Summary
현재 비디오는 개발 zebrafish의 forebrain에서 개별 신경 전구 세포에 대한 라이브 영상을 수행할 수 electroporation과 공촛점 현미경의 조합을 활용하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
분할, 마이 그 레이션 및 신경 전구 세포의 분화의 정확한 패턴을 적절한 두뇌 개발과 기능 1,2에 중요한 있습니다. 생체내 환경에서 복잡한에서 신경 전구 세포의 동작을 이해하기 위해서는 두뇌에 손상 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상이 매우 필요합니다. 이 비디오에서는, 우리는 생체내에 forebrain 신경 전구 세포의 발전을 시각화하는 zebrafish 배아의 고유한 기능을 이용. 우리는 유전자 및 띄엄띄엄 라벨 개별 신경 전구 세포에 electroporation을 사용합니다. 간단히, DNA가 형광 표식에 대한 코딩 구조 22 시간 게시물 수정 (HPF) zebrafish 배아의 전기 펄스가 즉시 배달되었고,의 forebrain의 뇌실로 주입했다. 여섯 시간 후, electroporated zebrafish의 배아는 유리 바닥 문화 요리 낮은 용융 점 아가로 오스와 함께 장착했다. 찬란 표시 신경 전구 세포는 다음 물 수영 객관적인 렌즈를 사용하여 공촛점 현미경 고정 간격 36시간 위해 몇 군데 있었다. 현재의 방법은 forebrain 신경 전구 세포의 생체내 개발에 대한 통찰력을 얻을 수있는 방법을 제공하고 zebrafish 배아의 중추 신경 시스템의 다른 부분에 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. Zebrafish 태아의 준비
- 이틀 electroporation 전에, 여성에서 남성으로 별도의 디바이더를 사용하여 야생 유형 물고기의 교배 새장을 설정합니다.
- electroporation 전 어느 날, 전날의 새장을 짝짓기에 디바이더를 가져옵니다.
- 배아를 수집하고 28.5에서 0.003 %의 phenylthiourea (PTU)를 포함하는 30 ML 배아 중간 ° C. 50 수정된 배아를 품어
- electroporation의 날, dechorionate 수동으로 배아는 22hpf의 발달 단계에 도달 벌금 포셉 (Inox 5 더몬트 전자, 스위스)와 배아. 다음 PTU 0.003 %를 포함 10ml electroporation 대타의 3 (180 MM NaCl, 5mM KCl, 1.8 MM CaCl2, 5 MM Hepes의 산도 7.2)로 배아를 전송합니다.
- 링어이 배아를 마취 위하여 10ml의 electroporation을 420 μl tricaine 주식 (4mg/ml)를 추가합니다.
2. Electroporation 준비
- 유리 사출 니들은 플라밍 - 브라운 P897 풀러 (셔터 인 스트 루먼트, 노바토, CA, 미국)에서 모세 혈관 (필라멘트와 1.2 mm OD, 0.9 mm ID가)에서 가져온되었습니다. 바늘 끝이 그림 1D와 같이 날카로운 끝을 얻으려면 포셉와 부러했다. 팁의 직경 10 μm의 주위해야하며 테이퍼 각도는 30도 근처에있을 것입니다.
- 0.8 %을 준비하고 electroporation 대타의 솔루션에 1퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스 (셸턴 과학 주식 회사 카탈로그 # IB70050). 2 ML의 microcentrifuge 튜브에서 나누어지는 아가로 오스 솔루션입니다. ~ 37 ° C.에서 열 블록에 aliquots 보관
- Gal4/UAS 시스템 electroporated 태아의 신경 전구 세포의 유전자 발현을 유발하는 데 사용됩니다. 두 plasmids이 사용됩니다 : Gal4FF는 유비 쿼터스 모터의 EF1α에 의해 구동되는 플라스미드 EF1α - GFF - PT2KXIG, 그리고 플라스미드 UAS - E1B - EGFP - PT2KXIG합니다.
- EF1α - GFF - PT2KXIG 및 GenEluteTM HP 플라스미드 Midiprep 키트 (시그마)를 사용하여 UAS - E1B - EGFP - PT2KXIG 플라스미드 DNA를 준비합니다.
- plasmids은 다음 10 MM 트리스 · Club 호텔에서 1-2 μg / μl의 최종 농도 (PH 8.5)에 아세트산 나트륨 / 에탄올 침전에 의해 집중되고있다.
- 두 plasmids를 섞어 각 플라스미드 500 NG / μl의 최종 농도 nuclease 무료 H2O로 희석. 솔루션에 페놀 레드 (10분의 1 총 볼륨을 희석)의 추가는 전달의 시각화를 선호합니다. 얼음의 DNA 솔루션을 유지.
- 오른쪽 2 μl DNA 솔루션과 electroporation, backload 주사 바늘 이전 2 선배님은 사출 볼륨을 조정합니다.
3. Electroporation
- stero의 해부 현미경 (50x 최대 배율로 자이스 혈구 Stemi 2000), 공기 압력 주입기 (Narishige IM 300 microinjector) 두 micromanipulators (WPI M3301R, 세계 정밀 계측기, 사라소타, 플로리다, 미국), 그리고 전기 자극기 (SD9 그림 1A와 같이 사각형 펄스 자극기, 그라스 Tlefactor, 웨스트 워릭,로드 아일랜드, 미국)이 설정됩니다.
- 1퍼센트 낮은 용융 점 아가로 오스의 배아, 잠그다이 배아를 마운트하려면 다음과 같이하십시오. 그런 다음 즉시 유리 피펫으로 아가로 오스의 배아를 제거합니다.
- 아가로 오스의 개별 방울에 거꾸로 플라스틱 페트리 접시의 뚜껑에있는 배아를 놓습니다. 아가로 오스 너무 forebrain은 전극과 microinjection 니들 (그림 1B) 모두에 액세스할 수 굳은 전에 등의 접속 위치로 광섬유 프로브와 함께 부드럽게 배아를 동쪽을 향하게하다. 배아는 개인 아가로 오스 방울에 마운트해야합니다.
- 왼쪽 micromanipulator로 전극을 조작. 그림 1B와 같이 아가로 오스에 전극을 삽입합니다. 사용자 플래티넘 이리듐 병렬 바이폴라 전극 직경 및 간격 500 μm의 125 μm의 간격은 electroporation (FHC, 카탈로그 # PBSA0575)에 사용됩니다.
- 붉은 유체의 흐르는 및 뇌실의 팽창 관찰 될 수 있듯이, forebrain의 뇌실에 microinjection 바늘을 삽입하고 4nl DNA 믹스를 주입.
- 바로 하나의 28.5 V 펄스 지속적인 1 밀리초는 수동으로 적용되었다. 다음 극성을 반대로 하나 이상 28.5 V 펄스 지속 1 밀리초를 적용합니다. 이것은 forebrain 신경 전구 세포의 양자 모자이크 라벨집니다.
- 10 배아의 electroporation 후 배아를 공개 microsurgical 나이프로 배아를 커버하고 아가로 오스 껍질에 5ml 배아 매체를 추가하십시오.
- 28.5에서 0.003 % PTU와 부화를 포함한 30 ML 배아 매체의 신선한 요리 ° C.에 electroporated 배아를 전송
4. 장착 및 시간 경과 라이브 영상
- epifluorescent 해부 현미경으로 볼 경우에는 electroporation 후 4시간 주변, EGFP 신호가 관찰됩니다.
- 다섯 시간 electroporation 후 높은 모자이크하지만 forebrain 지역에서 강한 EGFP 표현으로 배아를 선택합니다.
- 0.003 %의 PTU를 포함 10ml 배아 매체로 선택한 배아를 전송합니다.
- 10ml 배아 매체 t에 420 μl tricaine 주식 (4mg/ml)를 추가O는 배아를 마취.
- 배아를 탑재하기 위해 0.8 % 낮은 용융 점 아가로 오스 1 배아 젖어. 그런 다음 즉시 유리 피펫으로 아가로 오스의 배아를 제거하고 35mm 유리 바닥 문화 요리의 중심지 (MatTek 법인, 파트 # P35GC - 1.5-10 - C에 배아를 장소 www.glass - 하단 dishes.com ) .
- 아가로 오스는 굳은 전에 등의 접속 위치로 광섬유 프로브와 함께 부드럽게 배아를 동쪽을 향하게하다.
- 그림 1C (우리가 오른쪽 목표와 니콘 C1 스펙트럼 공촛점 현미경을 사용하여)에 같이 공촛점 현미경의 온도 조절 무대에서 제대로 요리를 놓습니다. 28.5로 온도를 조절 ° C.
- 3ml 28.5 추가 ° C 배아를 커버하는 PTU 0.003 %를 포함하는 preheated 배아 중간. 배아는 이제 이미지 준비가되었습니다.
- 물이 마른 목표를 사용하여 고정 간격으로 시간이 경과 라이브 영상을 수행합니다.
5. 대표 결과
그림 2에 표시된 22 HPF에서 EF1α - GFF + UAS - E1B - EGFP의 electroporated 배의 시간이 경과 공촛점 라이브 영상의 프레임을 선택하고 있습니다.
그림 1. 장치 셋업. (A) electroporation 설비의 조립 : 그라스 SD9 광장 펄스 자극기 (I), 왼쪽 micromanipulator (2), 전극 (3), 자이스 혈구가 현미경을 해부 (IV), 사출 바늘 (V)가, 오른쪽 micromanipulator (VI)과 Narishige IM 300 microinjector (VII). (B) 전극은 (i), forebrain 뇌실 (II) 및 사출 바늘 (3)의 상대 위치. 붉은 색의 DNA 솔루션 forebrain의 뇌실로 주입되어 있습니다. (C) 니콘 C1 공촛점 현미경에 살고 이미지의 조립 : 온도 컨트롤러 (I), 객관적인 렌 (2)와 유리 바닥 문화 요리 (3) (D에서 낮은 용해 지점 아가로 오스에 포함된 electroporated 배아 디핑 물 의 DNA microinjection에 뽑아 및 절단 바늘의) 이미지.
그림 2. 22 HPF에서 EF1α - GFF + UAS - E1B - EGFP와 electroporated 배아의 18 시간 시간이 경과 공촛점 라이브 이미지의 선택된 프레임. 뇌실의 표면은 각각의 이미지 프레임의 하단 측면에 있습니다. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다.
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Discussion
이 비디오에서는, 우리는 개발 zebrafish의 forebrain에서 clonal 수준에서 신경 전구 세포의 시간 경과 라이브 영상에 대한 방법을 보여줍니다. 우리는 유전자와 찬란 라벨 개별 신경 전구 세포에 테스트 기존의 electroporation 프로토콜에게 4-6을 수정했습니다. 단 몇 세포가 띄엄띄엄 electroporation의 상대적인 낮은 전압으로 표시 이후 clonally 관련 자손 세포로 구성된 혈통의 나무가 설정할 수 있습니다. EGFP뿐만 아니라, 신경 전구 세포 subcellularly 단순히 다른 형광 마커와 EGFP를 대체하여 다양한 형광 단백질이 표시하실 수 있습니다. EF1α - GFF는 UAS - E1B - memberane - EGFP와 UAS - E1B - H2B - mRFP 공동 electroporated있다면 핵은 적색 형광 단백질이 표시됩니다 반면 예를 들어, 각각의 전구 세포의 세포막은 녹색 형광 단백질이 표시됩니다. 라이브 영상 중에 관찰 electroporated 배아와 몇 apoptosis의 일반 정상적인 발달에 의해 입증으로 표시 전구 세포의 대부분은 건강입니다. 또한 배아를 탑재하고 세포가 건강하게 유지하는 공촛점 라이브 이미징하는 동안 최소한의 레이저 파워를 사용하는 아가로 오스의 낮은 농도를 사용하는 것이 중요합니다. 현재의 기술은 이러한 뒷다리 두뇌와 척수 등 중추 신경 시스템의 다른 부분에도 적용할 수 있습니다. DNA 구조가 electroporation에 대한 뇌실로 주입해야 때문에 그러나,이 기법은 18 HPF 미만의 배아에 적용할 수 없습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 theNIH grantNS042626에 의해 지원되었다. 우리는 커트 손 및 이미징과 함께 도움을 UCSF 니콘 이미징 센터를 주셔서 감사합니다.
References
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