Summary
Een formele demonstratie van het ontleden van een muis oog, wat resulteert in een hele berg van het retinale pigment epitheel.
Abstract
De retinale pigment epitheel (RPE) ligt aan de achterkant van het oog zoogdieren, net onder de neurale netvlies, die de fotoreceptoren (staafjes en kegeltjes) bevat. De RPE is een monolaag van gepigmenteerde kubische cellen en medewerkers nauw samen met de neurale netvlies er net boven. Deze vereniging maakt de RPE van groot belang voor onderzoekers bestuderen van het netvlies ziekten. De RPE is ook de plaats van een in vivo onderzoek van homologie-gerichte DNA-reparatie, de p un test. De muis oog is bijzonder moeilijk te ontleden door zijn kleine formaat (ongeveer 3,5 mm in diameter) en de bolvorm. Dit artikel toont in detail een procedure voor dissectie van het oog wat resulteert in een hele berg van de RPE. In deze procedure, laten we zien hoe met, in plaats van werk tegen, de bolvormige structuur van het oog. Kortom, zijn het bindweefsel, spieren, en de optische zenuw verwijderd van de achterkant van het oog. Vervolgens worden het hoornvlies en de lens verwijderd. Vervolgens worden de strategische sneden gemaakt die leiden tot een aanzienlijke afvlakking van de resterende weefsel. Ten slotte wordt de neurale netvlies voorzichtig getild, onthullende een intact RPE, die nog steeds is bevestigd aan de onderliggende vaatvlies en de sclera. Deze hele mount kan gebruikt worden om de p un test of voor immunohistochemie of immunofluorescentie de beoordeling van de RPE weefsel uit te voeren.
Protocol
1. Verwijderen Vreemd weefsel van de buitenkant van het oog
- Giet 1X PBS in het deksel van een 35mm schotel. Het niveau moet worden net onder de rand van het deksel.
- Het gebruik van rechte tang, transfer ogen (s) van de opslag buis naar de 35mm schotel. Ogen zijn ondergedompeld in PBS om twee redenen: 1. De vreemde weefsels zal weg "drijven" uit het oog, zodat je kunt zien en ze eenvoudig te verwijderen, en 2. Tijdens de dissectie, zal het oog natuurlijk houden aan haar bolvorm, terwijl in suspensie, zodat u om te werken met deze vorm in plaats van tegen.
- Met behulp van beide paren schuine pincet (45 ° en 15 °), verwijder voorzichtig zo veel spier-en bindweefsel mogelijk te maken, trekt het weefsel tegen de stroom in (dat wil zeggen in de richting van het hoornvlies). Sommige bindweefsel zal blijven. Inspanning moet worden geleverd aan de oogbol knijpen zo min mogelijk.
- Ruil je 15 ° tangen voor de lente schaar. Terwijl het oog stabiel met 45 ° tang, gebruik dan de lente schaar weg te snijden resterende spier-en bindweefsel, evenals de oogzenuw. * Tip: Gebruik de buitenrand van de schaar om het weefsel duwen tegen de korrel (in de richting van de corneo-sclerale verdelen) en vervolgens trim. Ga door totdat alle vreemde weefsel is verwijderd uit het oog.
2. Verwijder het hoornvlies en de lens
- Met het hoornvlies naar boven, gebruik maken van de 45 ° een tang om knijpen om een kleine vouw in het midden van het hoornvlies.
- Met behulp van de lente schaar, maak een kleine incisie aan de onderkant van de flap. Laat de flap.
- Houd de ogen nog steeds met de tang, plaats de onderste schaar in en loodrecht op de incisie en maak een snede in de richting van de corneo-sclerale verdelen. Probeer je ondermes te houden onder de iris, zodat zowel het hoornvlies en de iris worden gesneden. Knip niet helemaal naar de corneo-sclerale verdelen. Houd schaar gestoken in het oog.
- Met behulp van uw 45 ° tang voorzichtig draai het oog, zodat uw schaar parallel aan de corneo-sclerale verdelen en maakt een klein sneetje. Langzaam draait het oog 360 °, het maken van kleine incisies helemaal rond. Nogmaals, probeer het ondermes van uw lente schaar te houden onder de iris, zodat zowel de iris en het hoornvlies worden gesneden. Til de iris en het hoornvlies weg van de rest van het oog en gooi ze weg.
- Kantel het oog op zijn kant en druk voorzichtig neer op de achterste helft van het oog, waardoor de lens uit. Gooi de lens. De binnenkant van de resterende oogschelp wordt omzoomd door de neurale netvlies, die er glad en ondoorzichtig.
3. Kwart van de resulterende oogklep, wat resulteert in een 4 - "petaled", bloem-achtige structuur
- Het oog moet zo worden geplaatst dat de opening van de oogschelp loodrecht op je lichaam. Gebruik je 45 ° een tang om stabiel en de positie van de oogschelp.
- Houd je de lente schaar voor je neus, zodat ze loodrecht op je lichaam, plaatst u de ondermes van uw lente schaar in de bovenste rand van het open oog beker. Met behulp van uw 45 ° tang voorzichtig lijn de oogschelp, zodat een enkele, rechte snede kan worden gemaakt van de corneo-sclerale verdelen in de richting van de oogzenuw hoofd. Alle deelstukken moeten loodrecht op het corneo-sclerale verdeel-en-tenzij anders vermeld, moet zo dicht mogelijk bij de oogzenuwkop mogelijk te gaan zonder te snijden in.
- Draai de oogschelp 180 °, behoud van de haaksheid met je lichaam. Gebruik techniek in stap 3.2 een tweede loodrechte snede te maken.
- Draai de oogschelp en herhaal de techniek zoals beschreven in 3.2 tot en met twee meer bezuinigen. Alle vier de vlees moeten zo dicht mogelijk bij 90 ° uit elkaar mogelijk te maken. Houd er rekening mee dat het oog niet perfect bolvormig, dus er zullen een aantal variabiliteit.
4. Snijd elk van de vier "bloemblaadjes" in de helft, wat resulteerde in een acht-kroonblad bloem-achtige structuur
- Overdracht van de in vieren oogdop van de 35mm schotel naar een schoon objectglas. Met de oogschelp naar boven, schep onder het met de 45 ° tang. Til het uit van de vloeistof en plaats het op een schoon objectglas.
- Met behulp van beide paren schuine pincet, open voorzichtig uit het oog, met de neurale netvlies naar boven. NIET VERWIJDEREN de neurale RETINA-it helpt het oog te houden een aantal van haar ronde vorm, zodat u niet werkt tegen. Het beschermt ook de RPE van wordt per ongeluk beschadigd in de volgende procedures.
- Draai de dia totdat een van de bloemblaadjes is loodrecht op je lichaam.
- Gebruik je 15 ° tang voorzichtig pak de hoek van het blaadje. De hoek van het blaadje moet worden hoornvlies, niet neurale netvlies of RPE. Til op de hoek zachtjes, waardoor het haar kromming behouden.
- Plaats de onderste blad van je veer schaar tussen de bloemblaadjes en de dia. Line-up van uw schaar zodanig dat een enkele, rechte, loodrecht afgesneden kan worden gemaakt van de corneo-sclerale verdelen in de richting van de oogzenuw hoofd. Gesneden zo dicht mogelijk bij de oogzenuw hoofd als mogelijk is zonder te snijden in. Laten gaanhet kroonblad, waardoor het te liggen op de dia.
- Draai het glaasje 90 °, zodat de volgende blaadje loodrecht op je lichaam. Herhaal stap 4.5.
- Herhaal de stappen 4,5 en 4,6 keer meer. De resulterende structuur eruit moet zien als een acht-kroonblad bloem.
5. Verwijder de neurale netvlies
- Pipetteer 100-200 pi van 1X PBS op het monster. Dit voorkomt dat de neurale netvlies blijft plakken als je het af schil van de RPE.
- Typisch de neurale netvlies is losjes aan de RPE. Maar het vergt wel oefening en vaardigheid om alleen de neurale netvlies en niet de RPE te verwijderen. Voorzichtig greep een bloemblad van de neurale netvlies met een paar schuine pincet te stabiliseren (ingedrukt) de rest van het oog met het andere paar van de schuine pincet. Trek de neurale netvlies weg van de rest van het oog. Herhaal deze procedure totdat het gehele neurale netvlies is verwijderd. * Tip: plak het puntje van je 15 ° pincet in de oogzenuw hoofd naar de ogen te verankeren. Gebruik dan de 45 ° tang op te vegen onder de neurale netvlies en til hem uit en weg. Het is meestal het beste om de neurale netvlies lift van de oogzenuw naar de corneo-sclerale verdelen. Zorg ervoor dat u weg te trekken eventuele losse resten van de iris. De iris is vrij kleverig en kan anders vast komen te zitten aan de RPE.
- Spoel het preparaat met 1X PBS. Pipetteer 100-200 pi van 1X PBS in het model en zuigen het back-up. Gooi de PBS. Herhalen als nodig is om stof en vuil te verwijderen.
6. Mount je monster (s) op een dia
- Pipetteer 80 tot 90 pl van 90% glycerol op een nieuwe dia in een rechthoekige vorm. Gebruik maken van de zijde van de pipet tip om een gelijkmatige, rechthoekige uitstrijkje van glycerol te maken. (Dit is de procedure voor het bevestigen van twee RPE op een dia.)
- Steek de onderarm van 15 ° pincet onder het monster. Til het monster uit de ontleden dia.
- Langzaam zakken het monster in de glycerol. Voorzichtig wiebelen de tang als je ze halen van onder het monster.
- Herhaal de stappen 6,1-6,3 voor de andere exemplaren.
- Draai het glaasje, zodat de lange zijde loodrecht op je lichaam. Houd je dekking van glas in een hoek van 45 ° naar de dia zodat het aanraken van de glijbaan. Verplaats het naar de glycerol uitstrijkje totdat ze aan te raken. Onderhouden van de contacten tussen het dekglas en schuif langzaam verplaats de dekking van glas uit de buurt van het uitstrijkje, naar de rand van de dia. Line-up van de lange zijden van de dia en het deksel glas, zodat ze parallel. Houd de hoeken van de dekking van glas tussen duim en wijsvinger.
- Pak de 15 ° pincet in de andere hand. Cradle de bovenste (gratis) rand van het deksel glas in de holte van de arm. Heel langzaam, hoe lager het dekglas. Wanneer contact wordt gemaakt tussen de dekking van glas en de glycerol, stoppen en wachten tot de glycerol om te migreren. Herhaal deze zakken en wachten tot de RPE hele mounts zijn volledig gedekt. Dit is om de zeer stroperige glycerol voorkomen dat het vastleggen van luchtbellen. NIET Duw op de dekglaasje - de glycerol zal uit persen van onder hem, waardoor de hechting zeer slecht.
- Met duidelijke nagellak, verf rond de perimeter waar de dekking van glas en schuif te ontmoeten.
- Plaats de slide op de top van een lege rek te drogen.
7. Representatieve resultaten:
Het resultaat van deze procedure moet een structuur die lijkt op een bloem en moet redelijk symmetrisch zijn.
Figuur 1. Whole mount RPE van een wildtype C67Bl/6J muis. RPE uit zwart of agouti dieren worden donker bruin van kleur en moet een glad oppervlak te hebben. Is het normaal om golvingen aankondiging in de topografie van de bloemblaadjes. De pigmentatie op een geven monster kan enigszins variabel, als gevolg van een variabele dichtheid van pigmentatie van zowel de RPE en het onderliggende vaatvlies. Witte pijlen wijzen naar hypopigmented "kanalen" - dit is normaal en is te wijten aan de onderliggende bloedvaten van het oog. Blauwe pijl wijst naar fysieke schade aan zowel de RPE en het onderliggende vaatvlies.
Figuur 2. Whole mount RPE van een verdunde muis. Monsters geoogst uit verdunde dieren kan variëren in kleur van bijna transparant tot cafe au lait en elk een exemplaar is om variabiliteit binnen het, in zwart aangegeven cirkels hier. In het algemeen, RPE geoogst van jongere dieren zijn lichter en die geoogst uit oudere dieren zijn donkerder. Zwarte pijlen geven een aantal van de onderliggende bloedvaten, die verschijnt hypopigmented.
Figuur 3. Phalloidin kleuren kunnen worden gebruikt om fysieke schade aan de RPE op te sporen. Phalloidin kleuren schetst duidelijk de celmembranen, waarin de zeshoekige vorm van het epitheel. (A) Voorbeeld van een zwarte muis. (B) Voorbeeld van een verdunde muis.
Figuur 4. Een slecht ontleed RPE van een verdunde muis. (A) Haakjes duiden op de marges van het hoornvlies die te breed zijn, wat kan leiden tot knik en / of vouwen. Binnen de zwarte cirkel zie je grote hoeveelheden van vreemde weefsel dat niet zijn verwijderd uit de achterkant van het oog. Ze zijn bijzonder duidelijk, omdat het monster is van een verdunde dier. Het blaadje op de linker onderkant is gedeeltelijk gevouwen. (B) De hele berg heeft het uiterlijk van een pinwheel. Zwarte pijlen geven een aantal van de bezuinigingen die werden gemaakt. Veel van de bezuinigingen van de corneo-sclerale verdelen in de richting van de oogzenuw zijn niet in lijn met de diameter. (C) Zwarte pijlen geven aan hoe de bezuinigingen had moeten worden, in lijn met de diameter en loodrecht op de raaklijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De RPE is de site van de p un test, een in vivo onderzoek van homologie-gericht te herstellen. De p un test is gebruikt om de effecten van de verschillende DNA-schade 1,2 en DNA-schade signalering en repair genen 3,4,5 op de frequentie van homologie-directed reparatie studie. Deze test is zeer gevoelig, het detecteren van single-cell gebeurtenissen op de RPE 1. Het kan ook ontdekken verschillen in de timing van homologie-directed reparatie gebeurtenissen tijdens de ontwikkeling 6. De muizen oog ontwikkelt zich radiaal naar buiten uit de oogzenuw 7 en dus de relatieve afstand van gebeurtenissen uit de oogzenuwkop correleert met de tijd in de ontwikkeling waarin ze zich heeft voorgedaan.
De RPE is ook van belang voor degenen die een studie netvlies ontwikkeling of retinale ziekten. Hoewel de RPE-cellen kunnen worden gekweekt, zijn er belangrijke beperkingen om dit te doen. Volwassen RPE cellen zijn post-mitotische 7 en voorspelbaar niet vermenigvuldigen goed in vitro. Voorts werd in de culturen die wel groeien vertonen veel wijzigingen, met inbegrip van maar niet beperkt tot, wijzigingen in de pigmentatie, morfologie, en cel knooppunten 8 - enkele van de kenmerken die de focus van wetenschappelijk onderzoek. Daarom is de voorbereiding van een hele berg van de RPE is een relevante techniek voor in-vivo studies van de ontwikkeling en ziekten van het oog.
Dissectie van deze kleine weefsel is erg lastig in het begin. Het is belangrijk om te ontspannen en onderhouden van de juiste houding en positionering, zoals in deze video artikel. Als een hele berg RPE ziet eruit als een pinwheel, is dit omdat de lange sneden werden niet gemaakt in lijn met de diameter, dus niet loodrecht op een raaklijn. Dit is het meest waarschijnlijk optreden wanneer de schaar niet worden gehouden in de voorkant van en loodrecht uit de buurt van het lichaam. Een rafelige verschijning aan de lange sneden is waarschijnlijk te wijten aan een lichte intrekking van de schaar messen tussen de bezuinigingen.
Een ruwe of ruige verschijning aan de RPE oppervlak is niet normaal en kan te wijten zijn aan schade veroorzaakt door ruwe behandeling van het monster. Schade kan worden gecontroleerd met behulp van phalloidin vlekken. Witte of heldere vlekken zijn gaten in de RPE en de onderliggende vaatvlies, mede veroorzaakt door ruwe behandeling of punctie.
Als de RPE verschijnt ruw en ondoorzichtig, is dit waarschijnlijk te wijten aan overblijfselen van de neurale netvlies. Dit kan gebeuren als de ogen zijn onder-of over-vaste (minder dan 2 uur, meer dan 4 uur in 4% PFA). Dit kan ook voorkomen in correct is bevestigd ogen die in opslag zijn voor een veel tijd (> 6 maanden). Dispase behandeling kan worden gebruikt om dergelijke resten te verwijderen, maar kan ook leiden tot de RPE te breken.
Om fysieke schade aan de RPE is erg moeilijk in verdunde of albino exemplaren. Wij raden u aan phalloidin vlekken op je eerste dissecties dus je kan elke schade die zou kunnen hebben voorgedaan als gevolg van het hanteren te zien. Om dit te doen, te blokkeren voor een uur met 200μL 2% BSA in 1XPBS in een micro-centrifugebuis. Voeg vervolgens 2μL phalloidin en incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Dan 3x wassen met 1 ml van 1XPBS gedurende 30 minuten elk bij kamertemperatuur in het donker. Mount dia's zoals gewoonlijk. * Opmerking: de vlek is zeer helder en we raden het gebruik van flouramount of soortgelijke fluorescentie-het behoud van media.
Ondanks alle waarschuwen, een ganse berg RPE is niet erg delicaat en is goed bestand tegen de behandeling die nodig zijn om dissectie, vlekken, immunohistochemie, of immunofluorescentie uit te voeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door het National Institute of Environmental Health Sciences [K22ES012264 om AJRB] en een American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] piloot projectaward [naar AJRB]. We danken ook de leden van de bisschop lab voor de kritische lezing van het manuscript en commentaren op de video-en Adam Brown in het bijzonder, voor het voorbeeld van hoe het niet moet. Wij danken dr. Donald McEwen of Cancer Greehey Children's Research Institute voor het toestaan van ons het gebruik van zijn ontleden omvang / video-camera set-up voor het filmen van de dissectie video. Wij danken Daron Brown op Corte Instrumenten voor het slijpen en reparatie van onze microdissectie tools.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| straight forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX |
| 45° forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX |
| 15° "up" forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX |
| spring scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel |
| binocular dissecting microscope | Carl Zeiss, Inc. | Discovery V.8 | use reflected light source |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
- Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice. Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).
- Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice. Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).
- Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice. Cancer Res. 60, 395-399 (2000).
- Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion. J. Nucleic Acids. , (2010).
- Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo. Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).
- Bishop, A. J. p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development. Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).
- Bodenstein, L., Sidman, R. L. Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity. Dev Biol. 121, 192-204 (1987).
- Burke, J. M. Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt? Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).
