Summary
我们展示了染色质免疫沉淀（ChIP）的方法来识别组织特异性基因表达的组织特异性基因的小鼠胚胎组织中的发病因素相互作用期间或之后。此协议应广泛适用的组织特异性基因的激活的研究，因为它在正常胚胎发育过程中发生。
Abstract
染色质免疫沉淀（ChIP）是一个强大的工具，以确定蛋白质：发生在活细胞的情况下1-3的染色质相互作用。这项技术已被广泛利用组织培养细胞中，并在较小程度上，在基层组织。啮齿类动物的胚胎组织，特别是在发展的早期，芯片的应用，是由组织的数量有限，异质性的胚胎细胞和组织类型复杂。在这里，我们提出了一种方法来执行芯片采用一个分离的胚胎每天8.5（E8.5）胚胎。剪切从单一E8.5胚胎的染色质可分为五个等份，它允许为控制和特定蛋白质的调查研究者足够的材料：染色质相互作用。
我们已经利用这种技术来开始：在组织特异性基因表达程序的规范文件蛋白质染色质相互作用。类型的细胞在胚胎的异质性必然限制了这项技术的应用，因为其结果是不区分的相互作用是否发生在所有检测的蛋白质：染色质相互作用的一个子集，或一个单一的细胞类型（S）。然而，考试期间或之后的组织特异性基因的组织特异性的基因表达发病原因有两个可行的。首先，一定免疫组织特定的因素隔离开来表达的细胞类型，其中的因素是染色质。其次，含有基因激活相关的翻译后修改的共激活因子和组蛋白的免疫应该只被发现在基因的细胞类型的基因和基因调控序列，或已被激活。这项技术应该适用于大多数组织特异性基因的激活事件的研究。
在这个例子中所述，我们利用E8.5和E9.5小鼠胚胎的研究在骨骼肌特定基因的启动子具有约束力的因素。体节，躯干和四肢骨骼肌肉就会形成易制毒化学组织，目前在E8.5 - 9.5 4,5。肌细胞生成素是一种调节因子骨骼肌分化6-9所需。数据表明，肌细胞生成素是与它自己的启动子在E8.5和E9.5胚胎。由于肌细胞生成素只在体节在这个发展的6,10阶段表示，数据表明，肌细胞生成素的相互作用与它自己的启动已经发生E8.5胚胎骨骼肌中的前体细胞。
Protocol
1。胚胎隔离
注 ：所有涉及小鼠的操作，应当按照相应的动物护理和使用的政策和协议执行
- 检查雌性小鼠交配塞存在交配后的上午，他们放置在不同的笼子分开根根男性的交配女性。交配塞观察的一天中午，被认为是发展的0.5天（E0.5）胚胎。
- 在E8.5，（或所需的阶段，如果有不同的），牺牲鼠标使用经批准的协议。
- 湿安乐死动物用70％乙醇的腹部，打开腹腔。植入网站，说明胚胎发育的存在被看作是沿每个子宫角（图1A）的长度“上一个珠子串”安排。用剪刀，删除这两个子宫角，削减每个着床部位单独分开（图1B），并放置在100毫米培养皿含有室温（RT）菜夹层培养基（DMEM培养液，10％胎牛血清，20毫米的HEPES pH值7.4 60微克/ ml青霉素，链霉素2毫米）。
- 使用镊子，取出每个胚胎从子宫组织（图1C）和周围的膜，并放置在新鲜剥离液。
- 在解剖显微镜使用镊子下分离单个胚胎。在这个发展阶段，胚胎被包围在壁层卵黄囊，其中接触deciduum组织，卵黄囊和羊膜。羊膜是一种透明膜，在胚胎的直接接触。位于之间的羊膜和顶叶卵黄囊卵黄囊和存在突出的血管，培育胚胎在E8.5 - E9.5胚胎很容易分辨。删除从每个胚胎及其周围的膜和含有夹层的媒体，以除去多余的血液进入一个新的板块单独转让。发育阶段，可以从胚胎到胚胎和窝之间不同;代表E8.5胚胎和一个代表E9.5胚胎图1D所示。
- 每个胚胎转移到1.5 ml的Eppendorf管中含有200μL的夹层媒体（上述步骤4中所描述）。
2。同质化隔离胚胎
- 胶原酶II型20个单位在一个体积为200 UL（Dubbecco 1X的磷酸盐缓冲盐水; DPBS）添加到每个Eppendorf管。
- 轻轻摇动20分钟100转的样品在37℃摇床。
- 重悬以及吹打扰乱细胞的团块。
- 应用细胞悬液，在无菌细胞过滤器放置在1.5 mL Eppendorf管（网目尺寸40微米）的顶部。
- 立即申请600μL室温1X细胞过滤器的顶部DPBS，以完成分离。丢弃的过滤器。
- 离心样品在4 ° C在4000 XG为5分钟。
- 上清液。
- 1毫升RT 1X DPBS重悬沉淀。
- 离心机的样品在室温下1分钟在4000 XG。
- 上清液。
- 200μLRT清扫媒体的重悬沉淀。
- 胚胎干细胞的计数。平均3-5 × 10 6 cells/E8.5胚胎。
3。交叉连结染色质
- 添加5.6μL，37％的甲醛终浓度为1％甲醛200μL样品。
- 孵育样品在室温下10分钟。
- 在4 ° C在4000 XG 3分钟离心样品。
- 上清液。
- 重悬的细胞用冷1X含有80μL/毫升的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒（PIC）的DPBS。
- 离心样品在4 ° C在4000 XG为3分钟。
- 上清液。在这一步，样品可冷冻于-80 ° C。数个月的冻结，交联样品是稳定的。
4。超声
- 细胞沉淀重悬于100μL的RT SDS裂解液（50毫米的Tris - HCl（pH值8.1），10毫米EDTA和1％SDS刚加入1μLPIC/800μL总体积PIC）。当重悬，添加额外的100 UL RT SDS裂解液促进再悬浮。吹打和反演混合。
- 孵育细胞悬液，冰浴10分钟。
- 超声裂解细胞剪切DNA之间的200和500碱基对使用Diagenode Bioruptor™UCD200（5分钟× 8倍幅度设置为30秒on/30秒高（320瓦）功率）。样品应被包围的冰浆。不要让样品温4 ° C以上或冻结。 sonicators提供有多种类型。超声条件下，应优化每个sonicator导致交联的DNA剪切长度约500 bp的。
- 离心机超声样品在4 ° C时10分钟XG 14000。
- Transfer上清液到一个新的Eppendorf管中，在冰上预冷。
- 超声样品分成5等份的最大。我们有经验确定一个E8.5胚胎可分为5等份。较小或较大的样本量可以相应地调整。在这一步，样品可存放于-80 ° C，直到进一步的使用。
- 保留一个等份作为输入，并储存在-20 ° C时，直到第6步交叉链接将得到扭转。淡化其他等分芯片缓冲液稀释（16.7毫米的Tris - HCl（pH值8.1），1.2毫米EDTA，1.1％Triton X - 100的的，167毫米NaCl和0.01％SDS）的10倍，含有1μl/800刚添加的PIC μL缓冲。
5。预结算和免疫
- 预清除鲑鱼精子DNA /蛋白A或G琼脂糖- 50％的浆料在4 ° C，旋转，1小时与75μL稀释上清。任应确定要使用的芯片的抗体A或蛋白G珠蛋白使用。例如，建议兔抗体蛋白A珠，而G蛋白珠山羊抗体或鼠IgG抗体的建议。如需详细资讯，请参阅珠制造商提出的建议。
- 在4 ° C离心1分钟，2500 XG。
- 将上清转移至一个新的，预冷的Eppendorf管。
- 加入抗体（4微克/样品）前清除等分，并在4℃孵育过夜旋转彗星。
6。洗衣机的染色质蛋白珠复合物
- 添加到每个小瓶和孵化在4 ° C旋转1小时60μL鲑鱼精DNA /蛋白质A或G琼脂糖浆。使用相同的珠型，用于在上述步骤3预结算。
- 在4 ° C离心1分钟1000 XG。
- 小心取出上清液并丢弃。置于冰上的DNA -蛋白质珠复合物。
- 重悬和洗的颗粒直接与下面的洗缓冲区1，2，3，和4。洗缓冲区1-3应冷却到4 ° C和这些缓冲区清洗应表现在4 ° C。洗缓冲液4，应在室温和与此缓冲区清洗应在室温下进行。每次清洗是在适当的温度为5分钟旋转。每次洗，在4 ° C在1000 XG 1分钟（室温缓冲液洗4清洗）离心，然后小心地吸去或去除上清。
缓冲器1：低盐缓冲液洗（20毫米的Tris - HCl（pH值8.1），2毫米EDTA，1％的Triton X - 100，
150毫米NaCl和0.1％SDS），1毫升× 2洗。
缓冲区2：高盐缓冲液洗（20毫米的Tris - HCl（pH值8.1），2毫米EDTA，1％的Triton X - 100，
500毫米NaCl和0.1％SDS），1毫升× 2洗。
缓冲区3：氯化锂盐缓冲液洗（10毫米的Tris - HCl（pH值8.1），1 mM的EDTA，1％IGEPAL - CA630，
0.25米LiCl和1％去氧胆酸（钠）），1毫升x 1洗。
缓冲区4：TE缓冲液（10毫米的Tris - HCl（pH值8.1），1毫米EDTA），1毫升x 2洗。
7。染色质抗体复合物的洗脱
- 重悬于250μL新鲜配制洗脱缓冲液（1％SDS，0.1 M的碳酸氢钠3）洗过的染色质蛋白珠复杂。大力涡样本为5秒，然后在室温下孵育15分钟旋转。
- 离心机在2500 XG在室温下1分钟，并转移到一个新的Eppendorf管中的洗脱液。
- 重复步骤1和2，并结合在同一个Eppendorf管中的洗脱液。洗脱液应在室温下保存。这一步完成后，洗脱液可以储存在-20 ° C，直到进一步利用。
8。反向交叉链接和恢复DNA
- 500μL洗脱液（40μL/毫升输入控制），加入20μL5 M氯化钠。
- 热洗脱液在65℃为4小时至过夜水浴。
- 10μL每个样本（包括输入控制），可以运行在2％琼脂糖凝胶跨越0.1至1 KBP检查的DNA片段大小的尺寸标记。 DNA会出现一抹黑，而不是一个尖锐的乐队。其余的样本，可以留在65 ° C，而凝胶运行。
- 恢复使用QIAquick凝胶提取试剂盒（QIAGEN）从每个样品中的DNA。加入600μLQG缓冲液（试剂盒中提供），以优化的DNA吸附在QIAquick离心柱和200μL到500μL样品异丙醇的硅膜。请注意该资历组别的缓冲区中包含允许容易测定样品的pH值pH值指标。如果样品的颜色从黄色到紫色圈（pH值> 7.5），混匀后，加10μL3米NaAcetate（pH值5.2）的样品和混合。这降低了混合物的pH值，以最大限度地列珠的DNA结合。
- 装货前列，检查，以确定是否存在任何SDS沉淀的混合物。如果SDS的降水发生，样品应在回暖42℃的热水洗澡，直到沉淀消失。
- QIAquick自旋列（工具包中的紫色列）装入700μl和混合物在室温下离心1分钟，在14000 XG。通过从列在出发前的流量丢弃，其余样品重复此步骤。
- 加入500μlQG缓冲液洗柱。在室温下离心2分钟，在14000 XG。丢弃的流量通过从列在出发前。
- PE洗涤缓冲液700μL（工具包中的提供），已加入乙醇制造商的指示清洗之列。在室温下离心1分钟，在14000 XG。丢弃的流量通过从列在出发前。
- 重复离心步骤完全删除列的PE缓冲区的其余部分。放弃通过流量和收集管。
- 洗脱的DNA从列到一个新的Eppendorf管中，加入60μL的EB缓冲液（洗脱缓冲液试剂盒中提供）。
- 在室温下离心1分钟，在14000 XG。洗脱下的DNA可以存储在-20 ° C，直到检测。回收的材料260读数通常表明浓度为90-120毫微克/ UL，总回收率为〜6-7微克每等份。然而，一个260/280这些样本的比例通常> 1.8，表明RNA样品中。因此，回收DNA的确切数额可能会更低。
9。回收DNA分析
- SDS会干扰PCR Taq DNA聚合酶的活性。 SDS应完全去除，然后才进行PCR扩增。孵化在冰上的DNA沉淀1分钟，在14000 XG 4任何残留的SDS和离心机° C。强烈建议将上清转移至一个新的Eppendorf tube.This一步。
- 通过常规PCR和实时定量PCR（Q - PCR）与具体每一个要分析的序列的引物可检测的DNA洗脱液。 5-10μL总DNA洗脱液可用于PCR和Q - PCR反应。 PCR与输入控制可以进行5-10倍稀释的DNA与其他样本量相比。 PCR和Q - PCR条件会有所不同，但是，起始原料的数量有限，需要更多的PCR循环。对于常规的PCR检测，我们建议开始，40个循环，调整需要。
10。代表性的成果
我们已经用这个协议来执行E8.5和E9.5胚胎（图2）芯片。结果表明，肌细胞生成素是在E8.5和E9.5胚胎肌细胞生成素推动者。 CHIP纯化的DNA进行了分析常规PCR（图2A）和实时定量PCR（图2B）。与此相反，有没有卵黄囊，不表达肌细胞生成素在肌细胞生成素促进肌细胞生成素的指示结合。干扰素-γ（IFNγ）发起人，其中包含了肌细胞生成素的结合位点匹配的序列，是作为一个负序控制使用。正如预期的那样，肌细胞生成素，不一定要在任何组织测试样本IFNγ的发起人。在E8.5和9.5的胚胎中，肌细胞生成素是具体 表现在体节（图3，6,10），这是骨骼肌的前体。因此，结果表明，肌细胞生成素是必然要在体节肌细胞生成素在E8.5和E9.5推动者。
图1。E8.5胚胎清扫。 （一）离体子宫角（顶部面板在下部面板上显示更高的放大倍率）。 （二）子宫角用剪刀剪开，以单独的个体包含单个胚胎植入网站。 （三）从子宫组织在清扫胚胎突起。箭头标志仍然受到额外的胚胎组织覆盖的胚胎。 （d）两个E8.5胚胎来自同一窝。左边的胚胎还没有开始转动的过程中。在右边的胚胎正处于转折点。极右 - 代表E9.5胚胎。
图2的ChIP实验证明E8.5和E9.5胚胎肌细胞生成素促进肌细胞生成素具有约束力。 （上）常规5 UL使用一个肌细胞生成抗体的非特异性IgG抗体放大肌细胞生成素启动子的部分，从-79到69相对的转录起始位点的引物进行芯片实验的DNA纯化，PCR分析包含了肌细胞生成素的结合位点，位于-12或引物扩增IFNγ的发起人，其中包含一个序列匹配的肌细胞生成素的结合位点，位于〜1075 bp的转录起始位点上游的部分。 IFNγ的引物序列5' - GCT GAC TCA AGA CCC认证CGA GGC - 3'和5' - TGA GGA TGG GGC AGG AGG的CC - 3'。 （下）实时定量PCR分析（一）使用相同的样本。 “数据绘制成输入+ / - 标准差％。
图3。肌细胞生成素，特别是在E8.5和E9.5胚胎的体节表示。肌细胞生成素原位杂交整装显示特定的mRNA的表达在体节。 E8.5形象 - 200微米的大小酒吧。 E9.5形象 - 500微米的大小酒吧。
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Discussion
在所描述的芯片协议，我们将展示生肌调节肌细胞生成素是在骨骼肌易制毒化学组织目前在单E8.5和E9.5胚胎肌细胞生成素推动者。此前的研究已经广泛的特点肌细胞生成素E盒含序列的结合，从最初在体外凝胶迁移实验利用体外翻译或细菌产生的肌细胞生成素和放射性标记的DNA编码的靶基因序列11-20监管的相关部分。传统的芯片研究已经证明了肌细胞生成素具有约束力的组织文化模型肌肉发生 21-24肌细胞生成素促进。然而，没有任何证据表明，肌细胞生成素结合到肌细胞生成素启动子在胚胎骨骼肌肉的发育，但可以预测这是在胚胎发育的情况下后E15.5舌组织中观察到肌细胞生成素的肌细胞生成素的表达下调的基础上25缺陷小鼠。因此，数据提供的证据表明，肌细胞生成素和肌细胞生成素的启动子相互作用之间的相互作用发生在体内。这种技术的一个明显的应用是使用它来验证相关的事先研究的生理特征组织特异性基因的激活组织进行培养模型。更有趣的应用程序是作为一个新的或以前未知的因素，以确定一个特定的互动之前进行组织培养研究设计了解功能mechanisms.The协议的生理意义的初步鉴定的一部分使用这种技术也可以用来直接比较蛋白质：染色质相互作用发生在小鼠模型中包含一个精心设计的基因操纵的具体的发展阶段。
我们预计，这种方法也可用于在开发过程中的组织特异性基因表达调控的时间，当然研究的有用。通过评估具体的因素：在不同的胚胎阶段的染色质相互作用，人们可以识别的因素相互作用的第一次出现的时间点，可以决定是否分化过程中保持和超越的互动，或者是暂时性的，并能确定如果一个特定的序列与多种因素互动因子结合的顺序。最后，我们设想，该协议可以扩大到重新芯片程序 26，即从一个免疫恢复染色质是第二次免疫抗体对不同的因素，认为是共同占用同一块染色质。重新芯片协议提供更确凿的证据表明，两种截然不同的因素是相同的染色质上，这种修改可能要求将起始材料的量的增加。
一个显着的实现，从我们的努力来为起始原料的数量有限，不是成功的障碍，有可能预测，特别是考虑到组织培养细胞的协议通常会建议的百万或几千万的同质人口开始细胞26,27。我们努力的成功，说明主（而且往往无法控制的）能够抗体的免疫因素正在调查的具体要求。一旦抗体是免疫能力鉴定，调查人员可以优化芯片检测滴定使用的抗体量。重要的是要注意，更多的是并不总是更好，我们经常发现，特别是与样品数量有限，在更高的背景无关序列的结合的结果，太多的抗体，。此外，使用免疫球蛋白组分或亲和纯化抗体，导致往往在较低的背景下，比不使用抗血清。从控制抗体的背景，往往可以衡量包括一个样本含珠没有任何抗体。
我们得出结论，使用蛋白芯片分析的早期阶段的胚胎组织特异性基因的激活过程中出现的染色质相互作用，直接在发展方面的潜在的诱导和组织特异性基因表达程序的维护提供了重要的洞察力。
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Disclosures
在马萨诸塞州医学院IACUC大学规定的准则和法规的规定进行动物实验。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院R01 GM56244安仁，其中包括通过美国复苏与再投资法“，2009年授予的资金支持，由美国国立卫生研究院R01 GM87130 JARP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ChIP Assay Kit | Upstate, Millipore | 17-295 | |
| Collagenase Type II | Invitrogen | 17101015 | Dilution by 1 x PBS |
| Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) | GIBCO, by Life Technologies | 12100-061 | High glucose content |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline 1X (DPBS) | GIBCO, by Life Technologies | 14190-144 | Calcium chloride free, Magnesium chloride free |
| Fetal bovine serum (FBS) | Mediatech, Inc. | 35-010-CV | |
| Gel extraction kit | QIAquick | 28704 | 50 reaction kit |
| Penicillin/streptomycin stock solution | GIBCO, by Life Technologies | 5000 μg/ml concentration | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | |
| Salmon sperm DNA /Protein A agarose | EMD Millipore | 16-157 | |
| myogenin antibody | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-576 | |
| Normal rabbit IgG | EMD Millipore | 12-370 | |
| Platinum PCR Supermix | Invitrogen | 11306-016 | |
| GoTaq Q-PCR master mix | Promega Corp. | A6001 |
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