Summary
Ein Verfahren ist für die menschliche Retinoblastom Tumoren in Mäusen zu propagieren. Tumorzellen sind direkt in die Augen immungeschwächten Mäusen injiziert. Sekundäre Tumoren wurden erfolgreich etabliert mit beiden Zellen direkt aus humanen Tumoren und kultiviert tumorspheres geerntet.
Abstract
Die Kultivierung Retinoblastom Tumorzellen in definierten Stammzellen Medien entstehen primäre tumorspheres dass gewachsen und nur für eine begrenzte Zeit aufrechterhalten werden kann. Diese kultivierten tumorspheres kann zeigen deutlich unterschiedliche zelluläre Phänotypen, wenn die ursprüngliche Tumoren verglichen. Demonstration, dass kultivierte Zellen die Fähigkeit zur Bildung neuer Tumoren haben ist wichtig um sicherzustellen, dass kultivierte Zellen-Modell der Biologie des ursprünglichen Tumors.
Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Vermehrung menschlicher Retinoblastom Tumoren in vivo mit Rag2 - / - immungeschwächten Mäusen. Kultivierte humane Retinoblastom tumorspheres der niedrigen Passage oder Zellen aus frisch geernteten menschlichen Retinoblastom Tumor direkt in den Glaskörperraum des murinen Augen injiziert erhalten bilden Tumore innerhalb von 2-4 Wochen. Diese Tumoren können geerntet und entweder weiter in murine Augen in vivo passagiert oder gewachsen tumorspheres in vitro. Propagation wurde erfolgreich für mindestens drei Passagen wodurch eine ständige Quelle der menschlichen Retinoblastom Gewebe für weitere Experimente durchgeführt.
Wesley S. Bond und Lalita Wadhwa sind Co-Erstautoren.
Protocol
1. Vorbereitung der Retinoblastom tumorspheres
- Erhalten Retinoblastom Tumor Probe unter einem IRB-genehmigten Protokoll.
- Bereiten Sie frische definiert Stammzellen Medien (Neurobasal-A Media, 1x B-27 Ergänzung minus Vitamin A, 1X Nicht-essentielle Aminosäure-Lösung, 1x L-Glutamin, 20 ng / mL EGF, 10 ng / mL bFGF).
- Mechanisch disaggregate das Tumorgewebe mit einem Skalpell mit einem Querschnittsthema Technik in eine sterile, Gewebekultur-behandelten 6-Well-Platte. Sofort im 100 L definiert Stammzellen Medien, um das Gewebe und sanft verteilen das zerkleinerte Gewebe mit dem Skalpell. 5 ml definiert Stammzellen Medien zum Brunnen.
- Bei 37 ° C, 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator und inspizieren täglich. Einige tumorspheres sollte aus dem gestörten Tumorgewebe fast sofort entstehen, mit steigenden Zahlen im Laufe von 2-4 Tagen.
- Wöchentlich, Zentrifuge tumorspheres bei 300xg für 5 Minuten in frisch zubereiteten definiert Stammzellen Medien resuspendieren und Pipette nach oben und unten 10 mal größeren, zentral nekrotischen Bereichen zu stören und damit neue, gesunde Kugeln zu bilden.
2. Vorbereitung der Tumorzellen zur Injektion
- Sollte das Spritzen kultivierten tumorspheres vorsichtig pipet Kugeln in einem 15-mL konischen Rohr. Vorsichtig pipet oben und unten mit einer serologischen Pipette 10-15 Mal auf die Bereiche zu stören.
- Zählen Sie die Zellen injiziert mit einer Hämazytometer und aliquoten mindestens 50.000 Zellen pro Injektion in ein neues Röhrchen werden. Bereiten Sie sich auf so viele Injektionen wie möglich auf die Anzahl der Zellen Verfügung stehen.
- Zentrifuge bei 300xg für 5 Minuten. Vorsichtig absaugen den Überstand und resuspendieren in 5 ml PBS. Wiederholen Sie die Zentrifugation und Aspiration und resuspendieren in 10 ul PBS pro Injektion.
3. Vorbereitung der Tiere
- Mit einer Insulin-Spritze verabreichen eine intraperitoneale Injektion von Nagetier Anästhesie-Cocktail (Ketamin 37,6 mg / ml, 1,92 mg Xylazin / ml, Acepromazin 0,38 mg / mL) bei 1 mL pro Gramm Körpergewicht (GBW). Warten Sie 5 Minuten für das Tier zu werden sediert. Überprüfen Sie Herzschlag und Ort des Tieres auf einem Heizkissen. Halten Sie Tiere auf einem Heizkissen jederzeit bis zur Genesung.
- Nach Sedierung, verwalten 1 Tropfen Proparacain HCl auf dem rechten Auge. Ersetzen Tier auf Heizkissen und 1 Minute warten.
- Verwalten 1 Tropfen Phenylephrin HCI auf dem rechten Auge. Ersetzen Sie das Tier auf dem Heizkissen und 5 Minuten warten. Wenn Erweiterung der Pupille nicht aufgetreten ist, erneut zu verwalten 1 Tropfen und weitere 5 Minuten warten.
- Monitor auf Anzeichen von Bewegung oder Zuckungen, die bei> 30 Minuten nach der Sedierung auftreten können. Auf den ersten Anzeichen für eine Bewegung, zu verwalten 1 ul / GBW von Ketamin HCl (verdünnt auf 10 mg / mL in PBS) und 5 Minuten warten.
4. Die Injektion von Tumorzellen
- Setzen Sie den narkotisierten Tier unter dem Mikroskop auf seiner Seite, mit dem rechten Auge nach oben und mit dem Kopf auf Gaze und zentriert um eine rote Reflex des rechten Auges Fundus (Schüler sollten in dieser Zeit erweitert werden) zu erhalten, wenn durch das Mikroskop beobachtet .
- Prop bis die richtige Welt, indem Sie vorsichtig nach unten drücken gleichzeitig mit zwei Fingern auf den Augenlidern und halten Sie diese Position stetig für den Rest des Verfahrens.
- Mit einer sterilen 30-Gauge-Nadel an einem Luer-Lock-Spritze, die Welt durchdringen seitlich durch die Bindehaut und Sklera neben dem Limbus corneae im Bereich der Pars plana (Abb. 1) und nur durch die Aderhaut in den Glaskörperraum. Entfernen Sie die Nadel aus der Öffnung.
- Sterilisieren Hamilton Nadel mit einem Alkoholtupfer. Zeichnen Sie die Zellsuspension in die Hamilton-Spritze und die Nadel in die Öffnung, bis die Nadel wird visualisiert durch das Mikroskop hinter der Linse in den Glaskörper in der Nähe der Netzhaut. Mit Hilfe einer zweiten Person, während die Nadel ständig in dieser Position, drücken Sie den Kolben langsam. Entfernen Sie die Nadel. Falls erforderlich, verwenden Sie ein Wattestäbchen keine Flüssigkeit aus der Öffnung zu absorbieren.
- Vorsichtig den Druck aus den Augenlidern, die Maus Augenlider zu schließen.
- Verwalten 1 Tropfen Hypromellose für jedes Auge und kehren Tier Heizkissen für die Verwertung.
5. Die Überwachung der injizierten Mäusen und Ernte von Tumoren
- Täglich prüfen die injizierten Auge für Leukokorie (weiß papillären Reflex) und / oder periokuläre Ausdehnung, die in der Regel zeigt sich 2-4 Wochen nach der Injektion.
- Sobald das Tumorwachstum festgestellt wird, Tier nach den Richtlinien des Instituts einschläfern.
- Wenn das Auge des Tumors durch die Augenlider bedeckt sind, verwenden Sie das Skalpell zu zwei Schnitte senkrecht auf die Lidspalte zu machen und heben Sie die Hautlappen.
- Unter Visualisierung mit dem Stereomikroskop, einen umlaufenden Schnitt am Limbus, Entfernen der Hornhaut und der Linse, und sorgfältig zu sezieren den Großteil der Tumormasse von den anderen Geweben mit tweeGefriergeräte. Ort des Tumors in sterile RPMI-1640-Medien.
- Sie mit einer Pinzette langsam ziehen die offene Welt aus der Steckdose. Um zu gewährleisten, eine angehängte Sehnerv so Tumorinvasion visualisiert werden können, ziehen Sie den Globus, bis der Nerv freigelegt und mit einer Schere auf die Nerven so lange wie möglich schneiden. Legen Sie in 10% Formalin für regelmäßige Verarbeitung zur histologischen Untersuchung.
6. Repräsentative Ergebnisse:
Retinoblastoma tumorspheres beginnen, aus dem disaggregierten Gewebe fast sofort, als sie befreit von der Tumormasse sind, erscheinen. Innerhalb von 2-4 Tagen werden mehr tumorspheres beginnt sich zu bilden und an Größe zunehmen. Die Kugeln sind in der Regel regelmäßig und zeigen eine gut definierte, sekundäre Membran umgibt das Aggregat (Abbildung 2).
Das Tier in der Regel präsentiert mit Leukokorie innerhalb von 4 Wochen nach der Injektion (Abbildung 3b), gefolgt von der Erweiterung des Erdballs und Dehnung der umgebenden Gewebe 5-8 Wochen nach der Injektion wie der Tumor wächst (Abbildung 3c).
Abbildung 1. Querschnittsdiagramm der Maus Auge Hervorhebung Features in das Protokoll verwiesen.
Abbildung 2. Culture menschlichen Retinoblastom-Zellen in vitro abgebildet bei a) 4x, und b) 10-fach Objektiv Vergrößerung. Retinoblastoma primären Tumorzellen produzieren tumorspheres mit einem regelmäßigen Sphäroid Form und eine knusprige äußere Membran. Scale-Balken stellen a) 500 um, und b) 200 um.
Abbildung 3 Eye of Rag2 -. / - Maus zeigt a) normale Funktionen, b) Leukokorie Hinweis auf eine Tumormasse in Glaskörperraum und c) eine große Tumormasse Füllung um den Globus mit zugehörigen periokuläre Blähungen, intraokularen Blutungen.
Discussion
Die Technik hier beschriebenen erleichtert die Ausbreitung Retinoblastom Tumoren in ihren intraokularen, intravitreale Milieu. Die intraokulare Injektion Technik hat in der Vergangenheit verwendet, um Tumore aus Retinoblastom-Zelllinien 1 sowie die virale Vektoren für die Gentherapie intraokularen 2,3 liefern zu schaffen. Diese Technik wurde inzwischen erfolgreich genutzt, um Menschen Retinoblastom Tumoren durch direkte Injektion von Zellen aus dem Primärtumor und Injektion von tumorspheres sowie serielle Ausbreitung von Xenograft zu produzieren. Sichtbares Zeichen der Tumorbildung (in der Regel Leukokorie) ist in der Regel zunächst innerhalb von 4 Wochen darauf hingewiesen, nach der intraokularen Blutungen und Ausdehnung des Globus und / oder Gewebe um die Umlaufbahn innerhalb von 5-8 Wochen entwickeln. Eine Minderheit der injizierten Mäusen verletzen das injizierte Auge, was zu einer endgültigen Schließung der Augenlider. In diesen Fällen ist Ausdehnung das einzige Zeichen der Tumorbildung.
Gründung der murinen Xenograft nicht erfolgreich mit allen menschlichen Retinoblastom Tumoren, obwohl Ausbreitung von etablierten Xenograft ist höchst erfolgreich. Diese Beobachtung legt nahe, dass bestimmte Eigenschaften des Primärtumors, wie Invasivität und Ausmaß der Differenzierung oder eine andere unbekannte Faktor, kann Einfluss auf die Fähigkeit dieser Tumoren in der Maus-Okular Umwelt belasten.
Die Menge des Gewebes, die von einem menschlichen Retinoblastom Tumor erworben werden können, ist recht klein, und es bestehen erhebliche Einschränkungen auf die Fähigkeit zur Kultur menschlichen Retinoblastom-Zellen in vitro wie begrenzte Lebensdauer, Verlust von soliden Tumoren Gewebe sowie Veränderungen in der zellulären Phänotyp. Dieses Protokoll bietet eine relativ einfache Art und Weise auf den menschlichen Tumor ausbreiten und einen Maus-Modell der menschlichen Erkrankung. Dies erlaubt eine weitere in vitro und in vivo Experimente der Biologie der Retinoblastom und längere Wartungsintervalle der Tumor außerhalb des Patienten.
Disclosures
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von der Baylor College of Medicine IACUC Ausschusses durchgeführt.
Acknowledgments
Die Finanzierung für dieses Projekt wird von der Clayton-Stiftung für Forschung und die Retina Research Foundation zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phenylephrine HCl 2.5% | Bausch and Lomb | 053-11 | Ophthalmic solution |
| 30-ga Needle | BD Biosciences | 305128 | Regular bevel |
| 10-mL Luer-Lock Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| 3/10-cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 328431 | |
| Alcohol swabs | BD Biosciences | 326895 | |
| 6-Well Plate, Tissue Culture-Treated | BD Biosciences | 353046 | |
| Proparacaine HCl 0.5% | Butler Animal Health Supply | 017239 | Ophthalmic solution |
| Ketamine HCl 100mg/mL | Fort Dodge Animal Health | 4402A | |
| 10-μL Hamilton Syringe | Hamilton Co | 7648-01 | |
| 32-ga Hamilton Needle | Hamilton Co | 7803-04 | Custom length - 0.5" |
| Neurobasal-A Media | Invitrogen | 10888-022 | |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A, 50X | Invitrogen | 12587-010 | |
| RPMI-1640 Media | Mediatech, Inc. | 10-040-CV | |
| Non-essential Amino Acid Solution, 100X | Mediatech, Inc. | 25-025-CI | |
| L-Glutamine, 100X | Mediatech, Inc. | 25-005-CI | |
| Disposable #11 Scalpel | Miltex Inc. | 4-411 | |
| Rodent Anesthesia Combo | N/A | n/a | In-house pharmacy formulation (ketamine 37.6 mg/mL, xylazine 1.92 mg/mL, acepromazine 0.38 mg/mL) |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Stem Cell Technologies | 02633 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Stem Cell Technologies | 02634 | Reconstitute at 10 μg/mL stock solution |
| OMS-75 Operation Microscope | Topcon Medical Systems | OMS-75 | This model has been discontinued |
| 10% Formalin | VWR international | 95042-908 |
References
- Chèvez-Barrios, P. Metastatic and Nonmetastatic Models of Retinoblastoma. Am. J. Pathol. 157, 1405-1412 (2000).
- Suber, M. L., Hurwitz, M. Y., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Immune consequences of intraocular administration of modified adenoviral vectors. Hum. Gene Ther. 12, 833-838 (2001).
- Mallam, J. N., Hurwitz, M. Y., Mahoney, T., Chèvez-Barrios, P., Hurwitz, R. L. Efficient Gene Transfer into Retinal Cells Using Adenoviral Vectors: Dependence on Receptor Expression. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 1680-1687 (2004).
