Summary
마우스 눈 해부의 정식 데모는 망막 안료 상피의 전체 마운트의 결과.
Abstract
망막 안료 상피 (RPE)는 단지 photoreceptors을 (막대 및 원뿔)이 들어있는 신경 망막, 아래, 포유 동물 눈의 뒤쪽에 자리잡고 있습니다. RPE는 밀접하게 그냥 위에있는 신경 망막과 색소 세포 cuboidal과 동료의 monolayer입니다. 이 협회는 망막 질환을 공부하고 연구하기 위해 큰 관심의 RPE를합니다. RPE는 상동 - 감독의 DNA 수리, P 유엔 분석의 생체내 분석에의 사이트입니다. 작은 크기로 인해 해부하다 (직경 3.5mm 정도)와 구면 모양 마우스 눈 특히 어렵습니다. 이 문서 상세 RPE의 전체 마운트에 발생하는 안구의 해부를위한 절차를 설명합니다. 이 절차에서는, 우리는 눈 구면 구조에 대해 함께보다는 일을하는 방법을 보여줍니다. 간단히, 결합 조직, 근육, 그리고 시신경이 안구의 뒤쪽에서 제거됩니다. 그런 다음, 각막과 렌즈가 제거됩니다. 다음 전략적 상처가 남아있는 조직의 중요한 평평화에 결과를 만들 수 있습니다. 마지막으로, 신경 망막은 부드럽게 여전히 기본 맥락막과 공막엔에 첨부되어 그대로 RPE를 공개, 해제 해제됩니다. 이 모든 마운트는 P 유엔 분석 또는 RPE 조직의 immunohistochemistry 또는 immunofluorescent 평가를 수행하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 눈 밖에서 관계없는 조직을 제거
- 35mm 접시의 뚜껑에 1X PBS 하거라. 수준은 뚜껑의 입술 아래에 있어야합니다.
- 35mm 접시에 저장 튜브에서 바로 포셉, 전송 아이 (들)을 사용합니다. 1 : 눈이 두 가지 이유로 PBS에 빠져들 수 있습니다. 당신이보고 쉽게 제거 2 수 있도록 외부 조직의 눈을 멀리 "떠"것입니다. 정지 상태에서 해부하는 동안 눈을 자연스럽게 당신은 반대보다는 이런 형상 작업 수 있도록, 자사의 구형 형태를 유지합니다.
- 직각 포셉 (45 ° 15 °)의 두 쌍을 이용하여 부드럽게 (각막쪽으로 IE) 성미 조직을 떼어, 가능한 한 많은 근육과 결합 조직으로 제거합니다. 일부 결합 조직은 남아있게됩니다. 노력 가능한 거의 같은 눈알을 쥐어 짜기로하여야한다.
- 스프링 가위에 대한 15 ° 포셉을 무역. 45 °의 집게와 함께 지속적인 눈을 가지고 있지만, 나머지 근육 및 결합 조직뿐만 아니라 시신경을 떼어 버리기 봄 가위를 사용합니다. * 도움말 : 트림 다음 성미 조직을 밀어 가위의 바깥쪽 가장자리를 사용하여 (corneo - scleral 나누어 방향)합니다. 모든 외부 조직이 눈에에서 제거되었습니다 때까지 계속합니다.
2. 각막과 렌즈를 제거
- 최대 직면하고있는 각막으로 각막의 중심에 작은 배를 공략하기 위해 45 °의 집게를 사용합니다.
- 봄 가위를 사용하여 플랩의 바닥에 작은 절개를합니다. 플랩을 가자.
- 눈을 개최하는 것은 여전히 집게와 가위로 낮은 날개를 삽입하고 수직 절개와 corneo - scleral 나누어 방향으로 절단합니다. 각막과 홍채가 모두 절단되도록 홍채 아래 낮은 블레이드를 유지하려고합니다. corneo - scleral 분열 모든 방법을 절단하지 마십시오. 눈에 삽입 가위 보관하십시오.
- 당신의 45 °의 집게를 사용하여, 신중하게 가위가 corneo - scleral 나눌 평행되도록 시선을 회전하고 작은 절개를합니다. 천천히 주위를 작은 incisions 모든 방법을 만들고, 눈 360 ° 회전. 다시 말하지만, 홍채와 각막 모두 절단되도록 홍채 아래 봄에 가위의 아래쪽 블레이드를 유지하려고합니다. 멀리 눈의 나머지 부분에서 꽃창포와 각막을 들어 그들을 폐기.
- 그 측면에 눈을 기울이기 및 렌즈를 강제로, 눈의 뒷부분 이분의 일에 부드럽게 아래로 누르십시오. 렌즈를 폐기하십시오. 나머지 세안 컵의 내부는 부드럽고 불투명 보여야 신경 망막에 의해 줄지어있다.
3. 쿼터 4 결과 결과 세안 컵, - "petaled"꽃 같은 구조를
- 눈 세안 컵의 개통은 몸에 직각입니다 같은 위치에 있어야합니다. 꾸준한와 위치 세안 컵에 45 °의 집게를 사용하십시오.
- 당신 앞에 당신의 봄 가위를 들고 그들이 당신의 몸에 수직 있으며, 열린 눈 컵의 상단 가장자리에 봄 가위의 아래쪽 블레이드를 삽입합니다. 당신의 45 °의 집게를 사용하여 조심스럽게 단일 직선 절단이 시신경 헤드쪽으로 corneo - scleral 분열에서 만들 수 있도록 아이 컵을 맞춥니다. 모든 상처는 corneo - scleral 나눌 수직이어야하며 지정하지 않는 한, 그것으로 절단되지 않고 가능한 시신경의 머리에 가까이 가야한다.
- 신체와의 수직을 유지, 세안 컵 180 ° 회전합니다. 두 번째 수직 인하를 만들기 위해 단계 3.2 기술을 사용합니다.
- 세안 컵 회전하고 두 개 더 상처를 만들기 위해 3.2에 설명된 기법을 반복합니다. 네개의 상처는 가능한 한 떨어져 90 °에 가깝게한다. 어떤 변화가있을 것입니다 그래서 눈을 완벽하게 원형이 아니라고 유의하십시오.
4. 8 꽃잎 꽃 같은 구조의 결과, 절반으로 네 개의 "꽃잎"의 각 컷
- 35mm 접시에서 깨끗한 슬라이드에 등분 세안 컵을 전송합니다. 최대 직면한 세안 컵으로 45 °의 집게와 함께 그 아래 특종. 조심스럽게 액체를 밖으로 들고 깨끗한 슬라이드에 배치하십시오.
- 직각 포셉 두 쌍을 이용하여 부드럽게까지 직면하고있는 신경 망막과 안구를 엽니다. 제거하지 마십시오 신경 망막 - 그것이 당신이 그것에 대해 작동하지 않습니다 그래서 눈을는 구면 형상의 일부를 유지하는 데 도움이됩니다. 또한 실수로 다음과 같은 절차에 손상되지 않도록 RPE를 보호합니다.
- 꽃잎 중 하나가 당신의 몸에 수직 때까지 슬라이드를 회전합니다.
- 당신의 15 °의 집게를 사용하여 부드럽게 꽃잎의 모서리를 잡아. 꽃잎의 코너가 아니라 신경 망막 또는 각막 RPE해야합니다. 그것의 곡률을 유지 수 있도록 부드럽게 모퉁이에 올려요.
- 꽃잎과 슬라이드 사이에 스프링 가위 하단의 칼날을 넣습니다. 당신의 가위를 선 하나, 직선, 직각 절단이 시신경 헤드쪽으로 corneo - scleral 분열에서 만들 수있을 것이다. 가능한 withou으로 시신경의 머리에 가까운 컷t는 그것으로 절단. 이 슬라이드에 누워있게 꽃잎의 가자.
- 슬라이드 90도 회전 °, 다음 꽃잎이 몸에 직각이되도록. 4.5 단계를 반복합니다.
- 두 번 더 단계를 4.5과 4.6를 반복합니다. 그 결과 구조는 8 꽃잎 꽃과 같이 표시됩니다.
5. 신경 망막을 제거
- 표본에 1X PBS의 피펫 100-200 μL. 이것은 RPE의 그걸 벗겨 당신과 떨어져 고집에서 신경 망막을 방지할 수 있습니다.
- 일반적으로 신경 망막은 느슨하게 RPE에 첨부되어 있습니다. 그러나, 그것은 단지 신경 망막 아니라 RPE를 제거하는 연습과 기술을 않습니다. 직각 포셉의 다른 쌍의과 (누른) 안구의 나머지 부분을 안정화하면서 부드럽게 직각 포셉 한 쌍의있는 신경 망막의 꽃잎을 파악. 멀리 눈의 나머지 부분에서 신경 망막을 당겨. 전체 신경 망막이 제거되었습니다 때까지이 절차를 계속합니다. * 도움말 : '눈'을 앵커로 시신경의 머리에 15 ° 포셉의 팁을 스틱. 그러면 신경 망막 아래에 청소에 45 °의 집게를 사용하여 그것을 발사하고 멀리. 이것은 corneo - scleral 나누어 방향으로 시신경의 머리에서 신경 망막을 해제하는 것이 가장 일반적이다. 홍채의 느슨한 잔해를 멀리 당겨주십시오. 조리개는 아주 끈적하고 그렇지 않으면 RPE에 붙어받을 수 있습니다.
- 1X PBS로 표본을 씻어. 피펫 100-200 표본에 1X PBS의 μL 그것을 다시 빨아. PBS를 폐기하십시오. 먼지와 부스러기를 제거하는 필요한 반복합니다.
6. 슬라이드에서 여러분에게 표본 (들)을 마운트
- 직사각형 모양의 새 슬라이드에 90 % 글리세롤의 피펫 80-90 μL. 글리세롤의도, 직사각형 얼룩을 할 수있는 피펫 팁의 측면을 사용합니다. (이 한 슬라이드에 두 RPE를 설치하는 절차입니다.)
- 표본에 따라 15 ° 포셉의 낮은 팔을 넣습니다. 부드럽게 해부 슬라이드에서 표본을 리프트.
- 천천히 글리세롤로 표본을 낮추십시오. 부드럽게 당신은 표본 아래에서 그들을 나가면 포셉은 호기심.
- 반복 다른 표본에 대한 6.1-6.3 단계를 반복합니다.
- 긴 측면이 몸에 직각되도록 슬라이드를 회전합니다. 귀하의 커버 유리를 잡고 45 °가 슬라이드를 감동되도록 슬라이드 각도. 그들이 터치 때까지 글리세롤의 얼룩쪽으로 그것을 이동합니다. 커버 유리와 슬라이드 사이의 연락 유지, 서서히 슬라이드의 가장자리쪽으로, 멀리 얼룩의 커버 유리를 이동합니다. 슬라이드의 긴 측면과 커버 유리 최대 라인 수 있도록 그들이 평행하고 있습니다. 당신의 엄지와 집게손가락 사이에 커버 유리의 모서리를 잡아.
- 다른 손에 15 °의 집게를 선택하십시오. 팔 사기꾼의 커버 유리의 위쪽 (무료) 모서리 크레이들. 아주 천천히, 커버 유리를 낮추십시오. 연락이 커버 유리와 글리세롤 사이에 만들어진 경우, 중지하고 마이 그 레이션하는 글리세롤 기다립니다. 이 낮추고 RPE 전체 마운트가 완전히 덮여 때까지 기다리고를 반복합니다. 이것은 기포를 캡처에서 높은 점성 글리세롤을 방지하는 것입니다. COVERGLASS 아래로 누르지 마 - 글리세롤은 접착력이 매우 가난하고, 그 아래에서 뽑는 것입니다.
- 명확한 매니큐어로 커버 유리 슬라이드 만나는 주위에 페인트.
- 건조에 빈 랙 상단에 슬라이드를 삽입합니다.
7. 대표 결과 :
이 절차의 결과는 꽃처럼 보이는 공정 대칭되어야 구조해야합니다.
그림 1. wildtype C67Bl/6J 마우스에서 전체 마운트 RPE. 검은색 또는 agouti 동물의 RPE는 컬러 갈색 어두운이어야하며 부드러운 표면을 가지고해야합니다. 그것은 꽃잎의 지형에 기복을 통지하기 위해 정상입니다. 어떤주는 표본의 착색은 RPE와 기본 맥락막 모두의 착색의 변수 밀도 때문에 다소 변수가있을 수 있습니다. 화이트 화살표 hypopigmented "채널"을 가리 키 -이 정상이며, 안구의 기본 vasculature 때문입니다. RPE와 기본 맥락막 모두에 물리적 손상이 파란색 화살표를 가리 킵니다.
그림 2. 희석 마우스 전체 마운트 RPE가. 희석 동물에서 수확 표본 거의 투명한에서 카페 프 lait에 색깔이 다양하고 한 표본 여기에 검은 동그라미로 표시, 그 안에서 다양성을 가지고 같습니다. 일반적으로 어린 동물에서 수확 RPE는 가볍고 아르 세 동물의 수확들은 어두운 있습니다. 블랙 화살표 hypopigmented 나타나는 기본 vasculature의 일부를 나타냅니다.
그림 3. Phalloidin의 얼룩은 RPE에 물리적 손상을 감지하는 데 사용할 수 있습니다. Phalloidin의 얼룩은 분명히 상피의 육각형 모양을 보여주는 세포 세포막을 설명합니다. 검은 마우스 (A) 예. 희석 마우스 (B) 예.
그림 4. 희석 마우스 제대로 해부 RPE. (A) 괄호 및 / 또는 접는 좌굴가 발생할 수 있습니다 너무 넓은 데요 각막의 여백을 나타냅니다. 블랙 서클 내에서 눈 뒤쪽에서 제거되지 않은 외부 조직의 과도한 금액을 볼 수 있습니다. 샘플은 희석 동물에서이기 때문에 그들은 특히 분명합니다. 하단 왼쪽에있는 꽃잎은 부분적으로 이상 접혀 있습니다. (B)이 전체 마운트 바람개비의 모양을하고 있습니다. 블랙 화살표 만들어진 상처의 일부를 나타냅니다. 시신경 헤드쪽으로 corneo - scleral 디비드에서 상처의 대부분은 직경에 맞게되지 않습니다. (C) 블랙 화살표 인하가 접선에 수직 직경과 라인에서 만들어진해야하는 방법을 나타냅니다.
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Discussion
RPE는 상동 - 감독 수리 생체내 분석에서 P 유엔 분석의 사이트입니다. P 유엔 분석은 상동 - 감독 수리의 주파수에서 다른 DNA의 손상의 효과 1,2 및 DNA 손상 신호 및 복구 유전자 3,4,5을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 분석은 RPE 1 단일 셀 이벤트를 감지, 매우 민감합니다. 또한 개발 6 중 상동 - 감독 복구 이벤트의 타이밍의 차이를 감지할 수 있습니다. murine 눈은 시신경 7 바깥쪽 반경 개발 및 따라서, 시신경의 머리에서 이벤트의 상대적인 거리들이 발생하는 개발 시간을 연결합니다.
RPE는 또한 망막 개발이나 망막 질환을 연구하는 사람들에게 관심이있다. RPE 세포 교양 수 있지만, 이렇게하기 위해 중요한 제한이 있습니다. 성인 RPE 세포를 게시할 - mitotic 7아르하고 예측할 수 체외에 잘 분아 따위에 의해 번식하지 않습니다. 또한, 성장 할 그 문화 등 많은 변경을 보여주지만, 착색의 변화, 형태, 및 세포 분기점 8 국한되지 않음 - 과학 수사의 초점이되는 특성의 일부. 따라서, RPE의 전체 마운트의 준비는 눈의 개발 및 질병의 생체내 연구를위한 관련 기법입니다.
이 작은 조직의 해부 처음에는 매우 까다롭습니다. 그것은 편안한 것이 중요하고이 비디오를 문서에 그림과 같이 올바른 자세와 위치를 유지합니다. 전체 마운트 RPE가 바람개비처럼 보이는 경우 오랜 상처가, 즉 직각하지 탄젠트에 직경에 맞게 만들어지지 않았기 때문에,이입니다. 이것은 가위가 앞에서 개최 수직 거리에 시체에서없는 경우에 발생할 가능성이 높습니다. 오랜 상처에 톱니 모양 가능성이 인하 사이 가위 날개의 약간의 철수로 인해 발생합니다.
RPE의 표면에 거친하거나 거친 외관은 정상이 아니라이며 시편의 거친 취급으로 인한 손상으로 인해 수 있습니다. 피해 phalloidin의 얼룩을 사용하여 확인할 수 있습니다. 흰색 또는 명확한 반점은 또한 거칠게 취급하거나 주사에 의한 RPE와 기본 맥락막에 구멍입니다.
RPE는 거칠고 불투명 나타나면, 이것은 아마도 신경 망막의 잔해에 의한 것입니다. 눈을 언더파 또는 (미만 2 시간, 4퍼센트 PFA 이상의 4 시간) 이상 - 고정하는 경우 이러한 문제가 발생할 수 있습니다. 이것은 또한 시간의 과도한 기간 (> 6 개월) 창고에있다가 제대로 고정 눈에 발생할 수 있습니다. Dispase 치료는 이러한 잔해를 제거하는 데 사용할 수 있지만, 또한 RPE 헤어지고가 발생할 수 있습니다.
RPE에 물리적 손상을 감지하면 희석 또는 흰둥이 표본 매우 어렵습니다. 우리는 당신 때문에 처리에 발생할 수있는 손해를 볼 수 있도록 초기 해부에 phalloidin의 얼룩을 사용하는 것이 좋습니다. 이렇게하려면 마이크로 원심 분리기 튜브의 1XPBS에 200μL 2 % BSA 1 시간 동안 차단합니다. 다음 2μL phalloidin를 추가하고 20 분 상온에서 어둠 속에 품어. 그런 다음 30 분쯤 어둠 속에서 온도는 실온에서 각각 1XPBS의 1mL와 배 세척. 마운트 평소처럼 슬라이드. * 참고 : 얼룩은 매우 밝은 우리는 flouramount 또는 유사 flourescence - 보존 미디어를 사용하지 않는 것이 좋습니다.
모든 cautioning에도 불구하고, 전체 마운트 RPE는 대단히 섬세하고 아니므로 쉽게 해부, 얼룩, immunohistochemistry, 또는 immunofluorescence을 수행하는 데 필요한 처리를 견딜 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 환경 건강 과학의 국립 연구소에 의해 지원되었다 [K22ES012264에 AJRB]와 미국 암 협회 InstitutionalResearch 그랜트 [ACS - IRG - 00 - 173-04] 조종사 projectaward [AJRB에]. 우리는하지 말아야 할 걸의 예를 들어, 원고 특히 비디오와 아담 브라운에 대한 의견의 중요한 독서에 대한 주교의 실험실의 구성원을 또한 감사드립니다. 우리는 우리에게 해부 비디오 촬영을위한 카메라 설정 그의 해부 범위 / 비디오의 사용을 허용을위한 Greehey 어린이 암 연구소의 박사 도널드 맥유언 감사합니다. 우리는 선명하게 우리의 microdissection 도구의 수리를 위해 코르테 악기에서 Daron 브라운 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| straight forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX |
| 45° forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX |
| 15° "up" forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX |
| spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel |
| binocular dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | use reflected light source |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
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