Uitgangspunten voor zuivering met behulp van superkritische vloeistof chromatografie - ADVERTENTIE

Summary

Uitgangspunten voor de scheiding van stoffen uit mengsels met behulp van superkritische vloeistof chromatografie (SFC) is vergelijkbaar met de fundamenten van preparatieve vloeistofchromatografie.

Abstract

Hoewel de superkritische vloeistof chromatografie (SFC) is geen nieuwe techniek, is het voorbereidende SFC steeds meer populair met de vooruitgang in apparatuur, software en chemie. Uitgangspunten voor het isoleren van verbindingen met SFC zijn vergelijkbaar met de fundamentele regels voor grootschalige preparatieve vloeistofchromatografie. In deze studie, illustreren we het effect van debiet, monster oplossen oplosmiddel, en kolom selectiviteit op de isolatie van de verbindingen uit een mengsel. Kolommen die zijn gevuld met Optimum Bed Density (OBD)-technologie ¹ en met bijpassende chemie zorgen voor een gemakkelijke en voorspelbare schaalbaarheid van de kleine schaal om grotere preparatieve scheidingen.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

• Compound mengsel 1: Cumarine, Ibuprofen, en carbamazepine, 20 mg / ml elk op methanol
• Compound Mengsel 2: Ibuprofen en carbamazepine, 20 mg / ml elk op methanol
• Compound Mengsel 3: Ibuprofen en carbamazepine, 20 mg / ml elk in DMSO (dimethyl sulfoxide)
• Compound Mengsel 4: 10 mg / ml Fenoprofen, 15 mg / ml Ketoprofen, 20 mg / ml flavone, 20 mg / ml Ibuprofen, en 20 mg / ml Cumarine in methanol

2. Experimentele condities

1. Analytische chromatografie werd uitgevoerd op een Waters methode Station SFC-systeem.
   Column: Viridis SFC 2-Ethylpyridine kolom 5 micrometer, 4,6 x 150 mm, Part Number 186004937.
2. Preparatieve chromatografie werd uitgevoerd op een Waters Prep 100 SFC UV-Directed System. De kolommen:
   • Viridis SFC 2-Ethylpyridine OBD kolom, 5 micrometer, 19 x 150 mm, Part Number 186004945
   • Viridis SFC Silica OBD-kolom, 5 micrometer, 19 x 150 mm, Part Number 186004918
   • Viridis SFC 2-Ethylpyridine OBD kolom, 5 micrometer, 19 x 100 mm, Part Number 186004944
3. Andere methode Parameters:
   • Column Temperatuur: 40 ° C
   • Cosolvent: Methanol
   • Het geïnjecteerde volume, debiet en verlopen: Gerapporteerde in cijfers

3. Representatieve resultaten

Flow Rate

Het debiet gebruikt in de voorbereidende LC scheidingen wordt beperkt door een aantal factoren, waaronder de lengte en diameter van de kolom, de deeltjesgrootte, en het systeem tegendruk. Een lage viscositeit kooldioxide, het belangrijkste onderdeel van de mobiele fase in SFC, maakt het gebruik van hogere debieten dan die over het algemeen gebruikt in de vloeistofchromatografie. De tegendruk in verband met de kolom lengte is ook lager, waardoor het gebruik van meer kolommen de resolutie te verhogen. Hogere debieten de doorvoer verhogen door het verminderen van de hoeveelheid tijd om een ​​scheiding af te ronden. Zoals weergegeven in figuur 1, de chromatografische profiel is hetzelfde bij verschillende debieten voorzien dat de helling van het verloop, uitgedrukt in percentage verandering per kolom het volume constant blijft .. Dit wordt bereikt door het verminderen van de uitvoering in dezelfde verhouding als het debiet wordt verhoogd.

Voorbeeld Ontbinding en laden Solvent

Isoleren van stoffen uit mengsels vereist dat het monster volledig oplosbaar voor injectie. Methanol, de meest voorkomende co-oplosmiddel in SFC, niet alle monsters oplosbaar bij de hoge concentraties meestal nodig voor typische preparatieve scheidingen. Grote hoeveelheden van oplosmiddelen, zoals methanol kunnen beperken de massa capaciteit van de kolom als gevolg van sterke solvent effecten die de chromatografie kunnen verstoren. Modifier stroom injectie, de standaard configuratie van alle gepatenteerde Waters prep SFC-systemen, is ontworpen om dit oplosmiddel effect te verminderen. Dimethylsulfoxide (DMSO) wordt regelmatig gebruikt in de zuivering laboratoria voor verschillende types van verbindingen lossen. Figuren 2 en 3 laten zien hoe DMSO injecties in SFC kan resulteren in een hogere belasting en een betere resolutie voor achiraal toepassingen in vergelijking met monsters geïnjecteerd in methanol.

Let op: voor chirale applicaties, voorzichtigheid dient te worden beschouwd als DMSO ernstig kan een traditionele coating chirale stationaire fase schade. Als DMSO moeten worden verplicht voor het monster oplosbaarheid, moet een geïmmobiliseerd chirale kolom worden geselecteerd.

Selectiviteit

In SFC, worden meerdere kolommen routinematig getest om te bepalen welke levert de beste resolutie en de maximale vorm voor componenten in een mengsel. Goede resolutie tussen de verbindingen leidt tot isolaties van target verbindingen met een hoge zuiverheid. In het onderstaande voorbeeld, de 2-ethylpyridine kolom ziet u een uitstekende scheiding van alle vijf verbindingen in het monster mengsel. Hetzelfde monster mengsel geanalyseerd op een silica kolom toont slechts drie componenten pieken want het heeft een andere selectiviteit. Cumarine en ibuprofen coelute op ongeveer 0,8 minuut en flavone en fenoprofen coelute iets later. Flavone en ibuprofen ook veranderen elutievolgorde op het silica kolom. Ketoprofen is goed gescheiden van alle andere toppen op beide kolommen.

Schalen

Ruwe sample mengsels worden meestal geanalyseerd met een verloop dat screening gaat uit van een laag percentage organisch oplosmiddel en eindigt bij een hoger percentage organisch oplosmiddel in een relatief korte tijd. Als de verbindingen van belang zijn goed opgelost, kan de gradiënt direct worden geschaald voor zuivering. Wanneer alle verbindingen elueren voor ee voltooiing van de gradiënt en zijn volledig opgelost, een eenvoudige vermindering van de lengte van het verloop is acceptabel. De snelle debiet gebruikt in SFC in combinatie met aangepaste hellingen aanzienlijk verkorten de totale tijd die nodig is voor het zuiveren van doelverbindingen.

Scaling scheidingen vereist bijpassende kolom chemie en de deeltjesgrootte en de juiste schaal injectie volumes en hellingen. Waters preparatieve SFC kolommen zijn gevuld met OBD-technologie, waardoor een uitstekende bed stabiliteit en vergelijkbare prestaties te Waters analytische SFC kolommen. OBD preparatieve kolommen zijn verpakt dichtheden die nauw overeenkomen met het equivalent analytische kolom bed. Deze innovatieve procedure levert preparatieve kolommen met een uitstekende stabiliteit, reproduceerbaarheid en efficiëntie.

Een laad-studie is uitgevoerd op de kleine schaal om te bepalen hoeveel massa van het monster kan worden geladen op de kolom. Het doel is om de belasting te maximaliseren zonder afbreuk te doen aan de resolutie. Verbeterde piek resolutie leidt tot hogere belastingen en een betere zuiverheid voor geïsoleerde verbindingen. Hogere kolom laden vermindert het aantal runs nodig is voor het verkrijgen van voldoende materiaal voor verdere experimenten. De chromatografie van de laad-studie is weergegeven in figuur 5. De conservatieve 35 pi injectie volume geeft een goede resolutie tussen alle van de verbindingen in het mengsel en wordt vervolgens geschaald voor de voorbereidende werken op de grote kolom. Een totaal volume van 600 ul werd geïnjecteerd op de 19 x 150 mm preparatieve SFC kolom. Figuur 6 vergelijkt de chromatografie met behulp van de kleine schaal gewijzigde helling bij maximale belasting met de grootschalige chromatografie gebruikt voor de isolatie. De selectiviteit is identiek, een kritische factor bij het gebruik van analytische chromatografie als scouting tool voor isolatie en purification.The verschillen in retentietijd en resolutie tussen de analytische en preparatieve chromatogrammen kan worden toegeschreven aan factoren, zoals het systeem het volume en injectie-modus. In het bijzonder, is de gepatenteerde modifier stroom injectie-modus * ingezet voor alle wateren voorbereidende SFC-systemen, het minimaliseren van het oplosmiddel effect en dus het verbeteren van de doorvoer en efficiëntie.
* US Patent # 6576125

Discussion

• De basisprincipes van vloeistofchromatografie kan worden toegepast op superkritische vloeistof chromatografie (SFC).
• Superkritische vloeistof chromatografie kan worden uitgevoerd met een verhoogd debiet maken van isolaties sneller en steeds meer doorzet.
• Monsters met een beperkte oplosbaarheid kan worden opgelost in dimethylsulfoxide en gezuiverd met behulp van SFC. Het gebruik van DMSO voor sample ontbinding maakt het zuiveringsproces gemakkelijker door het verminderen van de onzekerheid in verband met het monster oplosbaarheid.
• Resolutie en het laden van de monsters opgelost in DMSO kan worden verbeterd in vergelijking met dezelfde monsters opgelost in methanol. Beter sample resolutie leidt tot producten met een hogere zuiverheid. Hogere belasting verbetert de efficiëntie van het zuiveringsproces.
• Column selectiviteit invloed op de scheiding van het mengsel componenten. Screening verschillende kolommen met een snelle gradiënten leidt tot een beslissing over welke preparatieve kolom te gebruiken voor het isoleren van de verbindingen in het monster.
• De mogelijkheid op te schalen tussen de analytische en preparatieve OBD kolommen leidt tot identieke scheidingen op zowel kleine als grote schaal, op voorwaarde dat de geïnjecteerde volume, de helling, en de gradiënt tijd correct worden geschaald en de chemie en de deeltjesgrootte constant blijven. Column schaalbaarheid verwijdert onzekerheid in piek identificatie, waardoor het gemakkelijker een hogere zuiveringsproces efficiency.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Method Station SFC System	Waters	More information available at www.waters.com	Analytical SFC system
SFC-UV Prep 100	Waters	More information available at www.waters.com	Preparative SFC System
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column	Waters	186004937	Analytical SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column	Waters	186004945	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column	Waters	186004918	Preparative SFC Chromatography Column
Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column	Waters	186004944	Preparative SFC Chromatography Column