Summary
Применимость анализа клоногенных для оценки репродуктивной жизнеспособности была создана более 50 лет. Здесь мы показываем, общий порядок выполнения анализа клоногенных с прилипшие клетки.
Abstract
Клоногенных (или колониеобразующих) анализа была создана более 50 лет; оригинальная статья, описывающая метод был опубликован в 1956 году 1. Помимо документального метода, первоначальное исследование ориентиром создается при первом радиационно-дозовой кривой для рентгеновских облученных млекопитающих (HeLa) клеток в культуре 1. В принципе, анализ клоногенных позволяет оценить различия в репродуктивных жизнеспособность (способность клеток к воспроизведению потомства, то есть одну ячейку, чтобы сформировать колонию 50 и более клеток) между контролем необработанных клетках и клетках, которые подверглись различные методы лечения, такие как воздействие ионизирующего излучения, различные химические соединения (например, цитостатики), либо в других случаях генетических манипуляций. Анализа стал наиболее широко принятый метод в области радиационной биологии и широко используется для оценки радиационной чувствительности различных клеточных линий. Кроме того, анализ клоногенных обычно используется для мониторинга эффективности излучения изменения соединений и для определения эффектов цитотоксических агентов и других противораковых терапии на колониеобразующих способности, в различных клеточных линий. Типичный выживания клоногенных эксперимент с использованием сторонником линии клетки включает в себя три отдельных компонента, 1) лечение клеточный монослой в колбах культуре тканей, 2) подготовка одного суспензии клеток и покрытие соответствующее число клеток в чашках Петри и 3) установление и окрашивание колонии Следующие соответствующего периода инкубации, которые могут варьироваться от 1-3 недель, в зависимости от клеточной линии. Здесь мы показываем, общий порядок выполнения анализа клоногенных с приверженцем клеточные линии с использованием увековечены кератиноцитов человека клеточной линии (FEP-1811) 2. Кроме того, наши цели, чтобы описать общие черты анализов клоногенных в том числе расчет эффективности покрытий и выживания фракций после контакта клеток к радиации, и примером модификации радиационно-ответ с использованием природных формулировка антиоксидант.
Protocol
1. Культуры клеток и экспериментальной установки
- Кератиноциты человека, учитываются в качестве монослоев в 75 см 2 культуре ткани колбы, содержащие 15 мл кератиноцитов-SFM (К-SFM) среде (GIBCO, бессывороточной среде) с добавлением L-глютамина (2 мМ), эпидермальный фактор роста (5 нг / мл), бычий гипофизарный экстракт (40 мкг / мл) и 20 мг / мл гентамицина. Клетки, выращенные в увлажненном 5% CO 2 среде при температуре 37 ° C.
- Клетки высевают на 12 х 25 см 2 культуре ткани колбы, содержащие 5 мл K-SFM среды.
Одноместный клеточные суспензии готовят трипсинизации. Клетки промывают фосфатным буферным раствором и инкубировали с 0,05% трипсин / ЭДТА решение в течение 5-10 минут. Когда клетки начинают становиться округлыми и ~ 30% из них индивидуальный 3-х томах модифицированных Дульбеко орел среде, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки добавляют для нейтрализации трипсина. Клетки отделяются с помощью пипетки вверх и вниз (20 раз). Клетки подсчитывают использованием гемоцитометра.
Соответствующие номера сотовых высевают в зависимости от времени удвоения клеточной линии (примерно 20 часов для человека FEP-1811 кератиноцитов). Целью является достижение ~ 90% слияния (~ 10 6 клеток на колбу) на день эксперимента.
Эксперимент, состоящий из 12 колб является оптимальным для одного анализа клоногенных (шесть необлученного контроля и шести облученных колбы), которые могут быть завершены примерно в четыре часа.
2. Лечение и облучения
- Лечить клеток для соответствующего времени с соответствующим изменением радиационно-соединения и подвергать клетки воздействию ионизирующей радиации или γ-излучения или рентгеновских лучей.
Обычно шесть колб служить покрытие эффективность (без лечения) и наркотиков только контролирует. Остальные шесть колб облучении.
В этом примере кератиноцитов человека лечатся с различной концентрацией Cinnulin PF (СПЛ; Integrity нутрицевтики International, Спринг Хилл, Теннесси, США; репрезентативные данные по 20 мкг / мл показано ниже), растворимый в воде природный антиоксидант формулировка, за 1 час при 37 ° C. Клетки облучают 4 Гр использованием 137 Cs источника (Gammacell 1000 Elite облучателя; Nordion International, ON, Канада, 1,6 Гр / мин).
3. Обшивка
- После лечения, один клеточные суспензии получаются как описано выше.
- Количество клеток в каждом образце считаются тщательно используя гемоцитометра и разводят так, что соответствующие номера сотовых высевают в чашки Петри (пять повторов каждый на 15 мм, посуда).
Покрытие эффективности и / или доли выживших следует ожидать при принятии решений количество клеток для семян на чашку. Целью является достижение диапазоне от 20 - 150 колоний.
Чашки Петри расположены в увлажненной пластиковые окна клонирования и инкубировали в 5% CO 2 окружающей среды на 37 ° С для образования колоний.
Инкубационный период для образования колоний варьирует от 1-3 недель для различных клеточных линий, считается, что время должно быть эквивалентно по крайней мере шесть клеточных делений. В этом примере, контроль блюда для кератиноцитов человека требуется восемь дней сформировать достаточно большой клонов, состоящих из 50 и более клеток.
4. Фиксация и окрашивание колонии
Выполните следующие действия в вытяжном шкафу.
- Аккуратно снимите СМИ от каждой из пластин аспирации.
- Промыть каждую тарелку с 5 мл 0,9% физиологического раствора.
- Fix колонии с 5 мл 10% нейтральный буферный формалин решение в течение 15-30 минут.
- Пятно с 5 мл 0,01% (м / о) кристаллический фиолетовый в дН 2 O в течение 30-60 минут.
- Вымойте избыток фиолетового кристалла с дН 2 O и позволяют блюда для просушки.
5. Подсчет колоний
Стереомикроскоп
- Колонии, содержащие более 50 отдельных клеток считаются использованием стереомикроскопа.
Цифровые изображения и подсчета использования для обработки изображений
- Цифровые изображения из колонии полученные с помощью камеры или сканера
- Колонии подсчитывают использованием изображений анализа программных пакетов, как описано ниже.
Сотовые подсчета использованием ImageJ (Фиджи Версия 1.44a)
- Откройте файл изображения на Фиджи, перейдите в меню Файл -> Открыть.
- Если необходимо преобразовать изображение в 8-битном формате, перейдите в Image -> Adjust ...-> Threshold.
- Отрегулируйте порог на снижение уровня неспецифической фоновом режиме, так что только колонии обнаружено.
- Граф колоний, используя следующие: переход к процессу -> двоичный -> Найти максимумов.
Для этого изображения формата, шум толерантности может быть установлена в 0. Убедитесь, что облегченный вариант фона помечены иПредварительный просмотр обнаружены максимумы, чтобы убедиться, что все клеточные колонии были правильно зарегистрированы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом примере человека FEP-1811 кератиноцитов лечили различные концентрации до 100 мкг / мл СПЛ; данные будут показаны на 20 мкг / мл СПЛ в течение 1 часа при температуре 37 ° C. После лечения клетки облучали 4 Гр использованием 137 Cs источника (Gammacell 1000 Elite облучателя; Nordion International, ON, Канада, 1,6 Гр / мин). Для контроля необработанных и наркотиков только лечение 100 клеток высевали в каждой чашке Петри и 1000 клеток на чашку высевают для облученных образцов. Как указано в таблице выше, колонии были подсчитаны использованием стереомикроскопа или цифровых изображений (рис. 1) были взяты для подсчета использования ImageJ. Среднее количество колоний для пяти блюд был использован для расчета эффективности покрытий и выживших фракции. Эти данные указывают на защитное действие излучения (фактор защиты от ~ 3) с естественным формулировка антиоксидант.
Представитель Результаты
| Лечение | Метод подсчета | Сотовые покрытием | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Покрытие Efficiency1 | Выжившие Fraction2 |
| Необработанных клетках | Ручной (Стереомикроскопа) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0,23 | 1 |
| Ручной (Цифровое изображение) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0,23 | 1 | |
| Найти Maxima (Фиджи) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0,22 | 1 | |
| 20 мМ СПЛ | Ручной (Стереомикроскопа) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0,15 | 0,66 |
| Ручной (Цифровое изображение) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0,15 | 0,67 | |
| Найти Maxima (Фиджи) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0,15 | 0,65 | |
| 4 Гр | Ручной (Стереомикроскопа) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0,03 | 0,14 |
| Ручной (Цифровое изображение) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| Найти Maxima (Фиджи) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| 20 мМ СПЛ + 4 Гр | Ручной (Стереомикроскопа) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0,11 | 0,47 |
| Ручной (Цифровое изображение) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0,11 | 0,45 | |
| Найти Maxima (Фиджи) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0,11 | 0,47 |
1 Покрытие КПД = количество колоний рассчитывали / количество посеянных клеток
2 Выжившие фракция = (число колоний рассчитывали / количество посеянных клеток) / покрытие эффективности
Таблица 1. Расчет эффективности покрытий и выживание и сравнение колонии рассчитывает с помощью различных методов
Рисунок 1. Цифровое изображение, показывающее колонии производства человека, FEP-1811, кератиноциты следующее покрытие из 1000 ячеек и восемь дней инкубации. (А) Клетки облучали 4 Гр и (Б) клетки обрабатывали 20 мкг / мл СПЛ в течение 1 часа при температуре 37 ° C до облучения 4 Гр. Защитный эффект излучения с естественной формулировка антиоксидант очевидна.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Поддержке австралийского Института ядерной науки и техники не будет подтверждено. TCK был удостоен AINSE наград. Эпигеномном Лаборатории медицины при поддержке национального здравоохранения и медицинских исследований Совета Австралии (566 559). HR поддерживается австралийской аспирантуре и BakerIDI ярких наград искры. Эта работа финансируется за счет CRC для биомедицинской визуализации Development Ltd (CRC-BID), созданы и поддерживаются в совместную программу исследований австралийского правительства центров. СО является получателем австралийской аспирантов награду и CRC-BID дополнительные стипендии.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
