Lapso de tempo de imagens ao vivo de relação clonal células progenitoras neurais no desenvolvimento Zebrafish Encéfalo anterior

Summary

O vídeo atual demonstra um método que tira proveito da combinação de eletroporação e microscopia confocal para realizar imagens ao vivo em células individuais progenitoras neurais no cérebro anterior zebrafish em desenvolvimento.

Abstract

Padrões precisos de migração, divisão e diferenciação das células progenitoras neurais são cruciais para o desenvolvimento adequado do cérebro e ^1,2 função. Para entender o comportamento das células progenitoras neurais no complexo no ambiente vivo, lapso de tempo imagens ao vivo de células progenitoras neurais em um cérebro intacto é extremamente necessário. Neste vídeo, nós explorar as características únicas de embriões zebrafish para visualizar o desenvolvimento de células progenitoras neurais prosencéfalo in vivo. Usamos a eletroporação geneticamente e pouco etiqueta individual células progenitoras neurais. Resumidamente, o DNA construções de codificação para marcadores fluorescentes foram injetados no ventrículo do cérebro anterior de 22 horas após a fertilização (hpf) embriões zebrafish e pulsos elétricos foram entregues imediatamente. Seis horas depois, os embriões do zebrafish electroporated foram montadas com baixo ponto de fusão de agarose em placas de cultura de vidro de fundo. Fluorescente etiquetado células progenitoras neurais foram então fotografada por 36 horas com intervalos fixos sob um microscópio confocal utilizando água lente objetiva de imersão. O presente método fornece uma maneira de obter insights sobre o desenvolvimento in vivo de células progenitoras neurais do cérebro anterior e pode ser aplicado a outras partes do sistema nervoso central do embrião zebrafish.

Protocol

1. Preparação de Embriões Zebrafish

1. Dois dias antes da eletroporação, criada gaiolas de acasalamento de peixes do tipo selvagem usando divisores para os machos separados das fêmeas.
2. Um dia antes da eletroporação, puxe os divisores em gaiolas de acasalamento do dia anterior.
3. Coletar embriões e incubar 50 embriões fertilizados em 30 ml de meio embrionárias contendo phenylthiourea 0,003% (PTU) a 28,5 ° C.
4. No dia da eletroporação, dechorionate os embriões manualmente com uma pinça fina (Inox 5, Dumont Eletrônico, Suíça), quando os embriões atingem o estágio de desenvolvimento de 22hpf. Em seguida, transferir os embriões para ³ eletroporação 10ml de Ringer (180 mM NaCl, KCl 5mM, 1,8 mM CaCl2, 5 mM Hepes pH 7,2) contendo 0,003% PTU.
5. Adicionar 420 mL tricaina ações (4mg/ml) para o eletroporação 10ml de Ringer para anestesiar os embriões.

2. Preparação para Eletroporação

1. Agulhas de injeção de vidro foram arrancados de capilares (1,2 mm de diâmetro externo, 0,9 mm de diâmetro, com filamento) em um Flaming-Brown P897 extrator (Sutter Instruments, Novato, CA, EUA). A ponta da agulha foi interrompido com uma pinça para obter uma ponta afiada, como mostrado na figura 1D. O diâmetro da ponta deve ser em torno de 10 mm e do ângulo do cone deve ser em torno de 30 graus.
2. Prepare 0,8% e 1% de baixo ponto de fusão de agarose (Shelton Scientific, Inc. catalogo IB70050) em solução de Ringer eletroporação. Alíquota da solução de agarose em 2 tubos de microcentrífuga ml. Manter as alíquotas em um bloco de calor em ~ 37 ° C.
3. O sistema Gal4/UAS é usada para acionar a expressão do gene em células progenitoras neurais de embriões electroporated. Dois plasmídeos são usados: plasmídeo EF1α-GFF-PT2KXIG, em que Gal4FF é impulsionado pela EF1α promotor onipresente, e plasmídeo UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG.
4. Prepare-EF1α GFF-PT2KXIG e UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG DNA plasmídeo usando GenEluteTM HP Plasmid Midiprep Kit (Sigma).
5. Os plasmídeos são então concentrada por precipitação de acetato de sódio / etanol para a concentração final de 1-2 mcg / mL em 10 mM Tris · Cl (pH 8,5).
6. Misturar os dois plasmídeos e diluir com nuclease-free H2O para uma concentração final de 500 ng / mL para cada plasmídeo. Além do vermelho de fenol (diluído 1 / 10 do volume total) para a solução é a preferida para a visualização de entrega. Manter a solução de DNA em gelo.
7. Direito antes de agulha eletroporação, protelar a injeção com 2 mL de solução de DNA e ajustar o volume de injecção a 2 nl.

3. Eletroporação

1. Um microscópio de dissecção stero (Zeiss Stemi 2000, com uma ampliação máxima de 50x), um injector de pressão de ar (300 microinjetor Narishige IM), duas micromanipuladores (WPI M3301R, instrumentos de precisão Mundial, Sarasota, FL, EUA), e um estimulador elétrico (SD9 quadrados de pulso estimulador, Grass Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, EUA) são configurados como mostrado na Figura 1A.
2. Para montar os embriões, mergulhe dois embriões em 1% de baixo ponto de fusão de agarose. Em seguida, retire imediatamente a embriões a partir da agarose com uma pipeta de vidro.
3. Coloque os embriões em uma tampa de plástico prato Petri invertida em gotas individuais de agarose. Orientar os embriões delicadamente com uma sonda de fibra para uma posição dorsal-up antes da agarose, para que se solidifica no prosencéfalo é acessível para ambos os eletrodos ea agulha microinjeção (Figura 1B). Embriões devem ser montados em cada agarose gotas.
4. Manipular os eletrodos com o micromanipulador esquerda. Os eléctrodos no agarose como mostrado na Figura 1B. Personalizado platina iridium eletrodo bipolar paralelo 125 m de diâmetro e 500 mm espaçados separados são usados ​​para eletroporação (FHC, catalogo PBSA0575).
5. Inserir a agulha microinjeção no ventrículo prosencéfalo e injetar DNA mix 4NL, como fluxo de fluido vermelho eo inchaço do ventrículo podem ser observados.
6. Imediatamente, um pulso de 28,5 V com duração de 1 milissegundo foi aplicado manualmente. Em seguida, inverter a polaridade e aplicar mais um pulso de 28,5 V com duração de 1 milisegundo. Isso resultará em mosaic rotulagem bilateral do cérebro anterior células progenitoras neurais.
7. Após a eletroporação de 10 embriões, adicione meio embrionárias 5ml para cobrir os embriões e descascar a agarose com uma faca de microcirurgia para liberar os embriões.
8. Transferir os embriões electroporated a um prato fresco de 30 ml de meio embrionárias contendo 0,003% PTU e incubar a 28,5 ° C.

4. Montagem e Time-lapse de imagens ao vivo

1. Em torno de 4 horas após a eletroporação, o sinal de EGFP é observável se visto sob um microscópio de epifluorescência dissecação.
2. Cinco horas após eletroporação, selecione os embriões com mosaico altamente mas a expressão EGFP forte na região do prosencéfalo.
3. Transferir os embriões selecionados para 10ml médio embrionárias contendo PTU 0,003%.
4. Adicionar 420 mL tricaina ações (4mg/ml) ao embrionárias 10ml médio to anestesiar os embriões.
5. Para montar os embriões, mergulhe um embrião em 0,8% baixo ponto de fusão de agarose. Em seguida, retire imediatamente o embrião da agarose com uma pipeta de vidro e colocar o embrião no centro de um prato de cultura 35 milímetros de vidro de fundo (Mattek corporação, Part # P35GC-1.5-10-C, www.glass bottom-dishes.com ) .
6. Orientar os embriões delicadamente com uma sonda de fibra para uma posição dorsal-up antes da agarose solidifica.
7. Coloque o prato de forma adequada no palco temperatura controlada de um microscópio confocal, como mostrado na figura 1C (Nós usamos um microscópio Nikon C1 espectral confocal com up-direita objetivos). Ajustar a temperatura para 28,5 ° C.
8. Adicionar 3ml 28,5 ° C médio pré-aquecido embrionárias contendo 0,003% PTU para cobrir o embrião. O embrião está pronto para geração de imagens.
9. Executar lapso de tempo imagens ao vivo com um intervalo fixo utilizando objetiva de imersão de água.

5. Resultados representante

Mostrado na Figura 2 são selecionados quadros de um lapso de tempo de imagem confocal ao vivo do embrião electroporated de EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP aos 22 hpf.

Figura 1. Aparelho set-up. (A) O conjunto de equipamentos de eletroporação: the Grass SD9 quadrados de pulso estimulador (i), o micromanipulador esquerda (ii), os eletrodos (iii), o microscópio Zeiss dissecar (iv), a agulha de injeção (v), micromanipulador o direito (vi) eo Narishige IM 300 microinjetor (vii). (B) A posição relativa dos eletrodos (i), o ventrículo prosencéfalo (ii) ea agulha de injeção (iii). Observe a solução DNA de cor vermelha foi injetado no ventrículo prosencéfalo. (C) A montagem de imagens ao vivo em microscópio Nikon C1 confocal: o controlador de temperatura (i), a água molhando objetivo len (ii) eo embrião electroporated embutido no baixo ponto de fusão de agarose em um prato fundo de vidro cultura (iii) (D ) Imagem de uma agulha puxado e corte para microinjeção de DNA.

Figura 2. Quadros selecionados de um de 18 horas de lapso de tempo de imagem confocal ao vivo do embrião electroporated com EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP aos 22 hpf. Superfície do ventrículo está no lado inferior de cada quadro de imagem. Barra de escala representa 10 mM.

Discussion

Neste vídeo, demonstramos um método para time-lapse imagens ao vivo de células progenitoras neurais em um nível clonal no prosencéfalo zebrafish em desenvolvimento. Nós testamos e modificou o eletroporação protocolos existentes para ^4-6 geneticamente e fluorescente etiqueta individual células progenitoras neurais. Uma árvore de linhagem clonal composto de células descendentes relacionados pode ser estabelecida uma vez que apenas algumas células eram escassamente rotulados com uma tensão relativamente baixa de eletroporação. Além de EGFP, as células progenitoras neurais podem ser rotulados com subcellularly várias proteínas fluorescentes simplesmente substituindo EGFP com outros marcadores fluorescentes. Por exemplo, se EF1α-GFF foi co-electroporated com UAS-E1B-memberane-EGFP e UAS-E1B-H2B-MRFP, membranas de células progenitoras individual será marcada com a proteína verde fluorescente, enquanto núcleo será marcado com uma proteína fluorescente vermelha. A maioria das células progenitoras são saudáveis ​​rotulados como evidenciado pelo desenvolvimento geral normais dos embriões electroporated e apoptose poucos observados durante imagens ao vivo. Também é fundamental usar uma baixa concentração de agarose para montar o embrião e usar um mínimo de potência do laser durante a imagens ao vivo confocal para manter as células saudáveis. A presente técnica também pode ser aplicado a outras partes do sistema nervoso central, como o cérebro traseiras e da medula espinhal. No entanto, esta técnica não pode ser aplicado em embriões com menos de 18 hpf, uma vez que as construções de DNA têm de ser injetado no ventrículo para eletroporação.