Summary
एक माउस आँख के विच्छेदन के एक औपचारिक प्रदर्शन, रेटिना वर्णक उपकला की एक पूरी माउंट में जिसके परिणामस्वरूप.
Abstract
रेटिना वर्णक उपकला (RPE) स्तनधारी आँख के पीछे सिर्फ तंत्रिका रेटिना, जिसमें photoreceptors (छड़ और शंकु) के तहत निहित है. RPE pigmented cuboidal को यह बस के ऊपर तंत्रिका रेटिना के साथ मिलकर कोशिकाओं और सहयोगियों की एक monolayer है. इस संघ रेटिना रोगों के अध्ययन के शोधकर्ताओं के लिए महान ब्याज की RPE बनाता है. RPE भी अनुरूपता निर्देश डीएनए की मरम्मत, पी संयुक्त राष्ट्र परख के vivo परख में एक साइट है. अपने छोटे आकार की वजह से काटना (लगभग 3.5mm व्यास में) और उसके गोलाकार आकार माउस आँख विशेष रूप से कठिन है. इस लेख में विस्तार से RPE की एक पूरी माउंट परिणामस्वरूप आँख के विच्छेदन के लिए एक प्रक्रिया को दर्शाता है. इस प्रक्रिया में, हम बताते हैं कैसे के खिलाफ है, आंख की गोलाकार संरचना के साथ, बजाय काम करने के लिए. संक्षेप में, संयोजी ऊतक, मांसपेशियों, और ऑप्टिक तंत्रिका आँख के पीछे से हटा रहे हैं. फिर, कॉर्निया और लेंस को हटा रहे हैं. अगला, रणनीतिक कटौती शेष ऊतक के महत्वपूर्ण सपाट में है कि परिणाम बना रहे हैं. अंत में, तंत्रिका रेटिना धीरे बंद उठाया है, एक अक्षुण्ण RPE, जो अभी भी अंतर्निहित रंजित और श्वेतपटल से जुड़ा हुआ है खुलासा. यह पूरी माउंट पी संयुक्त राष्ट्र या RPE ऊतक के immunohistochemistry या immunofluorescent मूल्यांकन के लिए परख करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. आंख के बाहर से असंबद्ध ऊतक निकालें
- एक 35 मिमी डिश के ढक्कन में 1X पीबीएस डालो. बस ढक्कन के होंठ के नीचे स्तर होना चाहिए.
- भंडारण ट्यूब से सीधे संदंश, स्थानांतरण आंख (ओं) को 35 मिमी पकवान का उपयोग. : 1 आंखें पीबीएस में दो कारणों के लिए जलमग्न हैं. बाहरी ऊतकों दूर "फ्लोट" आंख से ताकि आप देख सकते हैं और उन्हें आसानी से दूर कर सकते हैं, और 2. विच्छेदन के दौरान, स्वाभाविक रूप से आंख अपनी गोलाकार आकृति को बनाए रखने, जबकि निलंबन में, आप इस आकार के साथ काम करने के बजाय इसके खिलाफ की अनुमति.
- Angled संदंश (45 ° और 15 °) के दोनों जोड़े का प्रयोग, धीरे से ज्यादा और संभव के रूप में मांसपेशियों और संयोजी ऊतक के रूप में निकालने के लिए, अनाज के खिलाफ ऊतक खींच (कॉर्निया की ओर अर्थात्). कुछ संयोजी ऊतक रहेगा. प्रयास करने के लिए थोड़ा के रूप में संभव के रूप में में नेत्रगोलक निचोड़ करने के लिए किया जाना चाहिए.
- वसंत कैंची के लिए अपने 15 ° संदंश व्यापार. जबकि 45 ° संदंश के साथ स्थिर आँख पकड़, वसंत कैंची का उपयोग करने के लिए दूर शेष मांसपेशियों और संयोजी ऊतक, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऑप्टिक तंत्रिका कटौती. * युक्ति: कैंची के बाहर बढ़त के प्रयोग के अनाज के खिलाफ ऊतक धक्का (corneo-scleral डिवाइड की ओर) और फिर ट्रिम. जारी रखें जब तक सभी बाहरी ऊतक आँख से हटाया गया है.
2. कॉर्निया और लेंस निकालें
- सामना करना पड़ रहा कॉर्निया के साथ, 45 ° संदंश का उपयोग करने के लिए कॉर्निया के केंद्र में एक छोटे से गुना चुटकी.
- वसंत कैंची का प्रयोग, प्रालंब के आधार पर एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. प्रालंब के चलते चलो.
- होल्डिंग आँखें अभी भी अपने संदंश के साथ, में कम कैंची ब्लेड डालने और चीरा के लिए सीधा और corneo-scleral डिवाइड की ओर काट कर. तो दोनों कॉर्निया और परितारिका काट रहे हैं परितारिका के तहत अपने निचले ब्लेड रखने की कोशिश करो. Corneo-scleral डिवाइड करने के लिए सभी तरह काट नहीं है. आंख में डाला कैंची रखें.
- अपने 45 ° संदंश का प्रयोग, ध्यान से आँख बारी बारी से ताकि अपने कैंची corneo-scleral डिवाइड करने के लिए समानांतर हैं और एक छोटे से काट कर. धीरे धीरे आंख 360 ° घुमाएगी, छोटे चीरों के सभी तरह बनाने के लिए. फिर, ताकि दोनों आईरिस और कॉर्निया काट रहे हैं परितारिका के तहत कम अपने वसंत कैंची की ब्लेड रखने की कोशिश. आईरिस और कॉर्निया आँख के बाकी हिस्सों से दूर लिफ्ट और उन्हें त्यागने.
- अपने पक्ष पर नजर झुकाएँ और नीचे धीरे से आँख के पीछे आधे पर, प्रेस लेंस मजबूर बाहर. लेंस त्यागें. शेष eyecup के अंदर तंत्रिका रेटिना है, जो चिकनी और अपारदर्शी दिखना चाहिए द्वारा पंक्तिवाला है.
3. "Petaled", फूल की तरह संरचना - परिणामस्वरूप eyecup, एक 4 में जिसके परिणामस्वरूप क्वार्टर
- आंख ऐसी है कि eyecup के उद्घाटन अपने शरीर को सीधा तैनात किया जाना चाहिए. स्थिर और स्थिति eyecup को अपने 45 ° संदंश का प्रयोग करें.
- आप के सामने अपने वसंत कैंची होल्डिंग तो वे आपके शरीर को सीधा कर रहे हैं, खुले नेत्र कप के शीर्ष बढ़त में कम अपने वसंत कैंची की ब्लेड सम्मिलित. अपने 45 ° संदंश का प्रयोग, ध्यान से इतना है कि एक एकल, सीधे कट corneo-scleral ऑप्टिक तंत्रिका सिर की ओर विभाजित से बनाया जा सकता है है आँख कप संरेखित करें. सभी कटौती सीधा corneo-scleral डिवाइड हो सकता है और जब तक निर्दिष्ट, इसे में काटने के बिना के रूप में संभव के रूप में में ऑप्टिक तंत्रिका सिर के करीब जाना चाहिए.
- Eyecup 180 ° घुमाएँ, अपने शरीर के साथ अपने खड़ापन को बनाए रखने. 3.2 कदम में तकनीक का प्रयोग करें एक दूसरे सीधा कटौती करने के लिए.
- Eyecup घुमाएँ और 3.2 में वर्णित करने के लिए दो और अधिक कटौती करने तकनीक को दोहराएँ. सभी चार कटौती के रूप में 90 ° अलग रूप में संभव के करीब होना चाहिए. ध्यान में रखें कि आंख पूरी तरह से गोलाकार है तो वहाँ कुछ परिवर्तनशीलता जाएगा नहीं है.
4. आधे में चार "पंखुड़ियों" के प्रत्येक कट, एक आठ पत्ती फूल की तरह संरचना में जिसके परिणामस्वरूप
- 35 मिमी पकवान से एक साफ स्लाइड के लिए quartered eyecup स्थानांतरण. सामना करना पड़ रहा eyecup के साथ, के तहत यह 45 ° संदंश के साथ स्कूप. ध्यान यह लिफ्ट से बाहर तरल है और यह एक साफ स्लाइड पर जगह है.
- Angled संदंश के दोनों जोड़े का प्रयोग, धीरे से बाहर तंत्रिका रेटिना के साथ सामना करना पड़ रहा आँख खुली,. निकालें नहीं तंत्रिका रेटिना - यह मदद करता है आँख अपनी गोलाकार आकृति के कुछ बनाए रखने के तो आप इसके खिलाफ काम नहीं कर रहे हैं. यह भी जा रहा है accidently निम्नलिखित प्रक्रियाओं में क्षतिग्रस्त से RPE बचाता है.
- स्लाइड घुमाएँ जब तक एक पंखुड़ियों की आपके शरीर को सीधा है.
- अपने 15 ° संदंश का प्रयोग करें, धीरे पत्ती के कोने हड़पने. पत्ती के कोने कॉर्निया, रेटिना या नहीं तंत्रिका RPE चाहिए. कोने पर धीरे लिफ्ट, यह अपनी वक्रता को बनाए रखने के लिए अनुमति देता है.
- अपने वसंत कैंची की पत्ती और स्लाइड के बीच नीचे ब्लेड डालें. अपनी कैंची रेखा ऐसी है कि एक एकल, सीधे, सीधा कटौती corneo-scleral ऑप्टिक तंत्रिका सिर की ओर विभाजित से बनाया जा सकता है. इसे में काटने के बिना के रूप में संभव के रूप में में ऑप्टिक तंत्रिका सिर के करीब कट. चलो जाने केपत्ती, यह स्लाइड पर झूठ करने की अनुमति.
- 90 स्लाइड घुमाएँ °, ताकि अगले पत्ती अपने शरीर को सीधा है. 4.5 कदम दोहराएँ.
- 4.5 और 4.6 कदम दो बार अधिक दोहराएँ. परिणामस्वरूप संरचना एक आठ पत्ती फूल की तरह दिखना चाहिए.
5. तंत्रिका रेटिना निकालें
- पिपेट नमूना पर 100-200 1X पीबीएस के μL. यह आप के रूप में इसे छील RPE के चिपके से तंत्रिका रेटिना को रोकने जाएगा.
- आमतौर पर तंत्रिका रेटिना RPE शिथिल जुड़ा हुआ है. हालांकि, यह अभ्यास और कौशल लेने के लिए केवल तंत्रिका रेटिना और नहीं RPE हटाने करता है. धीरे angled संदंश की एक जोड़ी के साथ तंत्रिका रेटिना की एक पत्ती समझ जबकि (नीचे पकड़) angled संदंश के अन्य जोड़ी के साथ आंख के बाकी स्थिर. तंत्रिका रेटिना आंख के बाकी हिस्सों से दूर खींचो. इस प्रक्रिया को जारी रखें जब तक पूरे तंत्रिका रेटिना हटा दिया गया है. * युक्ति: ऑप्टिक तंत्रिका सिर में अपने 15 ° संदंश की नोक छड़ी करने के लिए आँख लंगर. फिर 45 ° संदंश का उपयोग तंत्रिका रेटिना के नीचे झाडू और लिफ्ट बंद और दूर. यह आमतौर पर सबसे अच्छा है corneo-scleral डिवाइड की ओर ऑप्टिक तंत्रिका सिर से तंत्रिका रेटिना लिफ्ट. दूर परितारिका के किसी भी ढीली अवशेष खींच करने के लिए सुनिश्चित करें. परितारिका बहुत चिपचिपा है और अन्यथा RPE के लिए अटक प्राप्त कर सकते हैं.
- 1X पीबीएस के साथ नमूना कुल्ला. पिपेट नमूना में 100-200 1X पीबीएस की μL और इसे चूसना वापस ऊपर. पीबीएस त्यागें. के रूप में धूल और मलबे को हटाने के लिए आवश्यक दोहराएँ.
6. आप किसी स्लाइड पर माउंट नमूना (एस)
- पिपेट एक आयताकार आकार में एक नई स्लाइड पर 90% ग्लिसरॉल के 8-90 μL. विंदुक टिप के पक्ष का उपयोग करने के लिए एक भी, ग्लिसरॉल के आयताकार स्मियर बनाने के लिए. (यह एक स्लाइड पर दो RPE बढ़ते के लिए प्रक्रिया है.)
- नमूना के तहत 15 ° संदंश के निचले हाथ डालें. धीरे विदारक स्लाइड बंद नमूना उठा.
- धीरे धीरे ग्लिसरॉल में नमूना कम है. धीरे संदंश के रूप में आप उन्हें नमूना के नीचे से बाहर खींच wiggle.
- दोहराएँ चरण अन्य नमूना के लिए 6.1-6.3.
- स्लाइड ताकि लंबे पक्ष अपने शरीर को सीधा घुमाएँ. पर अपने कवर कांच पकड़ो एक 45 ° कोण स्लाइड करने के लिए इतना है कि यह स्लाइड छू रहा है. यह ग्लिसरॉल स्मियर की ओर ले जाएँ जब तक वे स्पर्श. कवर कांच और स्लाइड के बीच संपर्क बनाए रखने, धीरे धीरे कवर कांच स्मीयर से दूर स्लाइड के किनारे की ओर, हिलना. स्लाइड की लंबी पक्षों और कांच कवर अप लाइन इतनी है कि वे समानांतर हैं. अपने अंगूठे और तर्जनी के बीच कवर कांच के कोनों पकड़ो.
- अपने दूसरे हाथ में 15 ° संदंश उठाओ. पालना बांह के बदमाश में कवर कांच के ऊपरी छोर (मुक्त). बहुत धीरे धीरे, कांच कवर कम है. जब कांच कवर और ग्लिसरॉल के बीच संपर्क बना है, बंद करो, और विस्थापित ग्लिसरॉल के लिए प्रतीक्षा करें. इस कम और इंतज़ार कर रही है जब तक RPE पूरे mounts पूरी तरह से कवर कर रहे हैं दोहराएँ. यह हवाई बुलबुले कैप्चरिंग से अत्यधिक चिपचिपा ग्लिसरॉल रोकने के लिए है. Coverglass पर नीचे धक्का नहीं - ग्लिसरॉल के नीचे से बाहर निचोड़, बहुत गरीब आसंजन.
- स्पष्ट नेल पॉलिश के साथ, जहां कवर गिलास और स्लाइड को पूरा परिधि के आसपास पेंट.
- एक खाली रैक शुष्क के शीर्ष पर स्लाइड रखें.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
इस प्रक्रिया का परिणाम एक संरचना है कि एक फूल की तरह लग रहा है और काफी सममित किया जाना चाहिए किया जाना चाहिए.
चित्रा 1. Wildtype C67Bl/6J माउस से पूरे माउंट RPE काले या agouti जानवरों से RPE रंग में भूरे रंग के अंधेरे और एक चिकनी सतह चाहिए. यह सामान्य है पंखुड़ियों की स्थलाकृति में undulations नोटिस. किसी भी देना नमूना पर pigmentation के कुछ चर हो सकता है, दोनों RPE और अंतर्निहित रंजित pigmentation के चर घनत्व के कारण हो सकता है. व्हाइट तीर hypopigmented "चैनल" के लिए बिंदु होता है - यह सामान्य है और आँख की अंतर्निहित vasculature को वजह से है. RPE और अंतर्निहित रंजित दोनों के लिए शारीरिक क्षति के लिए नीले तीर अंक.
चित्रा 2. एक पतला माउस से पूरा माउंट RPE. पतला जानवरों से काटा नमूने रंग में से लगभग पारदर्शी सीएएफ au lait रेंज और किसी भी एक नमूना यह भीतर परिवर्तनशीलता है की तरह है, काले हलकों में यहाँ संकेत कर सकते हैं . सामान्य में, छोटे जानवरों से काटा RPE हल्का कर रहे हैं और बड़े पशुओं से काटा उन काले हैं. काला तीर अंतर्निहित vasculature है, जो hypopigmented प्रकट होता है के कुछ संकेत मिलता है.
चित्रा 3. Phalloidin धुंधला RPE के लिए शारीरिक नुकसान का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Phalloidin धुंधला स्पष्ट रूप से सेल की रूपरेखाझिल्ली, उपकला के hexagonal आकार दिखा. (ए) एक काला माउस से उदाहरण. (बी) एक पतला माउस से उदाहरण.
चित्रा 4. एक पतला माउस से एक खराब dissected RPE (ए) कोष्ठक कॉर्निया के हाशिये, कि बहुत व्यापक हैं जो पैदा कर सकता है और / या तह buckling से संकेत मिलता है. काले वृत्त के भीतर आप बाहरी ऊतक की अत्यधिक मात्रा में है कि आँख के पीछे से हटाया नहीं गया है देख सकते हैं. वे विशेष रूप से स्पष्ट कर रहे हैं क्योंकि एक पतला जानवर से नमूना है. नीचे बाईं तरफ पत्ती आंशिक रूप से जोड़ रहा है. (बी) यह पूरी माउंट एक pinwheel की उपस्थिति है. काला तीर कटौती किए गए कुछ संकेत मिलता है. Corneo-scleral ऑप्टिक तंत्रिका सिर की ओर विभाजित से कटौती के कई व्यास के साथ लाइन में नहीं हैं. (सी) काला तीर से संकेत मिलता है कैसे कटौती व्यास और स्पर्शरेखा सीधा करने के लिए के साथ लाइन में किया गया है बनाया जाना चाहिए,.
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Discussion
RPE पी संयुक्त राष्ट्र परख के स्थल अनुरूपता निर्देशित की मरम्मत के vivo परख में एक है. पी संयुक्त राष्ट्र परख अलग डीएनए नुकसान के प्रभाव 1,2 और अनुरूपता निर्देशित की मरम्मत की आवृत्ति पर डीएनए की क्षति संकेतन और मरम्मत 3,4,5 जीन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यह बेहद संवेदनशील परख है, 1 RPE पर एकल कक्ष घटनाओं का पता लगाने. यह भी विकास के दौरान 6 अनुरूपता निर्देशित मरम्मत घटनाओं के समय में अंतर का पता लगा सकते हैं. murine आँख त्रिज्यात जावक ऑप्टिक तंत्रिका 7 से विकसित और इसलिए, ऑप्टिक तंत्रिका सिर से घटनाओं के सापेक्ष दूरी के विकास में जो समय में वे हुआ संबद्ध.
RPE जो रेटिना विकास या रेटिना रोगों का अध्ययन करने के लिए ब्याज की भी है. हालांकि RPE कोशिकाओं सुसंस्कृत किया जा सकता है, वहाँ ऐसा करने के लिए महत्वपूर्ण सीमाएं हैं. वयस्क RPE कोशिकाओं 7 पोस्ट - mitotic हैं और जाहिर है अच्छी तरह से इन विट्रो में नहीं पैदा करते हैं. इसके अलावा, उन संस्कृतियों है कि विकसित करना सहित कई परिवर्तन दिखा लेकिन pigmentation में परिवर्तन, आकारिकी, और सेल जंक्शनों 8 तक सीमित नहीं - विशेषताओं है कि वैज्ञानिक जांच के ध्यान केंद्रित कर रहे हैं के कुछ. इसलिए, RPE की एक पूरी माउंट की तैयारी के लिए और आंख के विकास और रोगों के vivo अध्ययन में एक प्रासंगिक तकनीक है.
इस छोटे ऊतक के विच्छेदन पहली बार में बहुत मुश्किल है. यह आराम करने के लिए महत्वपूर्ण है और उचित आसन और स्थिति को बनाए रखने के रूप में इस वीडियो लेख में दिखाया गया है. यदि एक पूरे माउंट RPE एक pinwheel की तरह लग रहा है, यह है, क्योंकि लंबे समय में कटौती, अर्थात् नहीं सीधा एक स्पर्शरेखा व्यास के साथ लाइन में नहीं किए गए थे. यह सबसे जब कैंची के सामने आयोजित नहीं कर रहे हैं और लंबरूप शरीर से दूर होते जाने की संभावना है. लंबी कटौती करने के लिए एक दांतेदार उपस्थिति में कटौती के बीच कैंची ब्लेड के एक मामूली वापसी के लिए कारण संभावना है.
एक मोटा या ऊबड़ RPE सतह उपस्थिति सामान्य नहीं है और नमूना के किसी न किसी प्रकार से निपटने की वजह से नुकसान की वजह से हो सकता है. नुकसान phalloidin धुंधला का उपयोग कर सत्यापित किया जा सकता है. सफेद या स्पष्ट धब्बे RPE और अंतर्निहित रंजित में छेद भी किसी न किसी प्रकार से निपटने या पंचर की वजह से हैं.
यदि RPE किसी न किसी और अपारदर्शी प्रकट होता है, यह शायद तंत्रिका रेटिना के अवशेष के कारण है. यह हो सकता है अगर आँखों के तहत या अधिक तय (कम से कम 2 घंटे, पीएफए में 4% से अधिक 4 घंटे). यह भी ठीक से तय आँखें है कि भंडारण में समय का एक अत्यधिक अवधि (> 6 महीने) के लिए किया गया है में हो सकता है. Dispase उपचार ऐसे अवशेष हटाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन भी RPE ऊपर तोड़ने के लिए पैदा कर सकता है.
RPE के लिए शारीरिक नुकसान का पता लगाने पतला या विवर्ण नमूनों में बहुत मुश्किल है. हम अपने प्रारंभिक dissections पर phalloidin धुंधला का उपयोग ताकि आप किसी भी क्षति है कि वजह से निपटने के लिए हुई हो सकती है है देख सकते हैं की सलाह देते हैं. ऐसा करने के लिए, एक माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में 1XPBS में 2 200μL% BSA के साथ 1 घंटे के लिए ब्लॉक. अगला, 2μL phalloidin जोड़ने और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में सेते हैं. फिर 1ml 1XPBS के साथ अंधेरे में कमरे Temp में 30 मिनट प्रत्येक के लिए 3x धो लो. माउंट सामान्य रूप से स्लाइड. * ध्यान दें: दाग़ बहुत उज्ज्वल है और हम flouramount या इसी तरह flourescence - संरक्षण मीडिया का उपयोग नहीं की सिफारिश करते हैं.
सभी सावधान होने के बावजूद, एक पूरे माउंट RPE बहुत नाजुक है और नहीं है आसानी से विच्छेदन, धुंधला, immunohistochemistry, या immunofluorescence करने के लिए आवश्यक से निपटने का सामना कर सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम पर्यावरणीय स्वास्थ्य विज्ञान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था [K22ES012264 AJRB] और अमेरिकन कैंसर सोसायटी InstitutionalResearch अनुदान [ACS-IRG-00-173-04] पायलट projectaward [AJRB] हम भी क्या करना है नहीं के उदाहरण के लिए बिशप प्रयोगशाला के सदस्यों, पांडुलिपि और और विशेष रूप से वीडियो एडम ब्राउन पर टिप्पणी की आलोचना पढ़ने के लिए धन्यवाद. हम Greehey बच्चों के कैंसर रिसर्च इंस्टीट्यूट के डॉ. डोनाल्ड McEwen हमें विच्छेदन वीडियो के फिल्मांकन के लिए अपने विदारक गुंजाइश / वीडियो कैमरा सेट अप का उपयोग की अनुमति के लिए धन्यवाद. हम Corte उपकरण sharpening और हमारे microdissection उपकरणों की मरम्मत के लिए Daron ब्राउन धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| straight forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX |
| 45° forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX |
| 15° "up" forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX |
| spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel |
| binocular dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | use reflected light source |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
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