Summary
Eine Demonstration der Herstellung und Verwendung einer extrazellulären Saugelektrode zur elektrophysiologischen Ableitungen von Neugeborenen Nagetier Rückenmark messen
Abstract
Entwicklung von neuronalen Schaltungen und Fortbewegung kann studierte mit Neugeborenen Nagetier Rückenmark central pattern generator (CPG) Verhalten sein. Wir demonstrieren eine Methode, um Saugelektroden, die zur ZMG-Aktivität zu untersuchen sind, oder fiktive Bewegung herzustellen, in seziert Nagetier Rückenmark. Das Nagetier Rückenmark sind in künstlichen Liquor gelegt und die ventralen Wurzeln sind in den Saugelektrode gezogen. Die Elektrode wird durch die Änderung einer im Handel erhältlichen Saugelektrode gebaut. Ein schwerer Silberdraht wird anstelle des Standard-Draht durch das kommerziell erhältliche Elektrode gegeben werden. Das Glas Spitze auf dem kommerziellen Elektrode ist mit einem Kunststoff-Spitze für erhöhte Haltbarkeit ersetzt. Wir bereiten handgezeichneten Elektroden und Elektroden von bestimmten Größen von Rohren gefertigt, wodurch Konsistenz und Reproduzierbarkeit. Die Daten werden gesammelt, mit einem Verstärker und neurogram Akquisition Software. Aufnahmen werden auf einer Luft-Tabelle innerhalb eines Faradayschen Käfigs durchgeführt mechanischen und elektrischen Störungen zu verhindern, beziehungsweise.
Protocol
Elektrophysiologischen Ableitungen von isolierten Rückenmark können genetische und entwicklungsbedingten Veränderungen zu neuronalen Schaltkreisen 1 zeigen. Wir haben bereits gezeigt, eine Methode zu sezieren neonatalen Maus Rückenmark 2. Hier präsentieren wir eine Methode, um Saugelektroden nützlich Aufnahme fiktiven Fortbewegung in isolierten Rückenmark 3 zu erstellen.
Die Spitze eines Kunststoffschlauch Elektrode kann zu einer sehr feinen Spitze von Hand mit einem Tieftemperatur-Alkohol-Lampe 3-5 gezogen werden. Der Kunststoffschlauch (PE90, Clay Adams Intramedic TM) wird über die Flamme gehalten, um den Schlauch in eine formbare Form zu erweichen. Als der Schlauch zu schmelzen beginnt und immer mehr durchscheinend ist es von der Wärmequelle und die Enden sind leicht auseinander gezogen entfernt. Der Zeitpunkt der Entfernung der Röhre aus der Flamme ist wichtig, um sicherzustellen, der Kunststoff nicht einstürzt oder sich spalten, während sie gezeichnet. Der dünne Teil des Schlauches mit einer Rasierklinge ist nach den gewünschten Innendurchmesser geschnitten, wie diktiert durch das Alter der Probe oder der segmentale Ebene des Rückenmarks. Zur Erleichterung der Erteilung eines O-Ring auf das Rohr, ist ein 45 °-Schnitt am dicken Ende des Schlauches mit einer Rasierklinge gemacht. Eine Hülse und O-Ring auf das dicke Ende installiert werden, um die Spitze der Elektrode, um den Lauf der Elektrode befestigen.
Um eigens für große Elektroden ermöglichen und vermeiden die Schwierigkeiten bei der Hand ziehen Elektrodenspitzen, Elektroden können unter Verwendung von kleinen Schlauch in einen dickeren Schlauch (PE90) eingefügt werden. Die Längen der Schläuche sind speziell auf die Anforderungen des Aufnahme-Setup und sind variabel. Wir präsentieren Ihnen die Messungen in unseren Experimenten 1-3,5 verwendet. Ein 1cm Länge von PTFE-Schlauch (Zeus, Small Parts) und einem 10cm Länge PE90 Rohre sind mit einer Rasierklinge geschnitten. Die Enden der kleinen Schlauch sollte untersucht werden, um sicherzustellen, dass sie nicht gequetscht oder geschlossen werden. Sie können geöffnet werden mit einem Insekt pin (Fine Science Tools) sein. Ein Tropfen Klebstoff (JB Weld) wird auf den Mittelpunkt der PTFE-Schläuche gelegt. Die PTFE-Schläuche und Klebstoff sind in der PE90-Schlauch mit Mund Sogwirkung auf die PE90 Rohr gezogen. Ein 45 ° Schnitt wird am dicken Ende des Schlauches gemacht und eine Zwinge und O-Ring verbunden sind, wie frühere.
Die Ferrule und BNC-Stecker sind von einer kommerziellen Saugelektrode abgeschraubt. Der BNC-Anschluss ist in Xylol für 1 Stunde eingeweicht, um die Wachssiegel zu entfernen. Der Stecker wird dann in Wasser gespült und getrocknet.
Eine niedrigere abgewinkelten Seite Port muss auf der Seite des Laufes gemacht werden. Ein Metallstab erhitzt wird mit einem Bunsenbrenner und drückte in das bestehende Loch an der Seite des Fasses in einem flachen Winkel. Ein 15cm Länge von 0,010 Zoll Silberdraht (AM Systems) wird geschnitten und getränkt in Bleichmittel für 15 Minuten. Dies geschieht zu einer Silberchlorid-Beschichtung, die in Signalleitung 6 Hilfsmittel zu schaffen. Der Draht wird mit Wasser gespült, getrocknet und dann gelötet auf die BNC-Buchse. Die BNC-Stecker und Silberdraht in die Saugelektrode Lauf mit genug Platz für die BNC-Buchse an der Seite des Fasses gesteckt bleiben. Saugschlauch wird in den seitlichen Anschluss 2-3cm eingefügt. Silikon-Dichtstoff ist in den Lauf ca. 2-3cm injiziert. Der BNC-Anschluss ist in den Lauf der Elektrode Drücken der Dichtstoff nach vorne eingefädelt.
Die Spitze der Elektrode ist nun in das vordere Ende der Elektrode eingefädelt. Schrumpfschlauch kann auch hinzugefügt, um die Saugleitung von der Seite Port verstärken.
Elektroden werden auf Mikromanipulatoren, die magnetische steht angebracht sind, und stellte in der Nähe der Aufnahme Schüssel montiert. BNC Koaxialkabel sind ein headstage, dass an einen Verstärker verkabelt ist beigefügt. Der Verstärker ist mit einem Adapter (PolyView), die zu einem Analog-Digital-Karte (National Instruments) in einen PC mit Software zur Datenerfassung (PolyView) verbunden ist.
Bei der Aufnahme von elektrophysiologischen Daten ist es notwendig, alle Einmischung von außen zu eliminieren. Die Aufnahme Gericht, Verstärker und Kopf der Bühne auf einer Luft-Tabelle innerhalb eines Faradayschen Käfigs platziert elektrische und mechanische Störungen zu verhindern, beziehungsweise.
Repräsentative Ergebnisse:
Abbildung 1. Ein kommerziell erhältlicher Saugelektrode kann durch Zugabe eines schwereren gauge Silberdraht und eine Spitze aus Kunststoff, die Hand auf einem Spiritusbrenner zu ziehen, oder konstruiert mit handelsüblichen Kunststoffrohren von spezifischen Größen geändert werden. Darüber hinaus ist das Paraffin Dichtstoff mit haltbarer Silikon abdichten Dichtungsmasse ersetzt.
Abbildung 2. Eine schematische Darstellung des Saugelektrode in Bezug auf die Luft-Tabelle (für die mechanische Trennung), Faraday-Käfig (elektrische isolation), Verstärker und Computer. Es wird darauf hingewiesen, dass es eine Masse bezogen, um die Aufnahme Schüssel und einen zweiten Grund, dass die Luft Tisch und Faraday-Käfig verwiesen wird.
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Discussion
Entwicklung des Nervensystems kann studierte unter Verwendung von isolierten Nagetier Rückenmark werden. In Anwesenheit von Neurotransmittern, können fiktive Bewegung aus dem Rückenmark in Form von strukturierten elektrische Aktivität 1,3 erzeugt werden. Diese rhythmischen Ausbrüche sind bei 0,2 bis 0,5 Hz hergestellt und sind in links-rechts und Beuger-Strecker Wechsel gemustert. An verschiedenen Entwicklungsstadien, variiert die Robustheit und Muster dieser Aktivität 1. Genetische Mutationen können auch stören die Strukturierung dieser Tätigkeit 3,5,7. Transgene und Entwicklungsstudien dieser Tätigkeit geben Einblicke in die Organisation der zentralen Muster erzeugen Schaltungen und informieren Studien der neuronalen Entwicklung, in der Regel.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Samuel L. Pfaff ist ein Professor in der Genexpression Laboratories am Salk Institute for Biological Studies und ein Investigator in der Howard Hughes Medical Institute. Diese Arbeit wurde von der Christopher and Dana Reeve Foundation unterstützt. Joe Belcovson, Kent Schnoeker und Mike Sullivan in Multimedia-Ressourcen am Salk Institute unterstützte mit der Fotografie und Bearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PTFE Sub Lite Wall Tubing (Small tubing) | Zeus | 36AWG | 0.005”ID x 0.003” Wall (Small Parts) Also available in 0.003” to 0.006” |
| Large tubing (0.86mm (0.34”)) | BD Biosciences | 427420 | 0.86mm (0.34”) O.D. 1.27mm (.050”) |
| Electrode Barrel | A-M Systems | 573000 | |
| Adhesive | JB Weld | ||
| Adhesive: Silicone caulk | |||
| Solder and soldering iron | |||
| Bleach | |||
| Xylene | |||
| Silver wire: 0.010” | A-M Systems | ||
| Insect pins: Austerlitz 0.1mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Magnetic Stand | Narishige International | GJ-8 | |
| Micromanipulator | Narishige International | MN 151 | |
| Miniboard (Headstage) | Grass Technologies | F-15EB/B1 | |
| Polyview Adaptor Unit | Grass Technologies | PVA 8 | |
| Bipolar Portable Physiodata Amplifier System | Grass Technologies | 15LT | |
| ANALOG TO DIGITAL CARD | National Instruments | 6035E | |
| Air Table; Vibraplane | Kinetic Systems |
References
- Gallarda, B. W., Sharpee, T. O., Pfaff, S. L., Alaynick, W. A. Defining rhythmic locomotor burst patterns using a continuous wavelet transform. Ann N Y Acad Sci. 1198, 133-139 (2010).
- Meyer, A., Gallarda, B. W., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal cord electrophysiology. J Vis Exp. , (2010).
- Gallarda, B. W. Segregation of axial motor and sensory pathways via heterotypic trans-axonal signaling. Science. 320, 233-236 (2008).
- Landmesser, L. The development of motor projection patterns in the chick hind limb. J Physiol. 284, 391-414 (1978).
- Myers, C. P. Cholinergic input is required during embryonic development to mediate proper assembly of spinal locomotor circuits. Neuron. 46, 37-49 (2005).
- Chanin, M. The determination of chloride by use of the silver-silver chloride electrode. Science. 119, 323-324 (1954).
- Goulding, M. Circuits controlling vertebrate locomotion: moving in a new direction. Nat Rev Neurosci. 10, 507-518 (2009).
