Summary
Een snelle, robuuste manier van isoleren levensvatbare volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid is beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische afbraak van de huid collageen matrix, gevolgd door het plukken van de haarfollikels en isolatie van single cell suspensies of weefsel fragmenten voor celkweek.
Abstract
De homeostase van alle zelf-vernieuwing weefsels is afhankelijk van volwassen stamcellen. Als ongedifferentieerde stamcellen ondergaan asymmetrische divisies, genereren ze dochter cellen die de stamcellen fenotype en doorvoer-versterkende cellen (TA-cellen) die migreren van de stamcel niche, ondergaan een snelle proliferatie en terminaal differentiëren om het weefsel opnieuw te bevolken behouden.
Epitheliale stamcellen zijn geïdentificeerd in de epidermis, haarfollikels, en darm als cellen met een hoge in vitro proliferatieve potentieel en als slow-fiets-label het behoud van cellen in vivo 1-3. Volwassen, weefsel-specifieke stamcellen zijn verantwoordelijk voor de regeneratie van de weefsels waarin zij wonen tijdens de normale fysiologische omzet als in tijden van stress 4-5. Bovendien worden stamcellen algemeen beschouwd als multi-potente, bezitten het vermogen om aanleiding te geven tot meerdere celtypen in het weefsel 6. Zo kan bijvoorbeeld knaagdieren haarzakjes stamcellen te genereren epidermis, talgklieren en haarfollikels 7-9. We hebben aangetoond dat stamcellen uit de menselijke haar follikel bobbel regio multi-potentialiteit 10 vertonen.
Stamcellen zijn uitgegroeid tot een waardevol hulpmiddel in het biomedisch onderzoek, als gevolg van hun nut als een in vitro systeem voor het bestuderen van ontwikkelingsbiologie, differentiatie, tumorigenese en voor hun mogelijke therapeutische nut. Het is waarschijnlijk dat volwassen epitheliale stamcellen nuttig zal zijn bij de behandeling van ziekten zoals ectodermale dysplasie, monilethrix, Netherton syndroom, ziekte van Menkes, erfelijke epidermolysis bullosa en alopecia 11-13. Daarnaast zullen ook andere huidproblemen zoals brandwonden, chronische wonden en zweren profiteren van stamcellen verwante therapieën 14,15. Gezien het potentieel voor herprogrammering van volwassen cellen in een pluripotente staat (iPS cellen) 16,17, het gemakkelijk toegankelijk en uitbreidbaar volwassen stamcellen in de menselijke huid kan een waardevolle bron van cellen voor inductie-en downstream-therapie voor een breed scala van ziekte, met inbegrip diabetes en de ziekte van Parkinson.
Protocol
1. Extract Epitheliale stamcellen uit menselijke huid
- Voordat u begint met de procedure van het isoleren van epitheliale stamcellen moet men ter voorbereiding van de respectievelijke media en reagentia (zie tabel 1).
- Verse volwassen mens hoofdhuid van facelift procedures of punch biopsie wordt verzameld, vervolgens incuberen in DMEM / 10% FBS / Dispase (4 mg / ml) overnacht bij 4 ° C. Incubatie gedurende 2-4 uur bij 37 ° C is ook effectief. Huid stukken moeten een maximale breedte van 1 cm mogelijk te maken enzym te dringen worden.
- Overdracht van de huid in een gesteriliseerde petrischaal, trek elke haar op de huid vast te pakken door de haarschacht in de buurt van het huidoppervlak en trekken stevig en soepel. Kies follikels in telogene fase op basis van hun morfologie onder een dissectiemicroscoop, knip de uitstulping regio (figuur 1A) overdracht van follikels in een 15 ml gesteriliseerd buis. Anageen follikels kunnen ook gebruikt worden als gesneden in de bovenbouw van 1 / 3 van follikel tot haarfollikel "bulge" regio (Figuur 1B) te verkrijgen.
- Incubeer de geïsoleerde follikel fragmenten in een mengsel van 0,05% trypsine-EDTA (GIBCO) en Versene (0,53 mM EDTA 4NA, GIBCO) (1:1) voor 15-20 min bij kamertemperatuur onder schudden periodiek, voeg 4 ml DMEM + 10 % FBS om reactie te stoppen, spin down gedurende 5 min bij 800 rpm. Als alternatief kan follikel weefsel fragment explanten worden geplaatst in cultuur zonder trypsine digest om de cultuur cellen van enkele follikels.
- Zorgvuldig Gooi supernatans (behalve ~ 0.2-0.5 ml om te voorkomen dat cellen) en resuspendeer in 1 mL KCM (keratinocyten medium), zonder EGF.
2. Cultuur Primair Epitheliale Stem Cells
- Voor het kweken van de epitheliale stamcellen, mitomycine C-behandelde 3T3-J2 cellen (feeder-cellen) moeten worden voorbereid als volgt. 3T3-J2 cellen worden gekweekt in DMEM met 10% FBS voor de behandeling. Verwijder het kweken van media en twee keer wassen cel met PBS, behandel cel met 15μg / ml mitomycine C in DMEM zonder serum gedurende 2 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. Verwijder de mitomycine C-bevattende DMEM en was tweemaal met PBS, de cellen zijn klaar voor gebruik. (Mitomycine C-behandelde 3T3-J2 cellen kunnen ook vooraf worden bereid en bewaard bij -80 ° C. Ontdooi en zaad van de cellen een dag voor het kweken van primaire epitheliale stamcellen, incuberen bij 37 ° C, 5% CO 2. 150.000-200.000 3T3-J2 cellen per putje van 6-wells plaat wordt aanbevolen.
- Zaad geïsoleerde haarfollikel stamcel uit stap 1.5 op mitomycine C-behandelde 3T3-J2 cellen in KCM zonder EGF-nacht bij 37 ° C, 5% CO 2, veranderd in EGF-bevattende KCM de volgende dag. Cellen worden gekweekt bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% CO 2. Alle keratinocyten worden gevoed met KCM met EGF om de 2 dagen en gegroeid voor 14-20 dagen. Controleer cel elke dag onder de microscoop. Haarfollikel stamcellen vormen kolonies (figuur 2A). Haarzakje explantaten zal vormen uitwassen na 10-14 dagen (Figuur 2B).
3. Passage Epitheliale Stem Cells
- Een keer wassen cellen met PBS. Verwijder 3T3-J2 feeder cellen door Versene (voorverwarmd tot RT) behandeling. Incubeer cultuur opgedist in Versene gedurende 5 minuten, dan schud en zuig af feeder cellen.
- Was de haarfollikel stamcellen met ofwel Versene of PBS een keer.
- Voeg voorverwarmde (tot 37 ° C, kritische) trypsine-EDTA (2X) en incubeer bij 37 ° C gedurende 7 minuten of langer indien nodig voor de haarfollikel stamcellen te los te maken. Niet langer dan 15 minuten is het beste.
- Voeg KCM w / o EFG aan het trypsine te stoppen, zacht pipet op en neer naar de cellen te verspreiden, spin down in 200g, 5 minuten.
- Re-schorten cellen met KCM zonder EGF, graaf-en re-plaat op mitomycine C-behandelde 3T3-J2 cellen laag.
4. Vereeuwigen Epitheliale Stem Cells
Primaire cellen, zelfs volwassen stamcellen, te bereiken veroudering na seriële passage en maanden in de cultuur. Immortalisatie van primaire stamcellen is een effectieve manier om dit probleem te verlichten.
- Plaat primaire epitheliale stamcellen (~ 350.000 cellen / putje van 6 putjes plaat) op een passage op feeder layer (3T3-J2) en cultuur voor 2 dagen.
- Cultuur PA317 LXSN 16E6E7 cellijn een dag na het uitzaaien van de primaire epitheliale stamcellen met DMEM met 10% FBS. (Deze lijn produceert de amfotrope retrovirus LXSN16E6E7 die de HPV16 E6 en E7 open reading frames codeert, en die kunnen worden gebruikt om stabiel te infecteren en vereeuwigen vele soorten cellen).
- Behandel PA317 LXSN 16E6E7 cellijn met mitomycine C gedurende 2 uur (zelfde protocol met 3T3-J2 cellen). Voeg mitomycine C die werden behandeld PA317 LXSN 16E6E7 cellijn aan de primaire epitheliale stamcellen, co-cultuur voor 6 dagen in KCM met de EGF. Vernieuwen verse KCM met EGF media om de 2 dagen.
- Verwijder 3T3-J2 en PA317 LXSN 16E6E7 cel met Versene. Voeg mitomycine-C behandeld 3T3-J2 NHP cellen (neomycine, hygromycine, puromycine bestendig, ~ 200.000 cellen per well) aan de epitheliale stamcellen. Cellen zijn geselecteerd onder 0,2 mg / ml G418 (Gibco) voor de toe te voegennele 6 dagen. Vernieuwen verse G418 met KCM met EGF media om de 2 dagen.
Overleven epitheliale stamcellen wordt vereeuwigd stamcellen. Een goed van primaire epitheliale stamcellen, die niet zijn co-gekweekt met PA317 LXSN 16E6E7 cel moeten worden ingesteld als een controle voor G418 selectie, moeten alle cellen in deze goed worden gedood door G418 na 6 dagen van de selectie.
5. Representatieve resultaten
Vroege passage van de huid epitheliale stamcellen en onsterfelijk epitheliale stamcellen vormen strakke kolonies bestaande uit kleine keratinocyten (Figuur 2A), omringd door feeder cellen. Als gekweekt in serum vrije media met bepaalde supplementen, zonder dat een feeder-laag, zal de stamcellen verspreiden en vormen geen strak kolonies (ze groeien als afzonderlijke cellen en kleine clusters). Onsterfelijk epitheliale stamcellen handhaven van een stabiel fenotype voor> 12 maanden van continue passage, maar de neiging om strakker kolonies dan de primaire cellen vormen. Ze vormen geen verankering onafhankelijke kolonies in zachte agar testen, wat aangeeft dat deze onsterfelijk gemaakte cellen niet de kenmerken van kankercellen bezitten. Zowel primaire als onsterfelijk epitheliale stamcellen te uiten haarzakjes stamcellen cytokeratine 15 (figuur 3A), en zijn in staat om te differentiëren in de epidermale, haarzakje en talgklieren lijnen (Figuur 3B-D).
Figuur 1. Geplukt haren. Na het plukken van dispase-behandelde huid, haarzakjes verschijnen als of telogeen club haren (A) met een bal van cellen rondom de onderkant van het haar, of anagene haren (B) met een hoes van epitheel rond de lengte van het haar. De telogene uitstulping regio vormt een duidelijke morfologische regio om micro-ontleden, terwijl de anagene uitstulping is minder duidelijk. De anagene lamp bevat matrix keratinocyten, wat neerkomt op transit-versterkende cellen die ook kan worden geïsoleerd en gekweekt.
Figuur 2. Stamcellen culturen. (A) Epitheliale stamcellen uit de huid strak vorm epitheliale kolonies (aangewezen door E) wanneer gekweekt in KCM met een feeder laag van cellen (aangewezen door F). (B) Haarfollikel explantaten aanleiding geven tot epitheliale uitwassen. De telogene uitstulping regio (aangewezen door T) is aangesloten op de schotel en omgeven epitheelcellen kolonie samen met de feeder cellen.
Figuur 3. Stamcellen differentiatie. (A) Stamcellen kolonies te behouden expressie van epitheliale merkers zoals cytokeratine 15. (B) Huid-epitheliale stamcellen kunnen worden onderscheiden langs de haarfollikel afstamming, zoals bepaald door K6Hf expressie. (C) De cellen kunnen worden gekweekt op de-epidermalized dermis of andere matrices bij de lucht-vloeistof interface en zal een gelaagde epidermis met verhoornde laag, granulaire laag en doornuitsteeksels laag te vormen. (D) Stamcellen kunnen worden opgewekt langs de talg lijn met Oil Red positieve bolletjes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cel beschreven extractie en cultuur methodes zijn verrassend gemakkelijke en reproduceerbaar zijn. We hebben gegenereerd epitheliale stamcellen kweken uit tientallen van personen over een ruime leeftijdsgroep, waaronder patiënten met erfelijke afwijkingen van de schil 18. Het beste is om het proces te beginnen op de dag van weefsel oogst, maar cellen levensvatbaar blijven in de media op ijs gedurende meerdere dagen, het vergemakkelijken van de scheepvaart 's nachts als dat nodig is. Afgedankte facelift huid levert honderden levensvatbare follikels voor cel-extractie als enkele celsuspensies. Voor meer beperkte weefsel, zoals van een punch biopsie van de hoofdhuid, kan explantatie culturen effectiever zijn, want er is minder kans op cel-verlies in trypsine en centrifugeren. Voor Explantatie culturen, het meest belangrijke aspect is de bevestiging van het weefsel fragment aan het gerecht. De toevoeging van kleine hoeveelheden van de media alleen maar over het weefsel en de minimale manipulatie is aanbevolen tot de uitwassen verschijnen in 10-14 dagen.
Volwassen epitheliale stamcellen uit de huid kan een brede toepassing. Gekweekte huidcellen zijn reeds in de klinische toepassing voor patiënten met brandwonden en chronische wonden. De uitdaging is nu het creëren van een betere huid equivalent met de zweetklieren en haren. De potentiële benutting van de huid stamcellen voor haar regeneratie is spannend mogelijkheid.
Zoals eerder vermeld, de mogelijkheid om een primitieve pluripotente toestand te induceren in volwassen cellen vormt een belangrijke ontwikkeling voor potentiële cell-based therapieën, zonder het gebruik van embryonale stamcellen 16,17. Echter, het proces is inefficiënt en potentieel oncogene, omdat virale vectoren worden gebruikt om de expressie van stamcel genen induceren. Als men begint met een volwassen stamcel populatie, kan het sterk verhogen van de efficiëntie en de nood aan stabiele virale transfecties te bewegen pluripotentie. Transplantatie van beenmerg stamcellen is gebruikt als een cel-gebaseerde benadering van ernstige huidaandoeningen zoals epidermolysis bullosa te behandelen. 19,20 In aanvulling, correctie van het collageen 7 defect in epidermolysis bullosa is geboekt bij de patiënt keratinocyten in vitro. 21 Isolatie van epitheliale stamcellen uit een huidbiopsie kunnen middelen uit te breiden op dit eerdere werk en de ontwikkeling van geïndividualiseerde celtherapie met behulp van autologe cellen.
Het is interessant dat de haarfollikel verdikking regio is ook de site van andere volwassen stamcellen / voorlopercellen cel zwembaden. Xu et al.. 22 heeft geïdentificeerd multipotente mesenchymale stamcellen uit deze regio. Melanocyt voorlopers ook wonen in het haar uitstulping 23. Zo kan het haarzakje isolatie methode hier gepresenteerde gemakkelijk worden aangepast aan deze andere soorten cellen te isoleren voor verdere experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk wordt gefinancierd door NIH / NCI verlenen R01CA-118916
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
|||
[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
|||
References
- Jones, P. H., Watt, F. M. Separation of human epidermal stem cells from transit amplifying cells on the basis of differences in integrin function and expression. Cell. 73, 713-724 (1993).
- Lyle, S., Christofidou-Solomidou, M., Liu, Y., Elder, D. E., Albelda, S., Cotsarelis, G. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J. Cell. Sci. 111, 3179-3188 (1998).
- Bac, S. P., Reneha, A. G., Potte, C. S. Stem cells: the intestinal stem cell as a paradigm. Carcinogenesis. 21, 469-476 (2000).
- Slac, J. M. Stem cells in epithelial tissues. Science. 287, 1431-1433 (2000).
- It, M., Li, Y., Yan, Z., Nguye, J., Lian, F., Morri, R. J., Cotsarelis, G. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11, 1351-134 (2005).
- Spradlin, A., Drummond-Barbos, D., Kai, T. Stem cells find their niche. Nature. 414, 98-104 (2001).
- Taylo, G., Lehre, M. S., Jense, P. J., Su, T. T., Lavke, R. M. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Cell. 102, 451-461 (2000).
- Oshim, H., Rocha, A., Kedzi, C., Kobayash, K., Barrandon, Y. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell. 104, 233-245 (2001).
- Morri, R. J., Li, Y., Marle, L., Yan, Z., Trempu, C., L, S., Li, J. S., Sawick, J. A. Cotsarelis G Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat. Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
- Ro, C., Roch, M., Gu, Z., Photopoulo, C., Ta, Q., Lyle, S. Multi-potentiality of a new immortalized epithelial stem cell line derived from human hair follicles. In vitro Cell. & Dev. Biol. 44, 236-244 (2008).
- Ohyama, M., Vogel, J. C. G. ene delivery to the hair follicle. J Investig Dermatol Symp Proc. 8, 204-206 (2003).
- Sugiyama-Nakagiri, Y., Akiyama, M., Shimizu, H. Hair follicle stem cell-targeted gene transfer and reconstitution system. Gene Ther. 13, 732-737 (2006).
- Stenn, K. S., Cotsarelis, G. Bioengineering the hair follicle: fringe benefits of stem cell technology. Curr Opin Biotechnol. 16, 493-497 (2005).
- Hoeller, D. An improved and rapid method to construct skin equivalents from human hair follicles and fibroblasts. Exp Dermatol 10. , 264-271 (2001).
- Navsaria, H. A., Ojeh, N. O., Moiemen, N., Griffiths, M. A., Frame, J. D. Reepithelialization of a full-thickness burn from stem cells of hair follicles micrografted into a tissue-engineered dermal template (Integra). Plast Reconstr Surg. 113, 978-981 (2004).
- Werni, M., Meissne, A., Forema, R., Brambrin, T., K, M., Hochedlinge, K., Bernstei, B. E., Jaenisch, R. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448, 318-324 (2007).
- Par, I. H., Zha, R., Wes, J. A., Yabuuch, A., Hu, H., Inc, T. A., Lero, P. H., Lensc, M. W., Dale, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Kazantsev, A., Goltso, A., Zinchenk, R., Grigorenk, A. P., Abrukov, A. V., Moliak, Y. K., Kirillo, A. G., Gu, Z., Lyl, S., Ginte, E. K., Rogae, E. I. Human hair growth deficiency is linked to a genetic defect in the phospholipase gene LIPH. Science. 314, 982-985 (2006).
- Tola, J., Ishida-Yamamot, A., Riddl, M., McElmurr, R. T., Osbor, M., Xi, L., Lun, T., Slatter, C., Uitt, J., Christian, A. M., Wagne, J. E., Blaza, B. R. Amelioration of epidermolysis bullosa by transfer of wild-type bone marrow cells. Blood. 113, 1167-1174 (2009).
- Wagne, J. E., Ishida-Yamamot, A., McGrat, J. A., Hordinsk, M., Keen, D. R., Riddl, M. J., Osbor, M. J., Lun, T., Dola, M., Blaza, B. R., Tolar, J. Bone marrow transplantation for recessive dystrophic epidermolysis bullosa. N Engl J Med. 363, 629-639 (2010).
- Muraue, E. M., Gach, Y., Grat, I. K., Klausegge, A., Mus, W., Grube, C., Meneguzz, G., Hintne, H., Baue, J. W. Functional Correction of Type VII Collagen Expression in Dystrophic Epidermolysis Bullosa. J Invest Dermatol. , Forthcoming (2010).
- Y, H., Kuma, S. M., Kossenko, A. V., Show, L., X, X. Stem cells with neural crest characteristics derived from the bulge region of cultured human hair follicles. J Invest Dermatol. 130, 1227-1236 (2010).
- Nishimur, E. K., Grante, S. R., Fishe, D. E. Mechanisms of hair graying: incomplete melanocyte stem cell maintenance in the niche. Science. 307, 720-724 (2005).
