Summary
Une façon rapide, robuste d'isoler des cellules adultes viables souches épithéliales de la peau humaine est décrite. La méthode utilise la digestion enzymatique de la matrice collagène de la peau, suivie par la plumaison des follicules pileux et à l'isolement des suspensions de cellules uniques ou fragments de tissus pour la culture cellulaire.
Abstract
L'homéostasie de tous les tissus d'auto-renouvellement est dépendant sur les cellules souches adultes. Comme les cellules souches indifférenciées subissent des divisions asymétriques, elles génèrent des cellules filles qui gardent le phénotype de cellules souches et de transit d'amplification des cellules (cellules TA) qui migrent de la niche de cellules souches, subissent la prolifération rapide et en phase terminale se différencier pour repeupler le tissu.
Les cellules souches épithéliales ont été identifiés dans l'épiderme, du follicule pileux, et de l'intestin que les cellules avec un haut potentiel prolifératif in vitro et en tant que lente vélo étiquette de rétention des cellules in vivo 1-3. Adulte, tissu-spécifique des cellules souches sont responsables de la régénération des tissus dans lesquels ils résident pendant le changement physiologique normale, ainsi que pendant les périodes de stress 4-5. Par ailleurs, les cellules souches sont généralement considérés comme étant multi-puissant, possédant la capacité de donner naissance à plusieurs types de cellules dans le tissu 6. Par exemple, les cellules de rongeurs souches du follicule pileux peut générer l'épiderme, les glandes sébacées et les follicules pileux 7-9. Nous avons montré que les cellules souches provenant de la région bulbe du follicule pileux humain présentent multi-potentialité 10.
Les cellules souches sont devenues un outil précieux dans la recherche biomédicale, en raison de leur utilité comme un système in vitro pour étudier la biologie du développement, la différenciation, la tumorigenèse et de leur utilité thérapeutique possible. Il est probable que les cellules souches adultes épithéliales sera utile dans le traitement de maladies telles que dysplasies ectodermiques, monilethrix, Netherton syndrome, la maladie de Menkes, l'épidermolyse bulleuse héréditaire et alopécies 11-13. En outre, les autres problèmes de peau tels que des brûlures, des plaies chroniques et des ulcères bénéficieront de thérapies aux cellules souches 14,15. Etant donné le potentiel de reprogrammation de cellules adultes dans un état pluripotentes (cellules iPS) 16,17, les cellules facilement accessibles et extensible souches adultes dans la peau humaine peut fournir une source précieuse de cellules pour l'induction et le traitement en aval pour un large éventail de maladies, y compris le diabète et la maladie de Parkinson.
Protocol
1. Extraire des cellules souches épithéliales de la peau humaine
- Avant de commencer la procédure d'isoler des cellules souches épithéliales on a besoin pour préparer les médias respectifs et des réactifs (voir tableau 1).
- Fraîches peau du cuir chevelu humain adulte à partir de procédures lifting ou biopsie est recueilli, puis incuber dans FBS DMEM / 10% / dispase (4 mg / mL) pendant la nuit à 4 ° C. L'incubation pendant 2-4 heures à 37 ° C est également efficace. Morceaux de peau doit être d'une largeur maximale de 1 cm pour permettre l'enzyme de pénétrer.
- Transfert de la peau dans une boîte de Pétri stérilisées, arracher chaque poil de la peau en saisissant la tige du cheveu près de la surface de la peau et en tirant fermement et en douceur. Sélectionnez follicules au stade télogène basée sur leur morphologie sous un microscope à dissection, découpez la région renflement (figure 1A) follicules transférer dans un tube de 15 ml stérilisés. Follicules anagène peut aussi être utilisée si elle est coupée à la partie supérieure 1 / 3 du follicule pour obtenir follicule pileux "renflement" région (figure 1B).
- Incuber les fragments isolés du follicule dans un mélange de 0,05% de trypsine-EDTA (Gibco) et Versène (0,53 mM EDTA 4NA, GIBCO) (01h01) pour 15-20 min à température ambiante avec agitation périodique, ajouter 4 ml de DMEM + 10 % de FBS pour arrêter la réaction, ralentit pendant 5 min à 800 rpm. Alternativement, des explants de tissu folliculaire fragment peut être mis en culture, sans trypsine digérer pour des cellules en culture à partir de follicules simples.
- Rejeter le surnageant avec soin (~ 0,2 à 0,5 ml sauver pour éviter de perdre des cellules) et remettre en suspension dans 1 ml de KCM (moyenne des kératinocytes), sans EGF.
2. Culture primaire des cellules souches épithéliales
- Avant de cultiver les cellules souches épithéliales, la mitomycine C-traitée 3T3-J2 cellules (cellules nourricières) doit être préparé comme suit. 3T3-J2 cellules sont cultivées dans du DMEM avec 10% de FBS avant le traitement. Retirez le support de culture cellulaire et laver deux fois avec PBS, traiter cellule avec 15μg / ml de mitomycine C dans du DMEM sans sérum pendant 2 heures à 37 ° C, 5% de CO 2. Retirez la mitomycine C contenant du DMEM et laver deux fois avec du PBS, les cellules sont prêtes à utiliser. (Mitomycine C-traitée 3T3-J2 cellules peuvent également être préparés précédemment et stocké à -80 ° C. Dégel et les graines des cellules un jour avant culture primaire des cellules souches épithéliales, incuber à 37 ° C, 5% de CO 2. 150,000-200,000 3T3-J2 cellules par puits de plaque de 6 puits est recommandée.
- Graine cellule isolée tige follicule pileux de l'étape 1.5 sur mitomycine C-traitée 3T3-J2 cellules dans KCM, sans la nuit à 37 ° C EGF, 5% de CO 2, a changé d'EGF-KCM contenant le lendemain. Les cellules sont cultivées à 37 ° C dans une atmosphère humide contenant 5% de CO 2. Tous les kératinocytes sont nourris avec KCM contenant EGF tous les 2 jours et cultivés pendant 14-20 jours. Vérifiez la cellule chaque jour sous le microscope. Cellules souches du follicule pileux va former des colonies (figure 2A). Explants follicule pileux se forme des excroissances après 10-14 jours (figure 2B).
3. Cellules souches épithéliales Passage
- Laver les cellules avec du PBS fois. Retirer des cellules nourricières 3T3-J2 par Versène (pré-chauffé à température ambiante) de traitement. Incuber la culture bombé en Versène pendant 5 minutes, puis secouez doucement et aspirer hors des cellules nourricières.
- Laver les cellules souches du follicule pileux soit avec ou PBS Versène une seule fois.
- Ajouter préchauffé (à 37 ° C, critique) trypsine-EDTA (2X) et incuber à 37 ° C pendant 7 minutes ou plus si nécessaire pour les cellules souches du follicule pileux se détacher. Pas plus de 15 minutes est la meilleure.
- Ajouter KCM w / o FEM pour arrêter la trypsine, délicatement la pipette de haut en bas pour disperser les cellules, ralentit au 200g, à 5 minutes.
- Re-suspendre les cellules avec KCM sans EGF, le comte et re-plaque sur la mitomycine C-traitée 3T3-J2 couche de cellules.
4. Immortalisez cellules souches épithéliales
Les cellules primaires, cellules souches, même adulte, atteint la sénescence, après passage en série et des mois dans la culture. L'immortalisation des cellules souches primaires est un moyen efficace pour soulager ce problème.
- Plaque primaires cellules souches épithéliales (~ 350 000 cellules / puits de plaque de 6 également) au passage 1 sur couche nourricière (3T3-J2) et la culture pendant 2 jours.
- Culture PA317 LXSN lignée cellulaire 16E6E7 un jour après l'ensemencement des cellules souches épithéliales primaires avec du DMEM contenant 10% de FBS. (Cette ligne produit le LXSN16E6E7 rétrovirus amphotropes qui encode la E6 et E7 du HPV16 cadres ouverts de lecture, et qui peut être utilisé pour infecter de façon stable et immortaliser de nombreux types cellulaires).
- Traiter PA317 ligne LXSN cellules 16E6E7 à la mitomycine C pendant 2 heures (même protocole avec 3T3-J2 cellules). Ajouter la mitomycine C traités PA317 ligne LXSN cellules 16E6E7 aux cellules souches épithéliales primaires, co-culture pendant 6 jours dans KCM avec EGF. Renouveler KCM frais avec EGF médias tous les 2 jours.
- Retirer 3T3-J2 et PA317 LXSN 16E6E7 cellule avec Versène. Ajouter la mitomycine C cellules traitées PSN 3T3-J2 (néomycine, hygromycine, puromycine résistants, ~ 200 000 cellules par puits) pour les cellules souches épithéliales. Les cellules sont sélectionnés sous 0,2 mg / ml de G418 (Gibco) pour ajouteritional 6 jours. Renouveler frais KCM G418 contenant l'EGF médias tous les 2 jours.
Survivre cellules souches épithéliales sera immortalisé les cellules souches. Un puits de cellules souches épithéliales primaires qui ne sont pas co-cultivées avec des cellules PA317 LXSN 16E6E7 doit être défini comme un contrôle pour la sélection au G418, toutes les cellules dans ce puits devrait être tué par G418 après 6 jours de sélection.
5. Les résultats représentatifs
Passage précoce des cellules souches épithéliales et la peau immortalisé cellules souches épithéliales forment des colonies serrées constituée de kératinocytes de petite taille (figure 2A) entouré de cellules nourricières. Si cultivées en milieux exempts de sérum avec des suppléments défini, sans une couche nourricière, les cellules souches se dispersent et ne pas former des colonies serrés (ils poussent comme des cellules individuelles et de petits amas). Immortalisé cellules souches épithéliales maintenir un phénotype stable pendant> 12 mois de passage en continu, mais avaient tendance à former des colonies plus serré que les cellules primaires. Ils ne forment pas des colonies indépendantes d'ancrage dans les dosages agar mou, indiquant que ces cellules immortalisées ne possèdent pas les caractéristiques des cellules cancéreuses. Les deux primaires et immortalisées de cellules souches épithéliales expresse follicule pileux marqueur de cellules souches cytokératine 15 (figure 3A), et sont capables de se différencier en follicule pileux épidermique, et les lignages sébacées (figure 3B-D).
Figure 1. Pincées poils. Après la cueillette de dispase peau traitée, les follicules pileux apparaissent comme étant soit des poils du club télogène (A) avec une boule de cellules entourant le bas de la chevelure, ou les poils anagène (B) avec un manchon d'épithélium entourant la longueur des cheveux. La région de renflement télogène formes morphologiques distinctes d'une région à la micro-dissection, tandis que le renflement anagène est moins distincte. L'ampoule contient anagène kératinocytes matrice, représentant de transit d'amplification des cellules qui peuvent également être isolées et cultivées.
Figure 2. Les cellules souches cultures. (A) des cellules souches épithéliales de la peau sous forme serrée colonies épithéliales (désigné par E) lorsqu'elles sont cultivées dans KCM avec une couche nourricière de cellules (désigné par F). (B) explants follicule pileux donnent lieu à des excroissances épithéliales. La région de renflement télogène (désigné par T) est attaché au plat et entouré colonie de cellules épithéliales avec des cellules nourricières.
Figure 3. Différenciation des cellules souches. (A) Les cellules souches colonies maintenir l'expression des marqueurs épithéliaux tels que la cytokératine 15. (B) des cellules souches épithéliales cutanées peuvent être différenciées selon la lignée follicule pileux tel que déterminé par l'expression K6Hf. (C) Les cellules peuvent être cultivées sur de-epidermalized derme ou d'autres matrices à l'interface air-liquide et sous forme d'un épiderme stratifié avec couche cornée, couche granuleuse et la couche épineuse. (D) Les cellules souches peuvent être induits le long de la lignée sébacées avec l'huile rouge des globules positif.
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Discussion
Les méthodes d'extraction de cellule et la culture sont étonnamment faciles décrit et reproductible. Nous avons généré cultures de cellules souches épithéliales de plusieurs dizaines de personnes à travers une large tranche d'âge, y compris les patients avec des défauts de la peau a hérité de 18 ans. Il est préférable de commencer le processus le jour de la récolte des tissus, mais les cellules restent viables dans les médias sur la glace pendant plusieurs jours, ce qui facilite expédition durant la nuit si nécessaire. La peau lifting au rebut des rendements des centaines de follicules viables pour l'extraction des cellules sous forme de suspensions seule cellule. Pour les tissus plus limitée, comme d'une biopsie du cuir chevelu, des cultures d'explants peut être plus efficace, car il ya moins de chance pour la perte de cellules dans trypsinisation et centrifugation. Pour des cultures d'explants, l'aspect le plus important est l'attachement du fragment de tissu à l'antenne. L'addition de petites quantités de médias couvrant juste la manipulation des tissus et un minimum est recommandée jusqu'à excroissances apparaissent dans 10-14 jours.
Adulte cellules souches épithéliales de la peau pourrait avoir une application large. Les cellules de peau en culture sont déjà en application clinique pour les patients souffrant de brûlures et de plaies chroniques. Le défi est maintenant devenu un équivalent en mieux la peau avec glandes sudoripares et les cheveux. L'utilisation potentielle de cellules souches de la peau pour la régénération des cheveux n'est possibilité passionnante.
Comme mentionné précédemment, la capacité d'induire un état primitives multipotentes dans les cellules adultes représente une avancée significative pour les thérapies cellulaires potentiels en fonction, sans l'utilisation de cellules souches embryonnaires 16,17. Toutefois, le processus est inefficace et potentiellement oncogènes, puisque les vecteurs viraux sont utilisés pour induire l'expression de gènes de cellules souches. Si on commence avec une population de cellules souches adultes, il peut accroître considérablement l'efficacité et de parer à la nécessité pour les transfections stables virale pour induire la pluripotence. Transplantation de cellules souches de moelle osseuse a été utilisée comme une approche basée sur des cellules pour traiter des maladies graves de la peau telles que l'épidermolyse bulleuse. 19,20 De plus, la correction du collagène 7 défaut dans l'épidermolyse bulleuse a été réalisé dans les kératinocytes du patient in vitro. 21 L'isolement des cellules souches épithéliales partir d'une biopsie de peau peuvent fournir des ressources pour étendre sur ce travail antérieur et de développer des thérapies cellulaires utilisant des cellules autologues individualisé.
Il est intéressant de noter que la région bulbe du follicule pileux est également le site d'autres pools de cellules souches adultes de cellules / progénitrices. Xu et al. 22 a identifié des cellules souches mésenchymateuses multipotentes à partir de cette région. Précurseurs de mélanocytes résident également dans le renflement 23 cheveux. Ainsi, la méthode d'isolement du follicule pileux présentée ici peut facilement être adapté pour isoler ces autres types de cellules pour les nouvelles expérimentations.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail est financé par le NIH / NCI octroi R01CA-118916
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11995 | |
| Hams F12 | GIBCO, by Life Technologies | 11765 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Insulin | GIBCO, by Life Technologies | 12585 | |
| T3 | Sigma-Aldrich | T-2752 | |
| Transferrin | Roche Group | 10652202001 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-4001 | |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Epidermal growth factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E-9644 | |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A9795 | |
| Trypsin(10X) | GIBCO, by Life Technologies | 15090 | |
| VERSENE | GIBCO, by Life Technologies | 15040 | |
| G418 Sulfate | Cellgro | 30-234-CR | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648 | |
| 1X PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Mitomycin C | Roche Group | 10107409001 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Dispase | Invitrogen | 17105 | |
| Crystal Violet | Fisher Scientific | C581-25 | |
Keratinocyte media (KCM) [DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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[DMEM and Ham s F12 (GIBCO, 3:1), adenine (Sigma, 180 mM), 10% fetal bovine serum (GIBCO), cholera toxin (ICN, 0.1 nM), penicillin/streptomycin (GIBCO, 100 U/ml and 100 mg/ml, respectively), hydrocortisone (Sigma, 0.4 mg/ml, 1.1 mM), T/T3 (transferrin, GIBCO, 5 μg/ml, 649 nM; and triiodo-l-thyronine, Sigma, 2 nM), insulin (Sigma, 5 mg/ml, 862 nM), and EGF (Sigma, 10 ng/ml, 1.6 nM), pH 7.2] |
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