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Summary
Grundlagen für die Trennung von Verbindungen aus Mischungen mit Chromatographie mit überkritischen Fluiden (SFC) sind vergleichbar mit den Grundlagen der präparativen HPLC.
Abstract
Obwohl Chromatographie mit überkritischen Fluiden (SFC) ist keine neue Technik wird präparativen SFC immer beliebter mit den Fortschritten in der Messtechnik, Software und Chemie. Grundlagen für die Isolierung von Verbindungen mit SFC sind ähnlich wie die grundlegenden Regeln für große präparative Flüssigchromatographie. In dieser Studie zeigen wir die Wirkung von Durchfluss, Probe Auflösung Lösungsmittel und die Selektivität auf die Isolierung von Verbindungen aus einer Mischung. Spalten mit Optimum Bed Density (OBD)-Technologie 1 und mit passenden Chemie verpackt sorgen für eine einfache und vorhersehbare Skalierbarkeit vom kleinen auf größere präparative Trennungen.
Protocol
1. Probenvorbereitung
- Compound Mischung 1: Cumarin, Ibuprofen und Carbamazepin; 20 mg / mL in Methanol
- Compound Mischung 2: Ibuprofen und Carbamazepin; 20 mg / mL in Methanol
- Compound Mischung 3: Ibuprofen und Carbamazepin; 20 mg / mL in DMSO (Dimethylsulfoxid)
- Compound Mischung 4: 10 mg / mL Fenoprofen, 15 mg / mL Ketoprofen, 20 mg / mL Flavone, 20 mg / mL Ibuprofen und 20 mg / mL Cumarin in Methanol
2. Experimentelle Bedingungen
- Analytische Chromatographie wurde auf einer Waters Methode Bahnhof SFC-System durchgeführt.
Kolumne: Viridis SFC 2-Ethylpyridin Spalte 5 um, 4,6 x 150 mm, Teilenummer 186004937. - Präparative Chromatographie wurde auf einer Waters Prep 100 SFC UV gerichtetes System durchgeführt. Die Spalten:
- Viridis SFC 2-Ethylpyridin OBD Spalte 5 um, 19 x 150 mm, Teilenummer 186004945
- Viridis SFC Silica OBD Spalte 5 um, 19 x 150 mm, Teilenummer 186004918
- Viridis SFC 2-Ethylpyridin OBD Spalte 5 um, 19 x 100 mm, Teilenummer 186004944
- Andere Methode Parameter:
- Column Temperatur: 40 ° C
- Cosolvens: Methanol
- Injektionsvolumen, Durchfluss und Farbverläufe: in ausgewiesenen Zahlen
3. Repräsentative Ergebnisse
Durchfluss
Der Durchfluss in der präparativen LC-Trennungen eingesetzt wird durch eine Reihe von Faktoren, einschließlich der Länge und der Durchmesser der Säule, die Partikelgröße und das System Gegendruck begrenzt. Niedrige Viskosität von Kohlendioxid, dem Hauptbestandteil der mobilen Phase in SFC ermöglicht die Verwendung von höheren Flussraten als die in der Regel in der Flüssigchromatographie verwendet. Der Gegendruck mit Säulenlänge verknüpft ist ebenfalls geringer, so dass Nutzung von mehr Spalten, um die Auflösung zu erhöhen. Höhere Fließgeschwindigkeiten den Durchsatz zu erhöhen, indem die Menge an Zeit, um eine Trennung zu vervollständigen. Wie in Abbildung 1 gezeigt, ist das chromatographische Profil der gleichen bei verschiedenen Flussraten vorgesehen, dass die Steigung des Gradienten in Prozent Veränderung pro Säulenvolumen ausgedrückt konstant bleibt .. Dies ist durch eine Verringerung der Laufzeit im gleichen Verhältnis wie die Durchflussmenge erhöht durchgeführt. 
Beispiel Auflösung und Loading Solvent
Isolating Verbindungen aus Gemischen erfordert, dass die Probe vollständig löslich vor der Injektion werden. Methanol ist die häufigste Co-Lösungsmittel in SFC nicht lösen alle Proben, die bei den hohen Konzentrationen in der Regel erforderlich für typische präparative Trennungen. Große Mengen von Lösungsmitteln wie Methanol kann begrenzen die Masse der Säule aufgrund der starken Lösungsmittel bewirkt, dass die Chromatographie verzerren können. Modifier stream Injektion, die Standard-patentierte Konfiguration aller Waters prep SFC-Systeme, wurde entwickelt, um dieses Lösungsmittel-Effekt zu reduzieren. Dimethylsulfoxid (DMSO) wird regelmäßig in der Reinigung Labors verwendet werden, um viele verschiedene Arten von Verbindungen zu lösen. Abbildungen 2 und 3 zeigen, wie DMSO-Injektionen in AS können in höhere Belastung und bessere Auflösung für achirale Anwendungen führen, wie die Proben in Methanol injiziert verglichen.
Hinweis: Bei chiralen Anwendungen, Vorsicht in Betracht gezogen, wie DMSO erheblich beeinträchtigen können, ein traditionelles beschichtet chiraler stationärer Phase. Wenn DMSO für die Probenvorbereitung Löslichkeit erforderlich sein sollte, sollte einem immobilisierten chiralen Säule gewählt werden. 
Selektivität
In SFC, sind mehrere Spalten routinemäßig getestet, welche bietet die beste Auflösung und Peakform für Komponenten in einer Mischung. Gute Auflösung zwischen Verbindungen führt zu Isolierungen von Zielverbindungen mit hoher Reinheit. In dem folgenden Beispiel zeigt die 2-Ethylpyridin Spalte ausgezeichnete Trennung aller fünf Verbindungen in der Probe Mischung. Die gleiche Probe Mischung auf eine Silica-Säule analysiert zeigt nur drei Komponenten Gipfel, weil es eine unterschiedliche Selektivität hat. Cumarin und Ibuprofen koeluieren bei etwa 0,8 Minuten und Flavon und Fenoprofen koeluieren etwas später. Flavone und Ibuprofen auch ändern Elutionsreihenfolge auf der Silica-Säule. Ketoprofen ist von allen anderen Gipfeln auf beiden Säulen gut getrennt. 
Scaling
Crude Probe Gemische sind in der Regel mit einem Screening-Gradienten, die von einem geringen Anteil an organischen Lösungsmittel beginnt und endet an einem höheren Anteil an organischem Lösungsmittel in relativ kurzer Zeit analysiert. Wenn die Verbindungen von Interesse sind gut gelöst, kann die Steigung direkt für die Reinigung skaliert werden. Wenn alle Verbindungen eluieren vor the Abschluss der Steigung und sind vollständig geklärt, eine einfache Reduzierung der Länge des Gradienten ist akzeptabel. Die schnelle Flussraten in SFC verwendet mit modifizierten Gradienten kombiniert erheblich verkürzen die gesamte Zeit für die Reinigung von Zielverbindungen erforderlich.
Scaling Trennungen erfordert entsprechende Spalte Chemie und Partikelgröße sowie entsprechend skaliert Injektionsvolumina und Farbverläufe. Waters präparativen SFC-Säulen sind mit OBD-Technologie verpackt, wodurch hervorragende Bett Stabilität und eine vergleichbare Leistung zu Waters analytische SFC-Säulen. OBD präparativen Säulen sind gepackt, um Dichten, die eng an die entsprechenden analytischen Säule Bett. Dieses innovative Verfahren produziert präparativen Säulen mit ausgezeichneter Stabilität, Reproduzierbarkeit und Effizienz.
Eine Be-Studie wird an den kleinen Maßstab durchgeführt, um festzustellen, wie viel Masse der Probe auf die Säule geladen werden kann. Das Ziel ist, die Last, ohne die Auflösung zu maximieren. Verbesserte Peak-Auflösung führt zu höheren Belastungen und besseren Reinheit für isolierte Verbindungen. Höhere Spalte Laden reduziert die Anzahl der Durchläufe für den Erhalt von genügend Material für spätere Experimente erforderlich. Die Chromatographie von der Be-Studie ist in Abbildung 5 dargestellt. Die konservative 35 ul Injektionsvolumen zeigt eine gute Auflösung zwischen all der Verbindungen in der Mischung und anschließend für den präparativen Run auf die große Spalte skaliert. Ein Gesamtvolumen von 600 ul wurde auf der 19 x 150 mm präparativen SFC-Säule injiziert. Abbildung 6 vergleicht die Chromatographie mit dem kleinen Maßstab modifiziert Gradienten bei maximaler Belastung mit dem großen Chromatographie zur Isolierung verwendet. Die Selektivität ist identisch, ein kritischer Faktor bei der Verwendung analytische Chromatographie als Scouting-Tool für die Isolierung und purification.The Unterschiede in Retentionszeit und Auflösung zwischen der analytischen und präparativen Chromatogramme können Faktoren wie Lautstärke des Systems und Injection-Modus zugeschrieben werden. Insbesondere ist die patentierte modifier Stream Injektion Modus * für alle Waters präparativen SFC-Systeme eingesetzt, die Minimierung der Lösungsmittel-Effekt und damit die Verbesserung von Durchsatz und Effizienz.
* US-Patent Nr. 6.576.125 
Discussion
- Die Grundprinzipien der Flüssigchromatographie kann Chromatographie mit überkritischen Fluiden (SFC) angewendet werden.
- Chromatographie mit überkritischen Fluiden kann bei erhöhten Flussraten machen Isolierungen schneller und erhöhen den Durchsatz gefahren werden.
- Proben mit begrenzter Löslichkeit in Dimethylsulfoxid gelöst und gereinigt werden mit SFC. Mit DMSO für die Probenvorbereitung Auflösung macht den Reinigungsprozess einfacher durch eine Verringerung der Unsicherheit, die mit Probe Löslichkeit verbunden.
- Auflösung und das Laden von Proben in DMSO gelösten verbessert werden, wenn die gleichen Proben in Methanol gelöst verglichen werden. Bessere Sample-Auflösung führt zu Produkten mit höherer Reinheit. Höhere Belastung verbessert die Effizienz des Reinigungsprozesses.
- Column Selektivität Auswirkungen der Trennung von Mischungskomponenten. Screening verschiedene Spalten mit schnellen Gradienten führt zu einer Entscheidung über die präparative Säule zur Isolierung der Verbindungen in der Probe zu benutzen.
- Die Fähigkeit, zwischen analytischen und präparativen Säulen OBD Skala führt zu identischen Trennungen bei den kleinen und großen Skalen, vorausgesetzt, dass das Injektionsvolumen, Neigung und Gefälle Uhrzeit korrekt sind, und skaliert die Chemie und die Partikelgröße konstant bleiben. Column Skalierbarkeit beseitigt Unsicherheit in Peak-Identifikation und erleichtert so höher Reinigung Prozesseffizienz.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Method Station SFC System | Waters | More information available at www.waters.com | Analytical SFC system |
| SFC-UV Prep 100 | Waters | More information available at www.waters.com | Preparative SFC System |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine, 4.6 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004937 | Analytical SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004945 | Preparative SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC Silica OBD™, 19 x 150 mm, 5 μm Column | Waters | 186004918 | Preparative SFC Chromatography Column |
| Viridis™ SFC 2-Ethylpyridine OBD™, 19 x 100 mm, 5 μm Column | Waters | 186004944 | Preparative SFC Chromatography Column |
References
- Optimum Bed Density (OBD) Columns: Enabling Technology for Laboratory-Scale Isolation and Purification. Waters White Paper 720001939EN 2006 Nov.
