Summary
תחולתה של assay clonogenic להערכת הכדאיות הרבייה הוקם עבור יותר מ -50 שנה. כאן אנו מדגימים את הנוהל הכללי לביצוע assay clonogenic עם תאים חסיד.
Abstract
Assay (או מושבה להרכיב) clonogenic הוקם במשך יותר מ 50 שנים; את הנייר המקורי המתאר את השיטה פורסמה בשנת 1956 1. מלבד המתעדים את השיטה, את המחקר ציון דרך הראשוני שנוצר כבר בסיבוב הראשון קרינה במינון התגובה רנטגן מוקרן (הלה) בתאי יונקים בתרבות 1. ביסודו של דבר, assay clonogenic מאפשר הערכה של ההבדלים הכדאיות הרבייה (יכולת של התאים לייצר צאצאים, כלומר תא בודד להקים מושבה של 50 תאים או יותר) בין לתאי קבוצת הביקורת תאים שעברו טיפולים שונים כגון חשיפה כדי מייננת קרינה, תרכובות כימיות שונות (סוכני ציטוטוקסיות למשל) או במקרים אחרים מניפולציה גנטית. Assay הפך את הטכניקה המקובלת בביולוגיה קרינה כבר בשימוש נרחב להערכת רגישות לקרינה של שורות תאים שונות. יתר על כן, assay clonogenic נפוץ לניטור יעילות של תרכובות קרינה שינוי ו לקביעת ההשפעות של סוכני ציטוטוקסיות אחרות נגד סרטן ותרופות על היכולת להרכיב המושבה, שורות תאים שונות. ניסוי טיפוסי הישרדות clonogenic חסיד באמצעות קווי תאים כוללת שלושה מרכיבים נפרדים, 1) טיפול monolayer התא צלוחיות בתרבית רקמה, 2) הכנת תרחיפים תא יחיד ציפוי המספר המתאים של תאים בצלחות פטרי ו -3) תיקון ו מכתים המושבות לאחר תקופת דגירה רלוונטי, אשר יכול לנוע בין 1-3 שבועות, בהתאם לקו הסלולרי. כאן אנו מדגימים את הנוהל הכללי לביצוע assay clonogenic עם שורות תאים חסיד עם השימוש של קו תאים אנושיים הנציח keratinocyte (FEP-1811) 2. כמו כן, המטרות שלנו הן כדי לתאר תכונות משותפות של מבחני clonogenic כולל חישוב יעילות ציפוי שברים ההישרדות לאחר חשיפה לקרינה של תאים, וכדי להדגים שינוי בתגובה קרינה עם השימוש ניסוח נוגדי חמצון טבעיים.
Protocol
1. Cell התרבות ניסויית הקמה
- קרטינוציטים האדם מתוחזקים כמו monolayers ב 75 2 ס"מ רקמות צלוחיות תרבות המכיל 15 מ"ל של keratinocyte-SFM (K-SFM) בינוני (GIBCO, סרום ללא בינוני) בתוספת L-גלוטמין (2 מ"מ), גורם הגדילה באפידרמיס (5 ng / mL), תמצית בלוטת יותרת המוח שור (40 מיקרוגרם / מ"ל) ו - 20 מ"ג / מ"ל גנטמיצין. התאים גדלים בסביבה CO humidified 5% 2 ב 37 ° C.
- תאים הם זורעים לתוך 12 x 25 ס"מ 2 רקמות צלוחיות תרבות המכיל 5 מ"ל של מדיום K-SFM.
המתלים תא יחיד מוכנים ידי trypsinization. תאים נשטפים עם פוספט שנאגרו מליחים מודגרות עם פתרון טריפסין / EDTA 0.05% למשך 5-10 דקות. כאשר התאים מתחילים להיות מעוגלות ~ 30% מנותקים, 3 כרכים של מדיום שונה נשר של Dulbecco המכיל 10% בסרום שור העובר הוא הוסיף לנטרל את טריפסין. התאים מנותקים ידי pipetting למעלה ולמטה (20 פעמים). תאים נספרים באמצעות hemocytometer.
המספרים המתאימים תא זרע לפי זמן ההכפלה של הקו הסלולרי (כ 20 שעות אדם FEP-1811 קרטינוציטים). המטרה היא להשיג confluency ~ 90% (~ 10 6 תאים לכל בקבוק) ביום הניסוי.
הניסוי המורכב 12 צלוחיות הוא אופטימלי עבור assay clonogenic יחיד (שישה לשלוט unirradiated שש צלוחיות מוקרן) אשר יכול להסתיים כארבע שעות.
2. טיפול הקרנה
- פנקו את התאים לזמן מתאים עם תרכובת קרינה שינוי רלוונטי לחשוף את התאים לקרינה מייננת או γ-קרינה או קרני רנטגן.
בדרך כלל six צלוחיות לשמש יעילות ציפוי (מטופל) בקרות סמים בלבד. אחרים שש צלוחיות הם מוקרן.
בדוגמה זו קרטינוציטים אדם מטופלים עם ריכוז שונים של Cinnulin PF (ע.מ.; בריאותיים Integrity הבינלאומי, ספרינג היל, טנסי, ארה"ב, נציג נתונים עבור 20 מיקרוגרם / מ"ל מוצג להלן), נוגד חמצון מסיס במים ניסוח טבעי, במשך שעה 1 בשעה 37 ° C. תאים הם מוקרן עם 4 Gy באמצעות מקור 137 Cs (Gammacell 1000 irradiator עלית; Nordion הבינלאומי, על, קנדה; 1.6 Gy / min).
3. ציפוי
- בעקבות הטיפול, השעיות תא בודד מתקבלים כמתואר לעיל.
- מספר תאים מדגם זה נספרות בקפידה באמצעות hemocytometer ומדולל כך מספרים תא המתאימים seeded לתוך בצלחות פטרי (חמישה משכפל של כל 15 מנות מ"מ).
יעילות ציפוי ו / או לשרוד צריך להיות חלק הצפוי כאשר מחליטים את מספר התאים זרע לכל צלחת. המטרה היא להשיג מגוון רחב של בין 20-150 מושבות.
צלחות פטרי מסודרים תיבת שיבוט humidified פלסטיק מודגרות בסביבת 5% CO 2 ב 37 ° C להקמת המושבה.
זמן הדגירה של היווצרות במושבה משתנה בין 1-3 שבועות של שורות תאים שונות, מקובל כי הזמן חייב להיות שווה לפחות שש חלוקות. בדוגמה זו, את הכלים לשלוט על קרטינוציטים אדם דורשים שמונה ימים כדי ליצור שיבוטים מספיק גדול בהיקף של 50 תאים או יותר.
4. תיקון ו מכתים המושבות
השלם את השלבים הבאים ברדס קטר.
- להסיר בעדינות את התקשורת מכל אחד הלוחות על ידי שאיפה.
- לשטוף כל צלחת עם 5 מ"ל סליין 0.9%.
- תקן המושבות עם 5 מ"ל פתרון נייטרלי 10% פורמלין שנאגרו במשך 15-30 דקות.
- כתם סגול עם 5 מ"ל גביש 0.01% (w / v) ב DH 2 O עבור 30-60 דקות.
- לשטוף סגול קריסטל עודף עם DH 2 O ולאפשר מנות לייבוש.
5. במושבה ספירת
Stereomicroscope
- מושבות המכילים יותר מ 50 תאים בודדים נספרים באמצעות stereomicroscope.
הדמיה דיגיטלית ועוד היד נטויה באמצעות תוכנת הדמיה
- תמונות דיגיטליות של המושבות מתקבלים באמצעות מצלמה או מכשיר סריקה
- מושבות נספרים באמצעות ניתוח הדמיה חבילות תוכנה כמתואר להלן.
תא ספירה באמצעות ImageJ (פיג'י גרסה 1.44a)
- פתח את קובץ התמונה בפיג'י, ללכת קובץ -> פתח.
- אם יש צורך להמיר את התמונה לפורמט 8-bit, עבור Image -> התאם את סף ...->.
- התאם סף כדי להפחית את רמות הרקע הלא ספציפית כך שרק מושבות מזוהים.
- ספירת מושבות באמצעות הפעולות הבאות: ללכת תהליך - בינארי> -> מצא את מקסימום.
עבור פורמט התמונה, סובלנות רעש יכול להיות מוגדר 0. ודא כי האפשרות רקע האור מסומנת לצפות בתצוגה מקדימה של מקסימום זוהה כדי לבדוק שכל מושבות תאים נרשמו כהלכה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בדוגמה זו האדם FEP-1811 קרטינוציטים טופלו בריכוזים שונים של עד 100 מיקרוגרם / מ"ל ע.מ., הנתונים הראו על 20 מיקרוגרם / מ"ל ע.מ. שעה 1 ב 37 ° C. תאים בעקבות הטיפול היו מוקרן עם 4 Gy באמצעות מקור 137 Cs (Gammacell 1000 irradiator עלית; Nordion הבינלאומי, על, קנדה; 1.6 Gy / min). בשביל לשלוט על טיפולים רק מטופל סמים 100 תאים היו מצופה בכל צלחת פטרי ו 1000 תאים לכל תבשיל היו מצופה עבור דגימות מוקרן. כפי שניתן לראות בטבלה לעיל, מושבות נספרו באמצעות stereomicroscope או תמונות דיגיטליות (איור 1) נלקחו לספור באמצעות ImageJ. לספור המושבה הממוצע במשך חמש מנות משמש לחישוב יעילות ציפוי חלק שורדים. הנתונים מצביעים על אפקט מגן קרינה (מקדם הגנה ~ 3) עם גיבוש נוגדי חמצון טבעיים.
נציג תוצאות
| טיפול | שיטת ספירת | מצופה Cell | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ציפוי Efficiency1 | שורדים Fraction2 |
| מטופל תאים | ידני (Stereomicroscope) | 100 | 19 | 22 | 38 | 14 | 20 | 0.23 | 1 |
| ידני (תמונה דיגיטלית) | 100 | 22 | 23 | 34 | 15 | 22 | 0.23 | 1 | |
| מצא את מקסימה (פיג'י) | 100 | 23 | 21 | 33 | 14 | 21 | 0.22 | 1 | |
| 20 מ"מ ע.מ. | ידני (Stereomicroscope) | 100 | 18 | 11 | 21 | 15 | 11 | 0.15 | 0.66 |
| ידני (תמונה דיגיטלית) | 100 | 19 | 11 | 23 | 16 | 8 | 0.15 | 0.67 | |
| מצא את מקסימה (פיג'י) | 100 | 17 | 11 | 22 | 17 | 8 | 0.15 | 0.65 | |
| 4 Gy | ידני (Stereomicroscope) | 1000 | 39 | 27 | 28 | 44 | 28 | 0.03 | 0.14 |
| ידני (תמונה דיגיטלית) | 1000 | 42 | 33 | 31 | 42 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| מצא את מקסימה (פיג'י) | 1000 | 42 | 35 | 30 | 43 | 31 | 0.04 | 0.16 | |
| ע.מ. 20 מ"מ + 4 Gy | ידני (Stereomicroscope) | 1000 | 115 | 105 | 98 | 108 | 101 | 0.11 | 0.47 |
| ידני (תמונה דיגיטלית) | 1000 | 117 | 102 | 104 | 103 | 99 | 0.11 | 0.45 | |
| מצא את מקסימה (פיג'י) | 1000 | 121 | 102 | 104 | 102 | 97 | 0.11 | 0.47 |
1 יעילות ציפוי = מספר מושבות ספרתי / מספר התאים מצופה
2 חלקיק לשרוד = (מספר מושבות ספרתי / מספר התאים מצופה) / יעילות ציפוי
1. טבלת חישוב יעילות ציפוי והישרדות והשוואה של ספירת המושבה באמצעות שיטות שונות
באיור 1. תמונה דיגיטלית המציגה מושבות המיוצר על ידי האדם, FEP-1811, קרטינוציטים הבאים ציפוי של 1000 תאים ושמונה ימים דגירה. (א) היו תאים מוקרן עם 4 Gy ו (ב) בתאים שטופלו 20 מיקרוגרם / מ"ל ע.מ. שעה 1 ב 37 ° C לפני הקרנה עם 4 Gy. השפעת קרינה מגן עם גיבוש נוגדי חמצון טבעיים ניכר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
התמיכה של המכון האוסטרלי גרעיני מדע והנדסה הוא הודה. TCK היה זכה בפרסים AINSE. המעבדה לרפואה epigenomic נתמכת הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי של אוסטרליה (566,559). HR נתמך על ידי אוסטרלי לתארים ופרסים BakerIDI ניצוץ בהיר. עבודה זו ממומנת על ידי ה-CRC עבור ביו הדמיה ופיתוח בע"מ (CRC-BID), שהוקם ונתמך תחת שיתופית התוכנית של ממשלת אוסטרליה מחקר מרכזי. CO הוא חתן פרס האוסטרלי לתארים מתקדמים וכן מלגה CRC-BID משלים.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Keratinocyte-serum free medium | Growth medium | Invitrogen | 17005042 | Supplemented with 2mM L-glutamine, 20μg/ml gentamicin, epidermal growth factor, bovine pituitary extract. |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | 0.05% trypsin / EDTA to detach adherent cells; 10 x stock diluted in PBS w/o Ca2+/Mg2+. | |
| Dulbecco’s modified essential medium | Growth medium | Invitrogen | 11885-084 | Supplemented with 10% FBS and 20μg/ml gentamicin; used to neutralise trypsin/EDTA. |
| 0.09% Saline | Solution | Used to wash colonies. | ||
| 10% Neutral buffered formalin solution | Solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | ~4% formaldehyde; used to fix colonies. |
| Crystal violet | Powder | SPI Supplies | 02577-MB | 0.01% crystal violet solution, prepared in dH2O, used to stain colonies. |
| Gammacell 1000 elite irradiator | Nordion International Inc. | |||
| Petri dishes | 60 x 15 mm | Falcon BD | 353002 | |
| Haemocytometer | Hawksley; Medical and Laboratory Equipment | AC1000 | ||
| Cloning box | Plastic box with holes punched at opposite sides of lid; for storing petri dishes during prolonged incubation for colony formation. | |||
| Stereomicroscope | Type 102 | Nikon Instruments | Used to count colonies consisting of >50 cells. |
References
- Puck, T. T., Marcus, P. I. Action of x-rays on mammalian cells. J Exp Med. 103, 653-666 (1956).
- Hurlin, P. J. Progression of human papillomavirus type 18-immortalized human keratinocytes to a malignant phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 570-574 (1991).
