mitomicina C-tratados 3T3-J2 células em KCM sem EGF durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2, alterado para EGF contendo KCM no dia seguinte. As células são cultivadas a 37 ° C em uma atmosfera úmida contendo 5% de CO 2. Todos os queratinócitos são alimentados com KCM contendo EGF a cada 2 dias e cultivadas por 14-20 dias. Verifique celular todos os dias sob o microscópio. Células-tronco do folículo do cabelo irá formar colônias (Figura 2A). Explantes folículo piloso formarão outgrowths após 10-14 dias (Figura 2B).
3. Células-tronco epiteliais passagem
- Lavar as células com PBS uma vez. Remover as células 3T3-J2 alimentador por Versene tratamento (pré-aquecido a RT). Incubar a cultura dished em Versene por 5 minutos, em seguida, agite e aspirar as células do alimentador.
- Lave as células-tronco do folículo de cabelo com qualquer Versene ou tempo PBS um.
- Adicionar pré-aquecido (a 37 ° C, crítico) de tripsina-EDTA (2X) e incubar a 37 ° C por 7 minutos ou mais se necessário para a célula-tronco de folículo piloso para separar. Não mais que 15 minutos é o melhor.
- Adicionar KCM w / o EGF para parar a tripsina, gentilmente pipeta cima e para baixo para dispersar as células, spin baixo em 200g, a 5 minutos.
- Re-suspender as células com KCM sem EGF Count, e re-placa em mitomicina C tratados com camada de células 3T3-J2.
4. Imortalizar Células-Tronco Epiteliais
Pilhas, células-tronco adultas, mesmo, chegar a senescência após a passagem de série e meses em cultura. Imortalização de células-tronco primário é uma forma eficaz para aliviar este problema.
- Placa primária de células-tronco epiteliais (~ 350 mil células / poço de 6 de placa bem) em uma passagem sobre a camada de alimentação (3T3-J2) e cultura para 2 dias.
- Cultura PA317 LXSN linha celular 16E6E7 um dia após a semeadura primária de células-tronco epiteliais com DMEM contendo 10% FBS. (Esta linha produz o LXSN16E6E7 retrovírus amphotropic que codifica o HPV16 E6 e E7 quadros de leitura aberta, e que pode ser usado para infectar e se estavelmente imortalizar muitos tipos de células).
- Tratar PA317 LXSN linha celular 16E6E7 com mitomicina C por 2 horas (mesmo protocolo com 3T3-J2 células). Adicionar mitomicina C tratados PA317 LXSN linha celular 16E6E7 ao primário de células-tronco epiteliais, co-cultura por 6 dias no KCM com EGF. Renovar KCM fresco com EGF media a cada 2 dias.
- Remover 3T3-J2 e PA317 LXSN 16E6E7 célula com Versene. Adicionar mitomicina-C trataram células 3T3-J2 NHP (neomicina, higromicina, puromicina resistentes, ~ 200.000 células por poço) para as células-tronco epiteliais. Células estão selecionadas em 0,2 mg / ml de G418 (Gibco) para adicionaritional 6 dias. Renovar KCM G418 fresco contendo com EGF media a cada 2 dias.
Sobrevivendo células-tronco epiteliais será imortalizado células-tronco. Um bem de células-tronco epiteliais primários que não são co-cultivados com PA317 LXSN 16E6E7 célula deve ser definido como um controlo para a selecção G418, todas as células desse bem deve ser morto por G418 após 6 dias de seleção.
5. Resultados representante
Passagem precoce de células epiteliais da pele-tronco e células-tronco epiteliais imortalizada formam colónias apertado consistindo de pequenas queratinócitos (Figura 2A) rodeado por células alimentadoras. Se cultivadas em soro de mídia livre com suplementos definido, sem uma camada de alimentação, as células-tronco se dispersa e não formam colônias apertado (elas crescem como células únicas e pequenos aglomerados). Células-tronco epiteliais imortalizada manter um fenótipo estável por> 12 meses de passagem contínua, mas tendem a formar colônias mais apertado do que as células primárias. Eles não formam colônias de ancoragem independente em ensaios agar suave, indicando que estas células imortalizadas não possuem as características de células cancerosas. Primário e as células-tronco epiteliais imortalizada expressar folículo piloso marcador de células-tronco citoqueratina 15 (Figura 3A), e são capazes de se diferenciar em folículo piloso epidérmica, e linhagens sebáceas (Figura 3B-D).
Figura 1. Dedilhados cabelos. Após arrancar a partir de dispase tratados com pele, folículos pilosos aparecem tanto como os cabelos telógeno clube (A) com uma bola de células em torno do fundo do cabelo, ou cabelos anágenos (B) com uma manga de epitélio em torno do comprimento do cabelo. A região bojo telógeno forma uma região distinta morfológicas para micro-dissecção, enquanto o bojo anágena é menos distintas. A lâmpada contém anagen queratinócitos da matriz, o que representa trânsito ampliando-células que também podem ser isoladas e cultivadas.
Figura células 2. Culturas Stem. (A) células-tronco epiteliais da pele forma apertada colônias epiteliais (designado por E), quando cultivadas em KCM com uma camada de células de alimentação (designados por F). (B) explantes follicle do cabelo dar origem a outgrowths epiteliais. A região bojo telógeno (designada por T) é anexado ao prato e cercada de colônias de células epiteliais com células alimentadoras.
Figura 3. Diferenciação de células-tronco. (A) As células-tronco manter colônias expressão de marcadores epiteliais como citoqueratina 15. (B) células-tronco epiteliais de pele pode ser diferenciada ao longo da linhagem folículo piloso como determinado pela expressão K6Hf. (C) As células podem ser cultivadas em de-epidermalized derme ou outras matrizes na interface ar-líquido e formar uma camada de epiderme estratificada com cornified, camada granular e camada espinhosa. (D) As células-tronco podem ser induzidas ao longo da linhagem sebáceas com Oil Red glóbulos positivo.
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Discussion
Os métodos de extração de células e cultura descritos são surpreendentemente fáceis e reprodutíveis. Temos gerado culturas de células-tronco epiteliais de dezenas de indivíduos através de uma faixa etária ampla, incluindo pacientes com defeitos da pele herdado 18. É melhor para começar o processo no dia da colheita de tecidos, no entanto células permanecerá viável nos meios de comunicação sobre o gelo por vários dias, facilitando o transporte de noite, se necessário. Pele facelift descartados rende centenas de folículos viáveis para a extração de células como suspensões única célula. Para mais tecido limitada, como o de uma biópsia com punch do couro cabeludo, culturas explante pode ser mais eficaz, uma vez que há menos chance de perda de células em tripsinização e centrifugação. Para as culturas de explante, o aspecto mais importante é o apego do fragmento de tecido para o prato. A adição de pequenas quantidades de media apenas cobrindo a manipulação dos tecidos e mínima é recomendada até conseqüências aparecem em 10-14 dias.
Células-tronco adultas do epitélio da pele pode ter uma ampla aplicação. Células da pele cultivadas já estão em aplicação clínica para pacientes vítimas de queimaduras e feridas crônicas. O desafio, agora, tornou-se a criação de um equivalente melhor pele com glândulas sudoríparas e cabelo. A utilização potencial das células-tronco para a regeneração da pele cabelo é possibilidade emocionante.
Como mencionado anteriormente, a capacidade de induzir a um estado pluripotente primitiva em células adultas representa um avanço significativo para as terapias celulares com base em potencial sem a utilização de células-tronco embrionárias 16,17. No entanto, o processo é ineficaz e potencialmente oncogênicos, desde vetores virais são usados para induzir a expressão de genes de células-tronco. Se um começa com uma população de células-tronco adultas, pode aumentar significativamente a eficiência e evitar a necessidade de estabilidade transfections viral para induzir a pluripotência. Transplante de células tronco de medula óssea tem sido utilizada como uma abordagem baseada em células para tratar doenças de pele graves, como epidermólise bolhosa. 19,20 Além disso, a correção do defeito do colágeno 7 na epidermólise bolhosa foi alcançado nos queratinócitos paciente in vitro 21. isolamento de células-tronco epiteliais de uma biópsia de pele pode fornecer recursos para expandir este trabalho anterior e desenvolver terapias com células individualizadas, usando células autólogas.
É interessante notar que o cabelo região bojo folículo é também o local de outros pools de células-tronco adultas / células progenitoras. Xu et al. 22 identificou células-tronco mesenquimais multipotentes da região. Precursores de melanócitos também residem no bojo do cabelo 23. Assim, o método de isolamento de folículos de cabelo aqui apresentadas podem ser facilmente adaptado para isolar esses outros tipos de células para fazer novas experiências.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho é financiado pelo NIH / NCI conceder R01CA-118916
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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