Summary
Drosophila melanogaster testiklar kan snabbt och effektivt isolerade från vuxna män använda dissekera nålar. Med övning kan man isolera sig lätt i en eller två dagar en mängd testiklar tillräcklig för analys av DNA eller RNA med hög kapacitet sekvensering eller mer traditionella molekylärbiologiska metoder eller protein för antikropps-eller enzym-baserade analyser.
Abstract
Testiklarna av Drosophila melanogaster ge en viktig modell för studiet av stamceller underhåll och differentiering, meios och soma-könsceller interaktioner. Testiklarna är oftast isolerade från vuxna män 0-3 dagar efter eclosion från PUPP-fallet. Testiklarna av vild-typ flugor kan lätt skiljas från andra vävnader, eftersom de är gula, men testiklarna vita muterade flugor, en gemensam genetisk bakgrund för laboratorieexperiment är liknande i både form och färg till den flyga tarmen. Utföra dissektion på ett glas objektglas med en svart bakgrund gör att identifiera testiklarna betydligt lättare. Testiklarna tas bort från flugorna med dissekera nålar. Jämfört med protokoll som använder pincett för testiklar dissektion, är vår metod mycket snabbare, vilket gör att en väl inövade individen att dissekera testiklarna 200 till 300 vildtyp flugor i timmen, vilket ger 400-600 testiklar. Testiklarna från vita flugor eller mutanter som minskar testiklarna storleken är svårare att dissekera och vanligtvis ger 200-400 testiklar per timme.
Protocol
- Gör ett bildspel glas mikroskop med en svart bakgrund: Klipp 20 # vitt papper i samma storlek som objektglas. Färg ena sidan av bilden-papper svart med en permanent spritpenna (t.ex. Sharpie). Tillsätt vitt lim (Elmer s) till den svarta sidan och hålla fast pappret på glaset. Bilden kan återanvändas. Använda ¾ "etikett band (Fisherbrand), säkra objektglas, glas uppåt till CO 2 flyga pad att fixa det på plats.
- Samla 0-3 dagar gammal hane flugor.
- Förbered en hink med is, fosfatbuffrad saltlösning (PBS), dissekera nålar.
- Bedöva 50-100 flyger med hjälp av en ström av CO 2 och överföra dem från flaska till flyga pad nära objektglas.
- Pipettera ~ 50 l iskallt PBS i en nedgång i mitten av objektglas.
- Försiktigt plocka upp en man flyga med dissekera nål-doppa dissekera nålen i PBS, lätt beröring den ventrala sida (dvs, nära vingar) av flyga med nål-placera den i droppe PBS.
- Sätt en nål i mitten av flugan, mellan bröstkorgen och buken, trycka ner ordentligt. Placera den andra nålen mellan sjätte (A6) och sjunde (A7) buken segment (andra och tredje ränder från botten), dra buken bort från bröstkorgen.
- Reta testiklarna från andra organ, särskilt tarmen. Särskilt i vitt mutanter, testiklar och tarm liknar. Viktiga skillnader är att alltid testiklarna kommit i par, varje testikel har ett spiralmönster och är mer vit i färgen än tarm.
- Förvara testiklarna i iskallt PBS i en polypropylen mikrocentrifugrör.
Representativa resultat:
Figur 1. Dorsal syn på det manliga reproduktiva systemet, från flybase.org/reports/FBim0000074.html. Flybase attribution:... "Efter Figur 38 A på sidan 508 från Miller (1950) A. Miller Den interna anatomi och histologi i imago av Drosophila melanogaster i M. Demerec, redaktör, Biology of Drosophila, kapitel 6, sidorna 420 - 534. Cold Spring Harbor Laboratory Press, faksimilutgåva, 1994. Copyright 1994 av Cold Spring Harbor Laboratory Press. Används med tillstånd från Cold Spring Harbor Laboratory (CSHL) Tryck på. Se http://www.cshlpress.com . "
Discussion
Vi erbjuder ett protokoll för att isolera testiklarna från vuxna handjur Drosophila melanogaster. Eftersom tekniken kräver att samordna sina två händer, kommer skicklighet bara med praktik.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar Vasia Vagin för att introducera denna teknik i vårt laboratorium.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissecting needle | Tool | Fisher Scientific | S17346 | |
| Micro Slides, Plain | Tool | Fisher Scientific | 12-553 | |
| Microscope Light | Tool | Schott AG | KO-1500 | |
| CO2 pad | Tool | Genesee Scientific | 59-172 | |
| Benchtop Flowbuddy Complete System | Tool | Genesee Scientific | 59-122WCU | |
| Bubble Humidifier | Tool | Salter Labs | 7100 | |
| Ball filler needle | Tool | Genesee Scientific | 54-119 | |
| ¾” Label Tape | Supply | Fisher Scientific | 15-901-5B |
References
- Singh, S. R., Hou, S. X. Immunohistological Techniques for Studying the Drosophila Male Germline Stem Cell. Methods Mol Biol. 450, 45-59 (2008).
