Summary
Дрозофилы яички могут быть быстро и эффективно изолированы от взрослых мужчин использованием рассекает иглы. С практикой, нетрудно выделить в один или два дня количество яички достаточное для анализа ДНК или РНК, высокой пропускной последовательности или более традиционных методов молекулярной биологии или белка для антител или на основе ферментов анализов.
Abstract
Семенниках дрозофилы обеспечивают важной моделью для изучения стволовых обслуживание и дифференцировки клеток, мейоз, и сома-половых взаимодействий. Яичники, как правило, изолированы от взрослых самцов 0-3 дней после eclosion из куколки случае. Яички дикого типа мухи легко отличить от других тканей, потому что они желтые, но яички белого мутанта мухи, общий генетический фон для лабораторных экспериментов являются одинаковыми в обеих формы и цвета, чтобы лететь кишки. Выполнение рассечение на предметное стекло микроскопа стекло с черным фоном делает выявление яички значительно проще. Семенники удаляют из мухи использованием рассекает иглы. По сравнению с протоколами, которые используют пинцеты для вскрытия яичек, наш метод намного быстрее, что позволяет хорошо практикуется индивидуальный препарировать яички от 200-300 дикого типа мухи в час, что дает 400-600 яичек. Семенники из белых мух или из мутантов, которые уменьшают яички размером труднее анализировать и обычно дает 200-400 яички в час.
Protocol
- Сделать предметное стекло микроскопа с черным фоном: Cut 20 # белой бумаги такого же размера, как предметное стекло микроскопа. Цвет одну сторону слайд-формат бумаги черным, используя маркер (например, Шарпи). Применить белый клей (Элмер), чтобы черная сторона и придерживаться бумаги слайда. Слайд может быть использован повторно. Использование ¾ "ярлык ленты (Fisherbrand), безопасное стекло микроскопа, стекло вверх, к CO 2 летать площадку зафиксировать ее на месте.
- Сбор 0-3 дневных мух мужчины.
- Приготовьте ведро льда, фосфатно-солевом буфере (PBS), рассекая иглы.
- Анестезировать 50-100 мухи с помощью потока СО 2 и перевести их из бутылки или флакона, чтобы летать площадку возле предметное стекло.
- Внесите ~ 50 мкл ледяной PBS в капле в середине предметное стекло.
- Аккуратно подобрать мужской летать с иглой рассекает погружением рассекает иглу в PBS, нежное прикосновение брюшной стороне (т. е. вблизи крылья) из летать с иглы поместить его в каплю PBS.
- Положите одну иглу на середину лета, между грудной клетки и брюшной полости, снижая твердо. Место другие иглу между шестым (A6) и седьмой (А7) брюшных сегментов (второй и третьей полос снизу); тянуть живот от грудной клетки.
- Tease яички от других органов, особенно кишечника. Особенно в белом мутантов, яичек и кишечнике выглядят одинаково. Основные различия в том, что яички всегда идут парами, каждый яичко имеет спиральный узор и более белый цвет, чем кишечник.
- Магазин яички в ледяной PBS в трубке микроцентрифужных полипропилена.
Представитель Результаты:
Рисунок 1. Спинной зрения мужской репродуктивной системы, от flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase описание:... "После Рисунок 38 на странице 508 от Миллера (1950) А. Миллер внутренней анатомии и гистологии имаго дрозофилы В М. Оетегес, редактор, биологии дрозофилы, глава 6, стр. 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, факсимильное издание 1994 года. Copyright 1994 году Cold Spring Harbor Laboratory Press. Используется с любезного разрешения Cold Spring Harbor Laboratory (лаборатории Колд Спринг Харбор) Пресс. Смотрите http://www.cshlpress.com ".
Discussion
Мы предоставляем протокол, чтобы изолировать яички из взрослых мужчин дрозофилы. Потому что техника требует координации две свои руки, мастерство приходит только с практикой.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность Вася Вагин для внедрения этой методики в нашей лаборатории.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting needle | Tool | Fisher Scientific | S17346 | |
| Micro Slides, Plain | Tool | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Microscope Light | Tool | Schott AG | KO-1500 | |
| CO2 pad | Tool | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Benchtop Flowbuddy Complete System | Tool | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Bubble Humidifier | Tool | Salter Labs | 7100 | |
| Ball filler needle | Tool | Genesee Scientific | 54-119 | |
| ¾” Label Tape | Supply | Fisher Scientific | 15-901-5B |
References
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
