Summary
現在のビデオは、開発ゼブラフィッシュの脳内の個々の神経前駆細胞のライブイメージングを実行するためのエレクトロポレーション、共焦点顕微鏡の組み合わせを活用する方法を示しています。
Abstract
神経前駆細胞の分裂、遊走や分化の正確なパターンは、適切な脳の発達と機能の1,2に不可欠です。 生体内環境における複雑な神経前駆細胞の挙動を理解するために、無傷の脳内の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージングは、批判的に必要となります。このビデオでは、我々はin vivoでの脳の神経前駆細胞の発達を視覚化するためにゼブラフィッシュ胚のユニークな機能を利用する。我々は遺伝的にとまばらに個々の神経前駆細胞を標識するためにエレクトロポレーションを使用してください。簡単に言えば、DNAは、蛍光マーカーのためのコーディング構造22時間後に受精の前脳の脳室に注入した（HPF）ゼブラフィッシュの胚と電気パルスは即座に配信されていました。 6時間後、エレクトロポレーションゼブラフィッシュの胚をガラス底の培養皿に低融点アガロースでマウントされた。蛍光標識した神経前駆細胞は、水浸対物レンズを用いて共焦点顕微鏡下で一定の間隔で36hoursのために画像化した。本方法は、前脳の神経前駆細胞のin vivoでの開発に洞察を得るために手段を提供し、ゼブラフィッシュの胚の中枢神経系の他の部分に適用することができます。
Protocol
1。ゼブラフィッシュ胚の調製
- エレクトロ二日前、女性とは別の男性にディバイダを使用して、野生型の魚の交尾ケージを設定。
- エレクトロポレーションの前にある日は、前日からケージを交配することで仕切りを引き出します。
- 胚を収集し、28.5で0.003％フェニルチオ尿素（PTU）を含む30ミリリットル胚培地℃で50受精胚をインキュベート
- エレクトロポレーションの日に、胚が22hpfの発達段階に達したときに微細な鉗子（イノックス5、デュモン電子、スイス）と手動で胚dechorionate。その後、0.003％のPTUを含む10ミリリットルエレクトロポリンガーの3（180 mMのNaCl、5mMのKClを、1.8 mMの塩化カルシウム、5mMのHepes緩衝液pH7.2）に胚を移す。
- 呼出音が胚を麻酔だ10mlのエレクトロポレーション、420μlのtricaine株式（4mg/ml）を追加します。
2。エレクトロポレーションのための準備
- ガラスの注射針は、フレーミング、ブラウンP897プラー（サッタインスツルメンツ、ノヴァト、カリフォルニア州、米国）で（1.2 mm外径、0.9mmのID、フィラメントを持つ）の毛細血管から引っ張られた。針の先端は、図1Dに示すように鋭い端を得るために鉗子で中断してしまった。先端の直径は10μm程度である必要があり、テーパー角度は30度前後となるはずです。
- エレクトロポレーションリンゲル溶液で0.8％、1％低融点アガロース（シェルトンサイエンティフィック社カタログ＃IB70050を）準備する。 2 mlのマイクロチューブに分注しアガロース溶液。 〜37℃でヒートブロックに分注しておく
- Gal4/UASシステムは、エレクトロポレーション胚の神経前駆細胞における遺伝子発現を駆動するために使用されます。二つのプラスミドが使用されています：プラスミドGal4FFがEF1αユビキタスプロモーターによって駆動されるEF1α- GFF - PT2KXIG、、そしてプラスミドUAS - E1B - EGFP - PT2KXIGを。
- EF1α- GFF - PT2KXIGとGenEluteTM HPプラスミドミディプレップキット（Sigma）を使用してUAS - E1B - EGFP - PT2KXIGプラスミドDNAを準備します。
- プラスミドを、10mMトリス· Clの1〜2μgの/μlの最終濃度（PH 8.5）に酢酸ナトリウム/エタノール沈殿により濃縮されています。
- 二つのプラスミドを混合し、各プラスミドに500 ng /μLの中の最終濃度にヌクレアーゼフリー水で希釈する。ソリューションへのフェノールレッドの加算は、（総容積1 / 10に希釈）配信の可視化に適しています。氷の上にDNA溶液を保管してください。
- 右2μlのDNA溶液とエレクトロポレーション、積み込む注射針の前に、2 NLへの注入量を調整する。
3。エレクトロポレーション
- steroの解剖顕微鏡（50倍の最大倍率を持つツァイスSTEMI 2000）、エア圧力インジェクター（ナリシゲIM 300インジェクター）、2つのマニピュレーター（WPI M3301R、世界の精密機器、サラソタ、フロリダ州、米国）、及び電気刺激（SD9図1Aに示すように方形パルス刺激、グラスTlefactor、ウエストワーウィック、ロードアイランド州、米国）が設定されています。
- 1％低融点アガロースで胚、浸漬2胚をマウントする。その後すぐにガラスピペットでアガロースから胚を削除します。
- アガロースの個々の滴で反転プラスチックシャーレの蓋に胚を置きます。アガロースは、脳が電極とマイクロインジェクションの針（図1B）の両方にアクセスできるように固化する前に、背アップ位置までファイバープローブで軽く胚を親しませる。胚は、個々のアガロースドロップにマウントされている必要があります。
- 左のマニピュレータで電極を操作する。図1Bに示すように、アガロースに電極を挿入します。カスタムプラチナイリジウムパラレルバイポーラ電極を直径と間隔が500μmで125μmのは、離れてエレクトロポレーション（FHC、カタログ＃PBSA0575）に使用されます。
- 前脳の脳室内にマイクロインジェクションの針を挿入し、赤い液体が流れると心室の腫脹が観察できるように、4nl DNAミックスを注入する。
- すぐに、一28.5 Vパルス持続的な1ミリ秒は手動で適用した。その後、極性を逆にし、複数28.5 Vパルス持続する1ミリ秒を適用します。これは、前脳の神経前駆細胞の二国間のモザイクのラベルになります。
- 10胚のエレクトロポレーション後、胚を解放するために顕微ナイフで胚とアガロース皮をカバーするために5ミリリットル胚培地を加える。
- 28.5で0.003パーセントPTUとインキュベートを含む30ミリリットル胚培地の新鮮な料理℃にエレクトロポレーション胚を転送する
4。マウントとコマ撮りライブイメージング
- 落射蛍光解剖顕微鏡下で観察した場合、エレクトロポレーション後4時間程度、EGFPのシグナルが観測される。
- エレクトロポレーションから5時間後の、非常にモザイクが前脳の領域に強いEGFPの発現と胚を選択する。
- 0.003％のPTUを含む10ミリリットル胚培地に選択された胚を移す。
- 10ミリリットル胚培地tに420μlのtricaine株式（4mg/ml）を追加Oは、胚を麻酔。
- 胚をマウントするには、0.8％低融点アガロースに1胚を浸す。その後すぐにガラスピペットでアガロースから胚を削除と35mmガラスボトムディッシュ（マテック株式会社、部品番号P35GC - 1.5 - 10 - C、の中心に胚を置くwww.glass -ボトムdishes.com ） 。
- アガロースが固まる前に背アップ位置までファイバープローブで軽く胚を親しませる。
- 図1C（我々は上右の目標とニコンC1スペクトル共焦点顕微鏡を使用）に示すように共焦点顕微鏡の温度制御されたステージ上で適切に皿を置きます。 28.5温度を調整して℃に
- 3ミリリットル28.5 °の胚をカバーするためにPTU 0.003％含むC予熱胚培地を追加。胚は、現在のイメージングのための準備ができています。
- 水浸対物レンズを用いて一定の間隔でタイムラプスライブイメージングを実行します。
5。代表的な結果
図2に示すように22 HPFでEF1α- GFF + UAS - E1B - EGFPのエレクトロ胚のタイムラプス共焦点ライブイメージングのフレームが選択されています。
図1の装置において、設定する。エレクトロポレーション装置の（A）組立：グラスSD9方形パルス刺激（i）を、左のマニピュレータ（II）、電極（III）、ツァイス解剖顕微鏡（IV）、注射針（V）、右のマニピュレータ（VI）とナリシゲIM 300マイクロインジェクター（VII）。 （B）の電極（i）は、前脳脳室（II）及び注射針（iii）の相対位置。赤い色のDNA溶液が前脳の脳室に注入されています注意してください。 （C）ニコンC1共焦点顕微鏡でライブイメージングのアセンブリ：温度調節器（i）は、客観LEN（II）とガラスの底の培養皿（ⅲ）（Dの低融点アガロースに埋め込まれているエレクトロポレーション胚を浸漬する水DNAのマイクロインジェクションのためのプルアップとカット針の）イメージ。
図2。22 HPFでEF1α- GFF + UAS - E1B - EGFPとエレクトロ胚の18時間のタイムラプス共焦点ライブイメージングの選択されたフレーム。心室の表面には、各画像フレームの底面側にあります。スケールバーは10μmを表す。
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Discussion
このビデオでは、我々は開発ゼブラフィッシュの脳のクローンレベルでの神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージングのための方法を示しています。我々はテストされ、既存のエレクトロポレーションプロトコル4-6遺伝的および蛍光個々の神経前駆細胞を標識するように変更。少数の細胞がまばらにエレクトロポレーションの相対的な低電圧で標識されて以来、クローン的に関連する子孫細胞で構成される系統樹を確立することができます。 EGFPに加えて、神経前駆細胞は、subcellularly単に他の蛍光マーカーでEGFPを置き換えることにより、種々の蛍光タンパク質で標識することができます。核が赤色蛍光タンパク質で標識される一方で例えば、EF1α- GFFがUAS - E1B - memberane - EGFPとUAS - E1B - H2B - MRFPと共同エレクトロされている場合、個々の前駆細胞の膜は、緑色蛍光タンパク質で標識されます。ライブイメージング中に観察されたエレクトロ胚といくつかのアポトーシスの一般的な正常な発達により明らかなように標識した前駆細胞のほとんどは健康です。また、胚をマウントし、細胞の健康を保つために共焦点ライブイメージング中に最小限のレーザパワーを使用するためにアガロースの低濃度を使用することが重要です。本技術は、後肢の脳や脊髄などの中枢神経系の他の部分にも適用できます。 DNA構築物をエレクトロポレーションのための心室に注入しなければならないしかし、この手法は、18 HPF未満の胚に適用することはできません。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作業はtheNIH grantNS042626によってサポートされていました。我々は、クルトソーンとイメージングの支援のためのUCSFニコンイメージングセンターに感謝します。
References
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