Summary
L'applicabilité du test clonogénique pour évaluer la viabilité de la reproduction a été mis en place depuis plus de 50 ans. Ici, nous démontrons la procédure générale pour réaliser le dosage clonogénique de cellules adhérentes.
Abstract
Le clonogénique (ou formant colonie) test a été mis en place depuis plus de 50 ans, le document original décrivant la technique a été publié en 1956 1. En dehors de la documentation du procédé, l'étude de référence initiale générée de la première courbe de réponse en rayonnement dose de rayons X irradiés mammifères (HeLa) des cellules en culture 1. Fondamentalement, le test clonogénique permet d'évaluer les différences de viabilité de reproduction (capacité des cellules à produire une descendance; c'est à dire une seule cellule pour former une colonie de 50 cellules ou plus) entre les cellules témoins non traitées et les cellules qui ont subi divers traitements tels que l'exposition aux rayonnements ionisants, divers composés chimiques (par exemple des agents cytotoxiques) ou dans d'autres cas de manipulation génétique. Le dosage est devenue la technique la plus largement acceptée en radiobiologie et a été largement utilisé pour évaluer la sensibilité aux rayonnements de différentes lignées cellulaires. En outre, le test clonogénique est couramment utilisé pour monitoring l'efficacité des composés rayonnement modification et pour déterminer les effets des agents cytotoxiques et d'autres thérapies anti-cancéreuses sur la capacité de formation de colonies, dans différentes lignées cellulaires. Une expérience de survie clonogénique typique utilisant des lignées de cellules adhérentes comporte trois composantes distinctes, 1) le traitement de la monocouche de cellules dans des flacons de culture tissulaire, 2) préparation des suspensions cellulaires simples et placage d'un nombre approprié de cellules dans des boîtes de Pétri et 3) fixation et coloration des colonies après une période d'incubation approprié, qui peut varier de 1-3 semaines, en fonction de la lignée cellulaire. Ici nous montrent le mode opératoire général pour la réalisation du test clonogénique avec des lignées de cellules adhérentes à l'aide d'une ligne cellulaire de kératinocytes humains immortalisés (FEP-1811) 2. En outre, nos objectifs sont de décrire les caractéristiques communes des essais clonogéniques y compris le calcul de l'efficacité d'étalement et des fractions de survie après exposition des cellules aux radiations, et d'illustrer la modification desrayonnement de réponse à l'utilisation d'une formulation anti-oxydant naturel.
Protocol
1. Culture cellulaire et expérimental
- Kératinocytes humains sont maintenues sous forme de monocouches dans 75 cm 2 flacons de culture tissulaire contenant 15 ml de kératinocytes-SFM (K-SFM) (GIBCO, un milieu sans sérum) additionné de L-glutamine (2 mM), facteur de croissance épidermique (5 ng / mL), extrait pituitaire bovin (40 pg / ml) et 20 mg / mL de gentamicine. Les cellules sont cultivées dans une atmosphère humidifiée 2 5% l'environnement à 37 ° C.
- Les cellules sont ensemencées en 12 x 25 cm 2 flacons de culture tissulaire contenant 5 ml de milieu K-SFM.
Suspensions monocellulaires sont préparés par traitement à la trypsine. Les cellules sont lavées avec du PBS et incubées avec un 0,05% de trypsine / EDTA solution pendant 5-10 minutes. Lorsque les cellules commencent à s'arrondir et ~ 30% sont détachés, 3 volumes de Eagle modifié par Dulbecco milieu contenant 10% de sérum fœtal bovin est ajouté pour neutraliser la trypsine. Les cellules sont détachées par aspirationet vers le bas (20 fois). Les cellules sont comptées à l'aide d'un hémocytomètre.
Le nombre de cellules appropriées sont ensemencées en fonction du temps de doublement de la ligne de cellules (environ 20 heures pour l'homme FEP-1811 kératinocytes). L'objectif est de parvenir à une confluence de 90% (~ 10 6 cellules par flacon) le jour de l'expérience.
Une expérience composé de 12 flacons est optimal pour un seul essai clonogénique (six témoins non irradiés et irradiés six flacons), qui peut être complété en environ quatre heures.
2. Traitement et irradiation
- Traiter les cellules pendant un temps approprié avec un rayonnement pertinentes composé modifiant et exposer les cellules aux rayonnements ionisants soit γ-irradiation ou rayons-X.
Typiquement six flacons servir efficacité d'étalement (non traité) et les commandes de médicaments seulement. Les six autres flacons sont irradiées.
Dans cet exemple, les kératinocytes humains sonttraitées avec différentes concentrations de Cinnulin PF (PCF; nutraceutiques intégrité internationales, Spring Hill, Tennessee, États-Unis, des données représentatives de 20 pg / mL est indiqué ci-dessous), une formulation soluble dans l'eau antioxydant naturel, pendant 1 heure à 37 ° C. Les cellules sont irradiées avec 4 Gy en utilisant une source de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiateur Elite; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min).
3. Placage
- Après le traitement, les suspensions cellulaires simples sont obtenus comme décrit précédemment.
- Le nombre de cellules dans chaque échantillon sont comptés soigneusement à l'aide d'un hémocytomètre et dilué de sorte que le nombre de cellules appropriées sont ensemencées dans des boîtes de Pétri (cinq répétitions de chaque en 15 plats mm).
L'efficacité d'étalement et / ou fraction survivante devrait être prévu au moment de décider du nombre de cellules de graines par plaque. L'objectif est de parvenir à une fourchette comprise entre 20 à 150 colonies.
Des boîtes de Pétri sont disposés dans un p humidifiéboîte de clonage lastic et incubées dans un environnement de CO 2 5% à 37 ° C pour la formation de colonies.
Le temps d'incubation pour la formation de colonies varie de 1-3 semaines pour les lignées cellulaires différentes, il est admis que le temps doit être équivalente à au moins six divisions cellulaires. Dans cet exemple, les plats de contrôle des kératinocytes humains besoin de huit jours pour former des clones suffisamment nombreuse composée de 50 cellules ou plus.
4. Fixation et coloration des colonies
Effectuez les étapes suivantes dans une hotte.
- Retirer doucement le support de chacune des plaques par aspiration.
- Laver chaque plaque avec 5 mL de solution saline à 0,9%.
- Fixer les colonies avec 5 ml solution à 10% formol neutre tamponné pendant 15-30 minutes.
- Coloration à 5 ml 0,01% (p / v) de cristal violet à dH 2 O pendant 30-60 minutes.
- Laver cristal violet excès avec dH 2 O et permettre plats à sécher.
5. Le comptage de colonies
Stéréomicroscope
- Des colonies contenant plus de 50 cellules individuelles sont comptées à l'aide d'un stéréomicroscope.
D'imagerie numérique et de comptage en utilisant un logiciel d'imagerie
- Les images numériques des colonies sont obtenues à l'aide d'un appareil photo ou le périphérique de numérisation
- Les colonies sont comptées à l'aide d'imagerie paquets logiciels d'analyse comme décrit ci-dessous.
Le comptage cellulaire en utilisant ImageJ (Fidji Version 1.44a)
- Ouvrez le fichier image à Fidji, allez dans Fichier -> Ouvrir.
- Si nécessaire convertir l'image en format 8 bits, allez dans Image -> Réglages ... -> Seuil.
- Ajuster le seuil de réduire les niveaux de fond non spécifique de sorte que seules les colonies sont détectées.
- Compter les colonies en utilisant le suivant: aller au Processus -> Binaire -> Trouver maxima.
Pour ce format d'image, la tolérance au bruit peut être réglé sur 0. Assurez-vous que l'option est cochée fond clair etun aperçu de la détection des maxima de vérifier que toutes les colonies de cellules ont été correctement enregistré.
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Discussion
Dans cet exemple, l'homme FEP-1811 kératinocytes ont été traitées avec différentes concentrations allant jusqu'à 100 mg / mL PCF; données sont présentées pour 20 pg / ml PCF pendant 1 heure à 37 ° C. Cellules de traitement suivants ont été irradiés avec 4 Gy en utilisant une source de 137 Cs (Gammacell 1000 irradiateur Elite; Nordion International, ON, Canada, 1,6 Gy / min). Pour le contrôle non traités et de drogues traitements à seulement 100 cellules ont été étalées dans chaque boîte de Pétri et 1000 cellules par boîte ont été étalées pour les échantillons irradiés. Comme indiqué dans le tableau ci-dessus, les colonies ont été comptées à l'aide d'un microscope stéréoscopique ou des images numériques (figure 1) ont été prises pour compter en utilisant ImageJ. Le nombre de colonies moyenne des cinq plats a été utilisé pour calculer l'efficacité de placage et fraction survivante. Les données indiquent un effet protecteur de rayonnement (facteur de protection ~ 3) avec la formulation antioxydant naturel.
Les résultats représentatifs
| Traitement | Méthode de comptage | Cellule plaqué | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | Placage Efficacité1 | Survivant Fraction2 |
| Les cellules non traitées | Manuel (Stéréomicroscope) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0,23 | 1 |
| Manuel (Image numérique) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0,23 | 1 | |
| Trouvez Maxima (Fidji) | 100 | 23 | 33 | 14 | 21 | 0,22 | 1 | ||
| 20 mM PCF | Manuel (Stéréomicroscope) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0,15 | 0,66 |
| Manuel (Image numérique) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0,15 | 0,67 | |
| Trouvez Maxima (Fidji) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0,15 | 00,65 | |
| 4 Gy | Manuel (Stéréomicroscope) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0,03 | 0,14 |
| Manuel (Image numérique) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| Trouvez Maxima (Fidji) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0,04 | 0,16 | |
| 20 mM PCF + 4 Gy | Manuel (Stéréomicroscope) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0,11 | 0,47 |
| Manuel (Image numérique) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0,11 | 0,45 | |
| Trouvez Maxima (Fidji) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0,11 | 0,47 |
1 Efficacité Placage = nombre de colonies comptées / nombre de cellules ensemencées
2 Fraction Survivre = (nombre de colonies comptées / nombre de cellules plaqué) / efficacité d'étalement
Tableau 1. Calcul de l'efficacité d'étalement et de la survie et la comparaison des comptages de colonies en utilisant diverses méthodes
Figure 1. D'image numérique montrant colonies produites par l'homme, FEP-1811, les kératinocytes après plaquage de 1000 cellules et huit jours d'incubation. (A) Les cellules ont été irradiées avec 4 Gy et (B), les cellules ont été traitées avec 20 pg / mL PCF pendant 1 heure à 37 ° C avant l'irradiation avec 4 Gy. Un effet de protection contre le rayonnement avec la formulation antioxydant naturel est évidente.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Le soutien de l'Institut australien des sciences et génie nucléaires est reconnu. TCK a été récipiendaire du prix Ainse. Médecine de laboratoire épigénomique est soutenu par la National Health and Medical Research Council of Australia (566559). HR est pris en charge par un Australien d'études supérieures et des prix BakerIDI étincelles lumineuses. Ce travail est financé par le CRC d'Imagerie Biomédicale Development Ltd (CRC-BID), mis en place et soutenus dans le cadre de la recherche du gouvernement australien centres du programme de coopération. Le CO est le destinataire d'un australien d'études supérieures prix et une bourse supplémentaire CRC-BID.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
